一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法及其应用。

背景技术

cGAS-STING信号通路(天然免疫信号通路)的激活能够释放I型干扰素，诱导T细胞(又名T淋巴细胞)产生，进而发挥抗肿瘤免疫反应。然而，激活cGAS-STING信号通路会诱导肿瘤细胞表面高表达PD-L1(细胞程序性死亡-配体1，Programmed cell death 1ligand1)。这将与T细胞表面的PD-1结合，从而导致T细胞的功能障碍和耗竭。因此，激活cGAS-STING信号通路联合阻断PD-1/PD-L1轴的策略，有望达到更强大的抗肿瘤免疫治疗效果。

黑色素纳米粒是由黑色素制备得到的小粒径纳米粒子。其具有酚羟基和氨基可以络合锰等金属离子，这可以有效地激活cGAS-STING信号通路。然而，小粒径的黑色素纳米粒尽管具有较高的肿瘤渗透性，但是其可能回流到血液循环中或扩散到周围组织，导致肿瘤积累不足。针对此，对黑色素纳米粒进行羧基化修饰，并通过酰胺化反应修饰多肽链(Ala-Ala-Asn-Cys-Lys)和2-氰基-6-氨基苯并噻唑，得到功能化的黑色素纳米体系。在legumain酶(半胱氨酸蛋白酶)的作用下，该体系中的多肽链暴露出氨基和巯基，可与2-氰基-6-氨基苯并噻唑上的游离氰基发生点击环加成反应，实现粒径由小变大、阻止功能化黑色素纳米粒回流入血，从而提高纳米制剂在肿瘤部位滞留效应的目的。

为了实现在肿瘤部位有效蓄积及有效阻断PD-1/PD-L1信号轴，将功能化黑色素纳米体系黏附在导入PD-1或PD-L1质粒的大肠杆菌表面，得到激活cGAS-STING信号通路并阻断PD-1/PD-L1轴的纳米复合物。由于大肠杆菌的乏氧靶向性，纳米复合物聚集在肿瘤部位。随着菌的生长，功能化的黑色素纳米体系脱落，并在legumain酶的作用下聚集成大粒子形成金属储库。在肿瘤微环境中，功能化的黑色素纳米体系释放出金属离子，激活cGAS-STING信号通路。同时，在808nm激光器照射下，由于黑色素纳米粒的光热转换作用，肿瘤部位的温度升至42℃，从而诱导大肠杆菌分泌PD-1或PD-L1。这将阻断PD-1/PD-L1轴，逆转T细胞的耗竭。因此，研究一种激活cGAS-STING信号通路并逆转T细胞耗竭的工程菌负载功能化黑色素纳米体系的复合物具有极大的价值和意义。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法及其应用，可有效解决激活STING通路，逆转T细胞耗竭，提高肿瘤免疫治疗效果，保证癌症治疗用药效果的问题。

本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法，将黑色素制备成黑色素纳米粒，并通过硫代苹果酸反应形成羧基化的黑色素纳米粒，通过酰胺化反应在黑色素纳米粒的羧基端分别修饰多肽链和2-氰基-6-氨基-苯并噻唑，再通过金属络合作用将金属离子络合在功能化黑色素纳米粒表面，最后利用黏附作用将功能化黑色素纳米体系黏附在工程化大肠杆菌表面，得到工程菌负载功能化黑色素纳米体系的复合物；具体包括以下步骤：

(1)、制备黑色素纳米粒(MNP)：取黑色素5-12mg溶于的0.1mol/L氢氧化钠5-10mL中，冰浴超声0.5h；加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH为6.5-7.5，用MWCO为2500Da的透析袋透析6h，冻干，得黑色素纳米粒，粒径为20nm～60nm；

(2)、制备羧基化的黑色素纳米粒：取步骤(1)中的5-12mg黑色素纳米粒溶于8-10mL溶剂中，加入6-8mg硫代苹果酸，室温(18-25℃，以下同)下搅拌6-8h，用MWCO为12000Da的透析袋透析48h，冻干，得羧基化的黑色素纳米粒；

所述溶剂为超纯水、pH7.4的PBS缓冲液、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液中的一种(以下同)；

(3)、制备多肽链修饰的黑色素纳米粒(MNP-pep)：称取步骤(2)中的8-12mg羧基化的黑色素纳米粒溶于溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺8-12mg，N-羟基琥珀酰亚胺6-10mg，室温下避光搅拌3-5h，加入多肽链5-9mg，加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5-8.0，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干后得到多肽链修饰的黑色素纳米粒；

所述的多肽链为含有Ala-Ala-Asn-Cys-Lys(丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-赖氨酸)序列的多肽链；

(4)、制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒(MNP-CABT)：称取8-12mg羧基化的黑色素纳米粒溶于溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺8-12mg，N-羟基琥珀酰亚胺6-10mg，室温下避光搅拌3-5h，称取2-氰基-6-氨基-苯并噻唑3-7mg溶于溶剂中，加入反应体系中，加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH至7.5-8.0，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

(5)、制备负载金属离子的黑色素纳米粒(MNP-p&C@Mn)：称取步骤(3)下的多肽链修饰的黑色素纳米粒8-12mg，金属盐1.0-2.5mg分别溶于溶剂中，通过超声使其溶解，两者混合均匀后40℃下反应1h，然后装入MWCO为12000Da的透析袋透析48h，得到负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒；

制备负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(4)下的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒8-12mg，金属盐1.0-2.5mg分别溶于溶剂中，通过超声使其溶解，两者混合均匀后40℃下反应1h，然后装入MWCO为12000Da的透析袋透析48h，得到负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

所述金属离子为锰离子、锌离子中的一种；

(6)、制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物(MNP-p&C@Mn-BP)：称取步骤(5)的负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒0.5-2mg、或负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒0.5-2mg分散于0.5-2mL的溶剂中，再加入0.5-1.5mL工程化的大肠杆菌Tris-HCl缓冲液10

所述工程化的大肠杆菌为导入PD-1、PD-L1质粒工程菌中的一种。

所述方法制备的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物在制备抗肿瘤药物注射剂中的应用。

所述方法制备的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物在制备增强cGAS-STING免疫信号通路药物中的应用。

所述方法制备的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物在制备基于光热敏感、Legumain酶响应性粒径转变的黑色素纳米粒肿瘤微环境药物中的应用。

所述方法制备的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明操作方便，方法稳定可靠，所制得的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物生物相容性好、滞留时间长。在肿瘤治疗方面可发挥靶向肿瘤、激活cGAS-STING通路，阻断PD-1/PD-L1轴，逆转T细胞耗竭等多重功效，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。

附图说明

图1为本发明纳米体系复合物透射电子显微镜图。

图2为本发明纳米体系复合物激光照射下光热转换能力曲线图。

图3为本发明纳米体系复合物ELISA试剂盒检测PD-L1的分泌量。

图4为本发明纳米体系复合物与MNP-pep、MNP-CABT、MNP-pep+MNP-CABT孵育后粒径曲线图。

图5为本发明纳米体系复合物在荷瘤小鼠及离体中的组织分布图。

图6为本发明纳米体系复合物在体内肿瘤组织中滞留时间示意图(A:MNP-p&C@Mn；B:MNP-p&C@Mn-BP)。

图7为本发明纳米体系复合物通过westernblot技术检测肿瘤组织中cGAS-STING相关蛋白的表达图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中可由以下实施例给出。

实施例1

本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)、制备黑色素纳米粒：取黑色素5mg溶于的0.1mol/L氢氧化钠5mL中，冰浴超声0.5h；加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH为6.5，用MWCO为2500Da的透析袋透析6h，冻干，得黑色素纳米粒；

(2)、制备羧基化的黑色素纳米粒：取步骤(1)中的5mg黑色素纳米粒溶于8mL溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入6mg硫代苹果酸，室温下搅拌6h，用MWCO为12000Da的透析袋透析48h，冻干，得羧基化的黑色素纳米粒；

(3)、制备多肽链修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(2)中的8mg羧基化的黑色素纳米粒溶于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺8mg，N-羟基琥珀酰亚胺6mg，室温下避光搅拌3h，加入多肽链5mg，加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干后得到多肽链修饰的黑色素纳米粒；

(4)、制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取8mg羧基化的黑色素纳米粒溶于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺8mg，N-羟基琥珀酰亚胺6mg，室温下避光搅拌3-5h，称取2-氰基-6-氨基-苯并噻唑3mg溶于DMF中，加入反应体系中，加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH至7.5，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

(5)、制备负载金属离子的黑色素纳米粒：称取步骤(3)下的多肽链修饰的黑色素纳米粒8mg，金属盐MnCl

制备负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(4)下的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒8mg，金属盐MnCl

(6)、制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物：称取步骤(5)的负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒0.5mg、或负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒0.5mg分散于0.5mL的溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，再加入0.5mL导入PD-1工程化的大肠杆菌Tris-HCl缓冲液10

实施例2

本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)、制备黑色素纳米粒：取黑色素7mg溶于的0.1mol/L氢氧化钠8mL中，冰浴超声0.5h；加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH为7.0，用MWCO为2500Da的透析袋透析6h，冻干，得黑色素纳米粒；

(2)、制备羧基化的黑色素纳米粒：取步骤(1)中的7mg黑色素纳米粒溶于9mL溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入7mg硫代苹果酸，室温下搅拌7h，用MWCO为12000Da的透析袋透析48h，冻干，得羧基化的黑色素纳米粒；

(3)、制备多肽链修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(2)中的9mg羧基化的黑色素纳米粒溶于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺9mg，N-羟基琥珀酰亚胺7mg，室温下避光搅拌4h，加入多肽链6mg，加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.8，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干后得到多肽链修饰的黑色素纳米粒；

(4)、制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取9mg羧基化的黑色素纳米粒溶于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺9mg，N-羟基琥珀酰亚胺7mg，室温下避光搅拌4h，称取2-氰基-6-氨基-苯并噻唑4mg溶于DMF中，加入反应体系中，加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH至7.8，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

(5)、制备负载金属离子的黑色素纳米粒：称取步骤(3)下的多肽链修饰的黑色素纳米粒9mg，金属盐ZnCl

制备负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(4)下的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒9mg，金属盐ZnCl

(6)、制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物：称取步骤(5)的负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒1.0mg、或负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒1.0mg分散于2mL的溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，再加入0.5mL含有PD-L1质粒的大肠杆菌Tris-HCl缓冲液10

实施例3

本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)、制备黑色素纳米粒：取黑色素8mg溶于的0.1mol/L氢氧化钠10mL中，冰浴超声0.5h；加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH为7.5，用MWCO为2500Da的透析袋透析6h，冻干，得黑色素纳米粒；

(2)、制备羧基化的黑色素纳米粒：取步骤(1)中的8mg黑色素纳米粒溶于10mL溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入8mg硫代苹果酸，室温下搅拌8h，用MWCO为12000Da的透析袋透析48h，冻干，得羧基化的黑色素纳米粒；

(3)、制备多肽链修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(2)中的10mg羧基化的黑色素纳米粒溶于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺10mg，N-羟基琥珀酰亚胺8mg，室温下避光搅拌5h，加入多肽链8mg，加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.0，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干后得到多肽链修饰的黑色素纳米粒；

(4)、制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取10mg羧基化的黑色素纳米粒溶于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺10mg，N-羟基琥珀酰亚胺8mg，室温下避光搅拌5h，称取2-氰基-6-氨基-苯并噻唑5mg溶于DMF中，加入反应体系中，加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH至8.0，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

(5)、制备负载金属离子的黑色素纳米粒：称取步骤(3)下的多肽链修饰的黑色素纳米粒10mg，金属盐MnCl

制备负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(4)下的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒10mg，金属盐MnCl

(6)、制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物：称取步骤(5)的负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒2mg、或负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒2mg分散于2mL的溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，再加入1.5mL含有PD-L1质粒的大肠杆菌Tris-HCl缓冲液10

实施例4

本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)、制备黑色素纳米粒：取黑色素10mg溶于的0.1mol/L氢氧化钠9mL中，冰浴超声0.5h；加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH为6.8，用MWCO为2500Da的透析袋透析6h，冻干，得黑色素纳米粒；

(2)、制备羧基化的黑色素纳米粒：取步骤(1)中的10mg黑色素纳米粒溶于10mL溶剂超纯水中，加入7.5mg硫代苹果酸，室温下搅拌7.5h，用MWCO为12000Da的透析袋透析48h，冻干，得羧基化的黑色素纳米粒；

(3)、制备多肽链修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(2)中的11mg羧基化的黑色素纳米粒溶于pH7.4的PBS缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺11mg，N-羟基琥珀酰亚胺9mg，室温下避光搅拌3.5h，加入多肽链7mg，加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干后得到多肽链修饰的黑色素纳米粒；

(4)、制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取11mg羧基化的黑色素纳米粒溶于溶剂pH7.4的PBS缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺11mg，N-羟基琥珀酰亚胺9mg，室温下避光搅拌3.5h，称取2-氰基-6-氨基-苯并噻唑6mg溶于溶剂超纯水中，加入反应体系中，加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH至7.6，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

(5)、制备负载金属离子的黑色素纳米粒：称取步骤(3)下的多肽链修饰的黑色素纳米粒11mg，金属盐ZnCl

制备负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(4)下的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒11mg，金属盐ZnCl

(6)、制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物：称取步骤(5)的负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒1.5mg、或负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒1.5mg分散于1.5mL的溶剂pH7.4的PBS缓冲液中，再加入1mL含有PD-L质粒的大肠杆菌Tris-HCl缓冲液10

实施例5

本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)、制备黑色素纳米粒：取黑色素6mg溶于的0.1mol/L氢氧化钠6mL中，冰浴超声0.5h；加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH为7.2，用MWCO为2500Da的透析袋透析6h，冻干，得黑色素纳米粒；

(2)、制备羧基化的黑色素纳米粒：取步骤(1)中的6mg黑色素纳米粒溶于8mL溶剂DMF中，加入6.5mg硫代苹果酸，室温下搅拌6.5h，用MWCO为12000Da的透析袋透析48h，冻干，得羧基化的黑色素纳米粒；

(3)、制备多肽链修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(2)中的8mg羧基化的黑色素纳米粒溶于溶剂DMF中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺8mg，N-羟基琥珀酰亚胺6mg，室温下避光搅拌4.5h，加入多肽链5mg，加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干后得到多肽链修饰的黑色素纳米粒；

(4)、制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取8mg羧基化的黑色素纳米粒溶于溶剂DMF中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺8mg，N-羟基琥珀酰亚胺6mg，室温下避光搅拌3h，称取2-氰基-6-氨基-苯并噻唑3-7mg溶于溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入反应体系中，加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH至7.8，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

(5)、制备负载金属离子的黑色素纳米粒：称取步骤(3)下的多肽链修饰的黑色素纳米粒8mg，金属盐MnCl

制备负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(4)下的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒8mg，金属盐MnCl

(6)、制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物：称取步骤(5)的负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒0.8mg、或负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒0.8mg分散于0.8mL的超纯水中，再加入0.8mL含有PD-L1质粒的大肠杆菌Tris-HCl缓冲液10

实施例6

本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)、制备黑色素纳米粒：取黑色素12mg溶于的0.1mol/L氢氧化钠10mL中，冰浴超声0.5h；加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH为7.5，用MWCO为2500Da的透析袋透析6h，冻干，得黑色素纳米粒；

(2)、制备羧基化的黑色素纳米粒：取步骤(1)中的12mg黑色素纳米粒溶于10mL溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入8mg硫代苹果酸，室温下搅拌8h，用MWCO为12000Da的透析袋透析48h，冻干，得羧基化的黑色素纳米粒；

(3)、制备多肽链修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(2)中的12mg羧基化的黑色素纳米粒溶于溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺12mg，N-羟基琥珀酰亚胺10mg，室温下避光搅拌5h，加入多肽链9mg，加入0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.0，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干后得到多肽链修饰的黑色素纳米粒；

(4)、制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取12mg羧基化的黑色素纳米粒溶于溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺12mg，N-羟基琥珀酰亚胺10mg，室温下避光搅拌5h，称取2-氰基-6-氨基-苯并噻唑7mg溶于溶剂pH7.4的PBS缓冲液中，加入反应体系中，加入0.1mol/L的稀盐酸调节pH至8.0，在氮气下避光搅拌24h，用MWCO为12000Da的透析袋透析24h，冻干，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒；

(5)、制备负载金属离子的黑色素纳米粒：称取步骤(3)下的多肽链修饰的黑色素纳米粒12mg，金属盐ZnCl

制备负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒：称取步骤(4)下的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒12mg，金属盐ZnCl

(6)、制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物：称取步骤(5)的负载金属离子的多肽链修饰的黑色素纳米粒2mg、或负载金属离子的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的黑色素纳米粒2mg分散于2mL的溶剂pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，再加入1.5mL含有PD-L1质粒的大肠杆菌Tris-HCl缓冲液10

上述实施例1-6制备的工程菌负载功能化黑色素纳米体系的复合物在肿瘤治疗方面可发挥靶向肿瘤、激活cGAS-STING通路，阻断PD-1/PD-L1轴，逆转T细胞耗竭等多重功效，有效用于制备抗肿瘤药物，实现在制备抗肿瘤药物(注射剂)中的应用，在制备增强cGAS-STING免疫信号通路药物中的应用，在制备基于光热敏感、Legumain酶响应性粒径转变的黑色素纳米粒肿瘤微环境药物中的应用。

本发明操作方便，方法稳定可靠，合成方法简单，通过工程菌的乏氧靶向性蓄积在肿瘤部位。在肿瘤微环境legumain酶的作用下，黑色素纳米体系的粒径由小变大，从而促进纳米粒在肿瘤部位的滞留，形成金属储库，生物相容性好、滞留时间长达72h。此外，由于黑色素纳米粒的光热转换性能，工程菌释放PD-1或PD-L1，阻断PD-1/PD-L1信号轴。所制备的功能化黑色素纳米体系负载工程菌复合物能高效激活STING通路并逆转T细胞耗竭，从而提高抗肿瘤免疫治疗效果。本发明经反复多次试验，均取得了很好一致的效果(以实施例2为例，每个实验至少重复3次，取平均值)，有关试验资料如下：

一、功能化黑色素纳米体系的表征

1、功能化黑色素纳米体系中锰离子含量的测定：

采用ICP-MS测定Mn

2、工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的粒径和电位的测定实验：

取适量的功能化黑色素纳米体系、工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物，分别分散于水中，用激光纳米粒度仪测得其水合粒径和电位分别为～60nm和～4μm，电位～-13mV和～-20mV；

3、工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的透射电镜表征：

将该复合物溶于超纯水制备为50μg/mL的溶液，滴加1滴于普通碳支持膜上，待液体蒸发后，用透射电子显微镜拍摄。如图1所示，可以看出合成的功能化黑色素纳米体系成功黏附在工程菌表面。

二、工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物在体外光热转换实验及分泌PD-L1的能力实验：

为了研究该复合物的光热性能，制备不同浓度黑色素纳米体系与工程菌孵育的复合物。由图2A-B看出，随着激光照射时间的延长和黑色素纳米体系浓度的增加，该复合物的温度显著上升，该结果表明该复合物在808nm激光照射下具有显著的光热转换能力。此外，通过ELISA试剂盒检测，发现激光照射后成功分泌出PD-L1(图3)。

三、Legumain酶诱导的体外聚集实验：

以MNP-pep、MNP-CABT和MNP-pep+MNP-CABT作为对照，分别在pH6.5的PBS缓冲液中进行孵育，在第1h、2h、4h、8h、12h以及24h用激光粒度分析仪测量样品的粒径。图4结果显示，只有MNP-pep+MNP-CABT加Legumain孵育后粒径呈现明显增大，而其他组粒径依然维持在60nm左右，表明MNP-pep+MNP-CABT具有优越的legumain酶敏感聚集特性。

四、工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的肿瘤靶向性实验：

为了探究工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物能否主动靶向到肿瘤组织。因此，按照制备工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的方法加入荧光染料IR783。当荷瘤小鼠的肿瘤体积达到200mm

五、工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物在肿瘤组织中的滞留能力实验：

对小鼠荷瘤造模，当荷瘤小鼠的肿瘤体积达到～200mm

六、通过westernblot技术检测肿瘤组织中cGAS-STING相关蛋白的表达实验：

培养4T1乳腺癌细胞，皮下接种于BALB/c小鼠，待肿瘤体积达到100mm

七、通过流式细胞术考察工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物阻断PD-1/PD-L1轴的能力实验：

取出荷瘤小鼠的肿瘤组织，研磨，得到肿瘤组织的单细胞悬液，在冰上孵育抗体工作液，洗涤，装入流式管中，用流式细胞术检测。结果发现，制剂组将肿瘤细胞表面PD-L1蛋白从19.3％下调至8..63％，将CD8

本发明按上述实验方法对实施例2实验的同时，还对其它实施例进行了同样的实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举。

实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：

(1)本实验提供的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物具有优良生物相容性、稳定性，能够络合金属离子发挥免疫治疗；

(2)本发明提供的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物在808nm激光作用下，能够产生显著的光热效应，促进PD-L1的表达；

(3)本发明利用的多肽链和2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰黑色素纳米粒，可以在酶的刺激下发生聚合反应，在肿瘤组织中延长滞留时间，并形成金属储库，从而有效激活STING通路。此外，工程化的大肠杆菌在激光下分泌PD-L1，阻断PD-1/PD-L1轴，逆转T细胞耗竭。

(4)本发明所制得的工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的生物相容性好，能够在肿瘤微环境中legumain酶的作用下实现粒径由小变大，增强纳米粒在肿瘤部位的蓄积。此外，在激光照射下，工程菌分泌PD-L1，恢复效应T细胞的功能，增强抗肿瘤免疫治疗效果，抑瘤率高达80％。从而用于制备抗肿瘤药物，实现在制备抗肿瘤药物中的应用。

总之，本发明一种工程菌负载功能化黑色素纳米体系复合物的制备方法及应用，可有效解决肿瘤部位纳米制剂的滞留问题，提高抗肿瘤免疫治疗效果，保证癌症治疗效果的用药问题，将黑色素制备黑色素纳米粒，黑色素纳米粒与氢氧化钠反应生成羧基化的黑色素纳米粒，通过酰胺化反应在黑色素纳米粒上分别修饰多肽链和2-氰基-6-氨基-苯并噻唑，利用黑色素纳米粒表面的氨基和酚羟基将金属离子络合在其表面，得到功能化的黑色素纳米体系，通过黏附作用将功能化的黑色素纳米体系黏附在工程化菌的表面，得到工程菌负载功能化黑色素纳米体系的复合物，制备方法简单，稳定可靠，可有效提高肿瘤部位纳米制剂的滞留效应，高效激活抗肿瘤免疫应答，提高了药物的利用率和疗效，是肿瘤免疫治疗药物上的创新、经济和社会效益巨大。