一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法

技术领域

本发明属于分析化学检测技术领域，具体涉及一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法。

背景技术

科学家们发了多种卓有成效的病毒检测方法。例如，细胞培养、石英晶体微量天平(QCM)、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法已常规使用。然而，这些方法往往需要昂贵的抗体和酶用作识别元件，需要使用昂贵的专业仪器设备，耗时长且需要训练有素的专业人员操作，不利于病毒的快速检测。因此，迫切需要开发快速、准确、灵敏、便携和易于操作的检测技术，甚至开发待检人员自助式快速检测方法。

分子印迹过程可以定义为人工定制与模板分子大小、形状和官能团特异性匹配或识别的结合位点。通过添加模板、聚合功能单体，交联剂和引发剂引发聚合，然后，采用合适的洗脱剂洗脱去除模板，产生与目标物特异性识别空腔，得到分子印迹聚合物(MIPs)。近年来，已经发展了较多应用于病毒检测的分子印迹技术。例如，Tancharoen等人构建了一种基于表面印迹的血清寨卡病毒检测电化学生物传感器。卢等人构建了用于检测HIV相关蛋白的表位印迹亲水聚合物包被的QCM，其检测限为2ng/mL(512pM)。罗等人构建了基于多功能分子印迹荧光传感器，可实现甲型和乙型肝炎病毒可视化同时检测，检测限分别为3.4和5.3pM。唐等人构建了一种基于“爆炸式”二次放大策略的超灵敏病毒可视化检测分子印迹病毒传感器，荧光和比色检测的检测限分别可达8.33fM和2.08pM，然而这些方法虽然取得了较好的检测，但存在无法可视化或成本高或无法便携式等缺点。

纸张具有廉价易得，亲水性优良、易裁剪、易修饰、易展示、易存储、无毒、便于携带等特点，使得其成为便携式多功能检测传感器的优选材料之一。例如，刘等人使用蜡印技术构建了基于折纸的微流控器件，并采用电化学方法实现了腺苷的检测。该方法具有成本低、检测速度快、便于生物检测等优点。方等人采用分子印迹结合接枝碳点纸构建了纸基传感器，其表现出了高吸附能力、出色的选择性和低检测限等优良性能。

金属有机骨架(MOFs)是金属(单金属离子、金属团簇或金属链)和有机接头在温和条件下自组装形成的新生杂化无机-有机材料家族。MOFs具有结构多样性、大表面积、可以调节的孔径和功能等。较大的表面积和孔径可作为潜在的药物载体，可封装多种类型的药物。沸石咪唑酸盐骨架(ZIF)是MOFs材料中应用最为广泛的子类之一。

为了构建低成本、便携式、肉眼可视化的病毒分子印迹传感器，本发明以价廉易得、大表面积、易裁剪、易修饰的纸张为基底，在其表面进行印迹后得到分子印迹聚合物(MIPs)。另一方面，合成了包覆罗丹明(RhB)的ZIF-8-NH

发明内容

针对现有方法成本较高、仪器复杂等不足，本发明的目的是构建了一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，并将所述传感器用于病毒的特异性、可视化检测。

一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：

(1)以便携式、价廉易得的纸张(WP)作为基底，以流感病毒H5N1为模板病毒，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体，硅酸四乙酯(TEOS)为交联剂，氨水(NH

(2)将染料罗丹明B(RhB)包覆在ZIF-8-NH

(3)MIPs通过形状、大小、功能单体之间的氢键作用协同识别流感病毒H5N1，同时H5N1与ZIF-8-NH

(4)便携式纸基病毒传感器的制备及应用：将模板病毒H5N1与纸基分子印迹聚合物在优化的实验条件下吸附一段时间后，再加入荧光比色探针ZIF-8-NH

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)以纸张作为病毒分子印迹的载体材料。纸张具有廉价易得，亲水性优良、易裁剪、易修饰、易展示、易存储、无毒、便于携带等优点，为流感病毒H5N1提供灵敏可靠的检测方法，降低了传感器的制备成本，使传感器小型、便携化，可实现待检者的可视化自助检测；

(2)以ZIF-8-NH

(3)适配体(H5N1～Apt)可与流感病毒H5N1高特异性的识别与结合，能够显著增加传感器的特异性，提高灵敏度；

(4)结果表明，便携式纸基传感器具有高特异性和令人满意的灵敏度，同时具备便携式与可视化的能力；

(5)所述传感器具有应用于其它分子检测的潜在可能性，且检测过程对操作人员的专业要求不高，具有重要的实际应用价值。

附图说明

[图1]所述的便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器制备的流程示意图。

[图2]便携式纸基病毒传感器检测H5N1病毒的可行性分析(MIPs、MIPs+H5N1+Apt、NIPs、NIPs+H5N1+Apt及对应的可见光(左上方)和紫外灯(左下方)下的可视化图)。

[图3](A)WP(500倍放大)、(B)WP(10000倍放大)、(C)MIPs(500倍放大)、(D)MIPs(10000倍放大)、(E)NIPs(500倍放大)、(F)NIPs(10000倍放大)、(G)ZIF-8-NH

[图4](A)MIPs检测不同浓度的H5N1(0.4,0.58,1.16,2.9,4.0,5.8,11.6,29,35,40,58,116,290fmol/L)的线性；(B)可见光下可视化(上方)和紫外下(下方)可视化图；(C)线性拟合；(D)NIPs检测不同浓度的H5N1(0.4,0.58,1.16,2.9,4.0,5.8,11.6,29,35,40,58,116,290fmol/L)的线性。

[图5](A)MIPs/NIPs对H5N1的选择性(H5N1，H7N9，HBV，RCV和EV71)、(B)竞争性实验(H5N1，H5N1+H7N9，H5N1+HBV，H5N1+RCV和H5N1+EV71)、(C)MIPs的抗干扰能力实验(Na

[图6]便携式纸基病毒分子印迹传感器对H5N1检测的加标回收。

[图7]便携式纸基病毒分子印迹传感器与酶联免疫吸附测定(ELISA)在实际应用中的比较(下图为ELISA测定结果)。

具体实施方案

在此，将结合附图及实施例，对本发明的具体实施方案作进一步的详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的应用范围及扩展。

实施例1：一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法

(1)ZIF-8-NH

(2)ZIF-8-NH

(3)印迹聚合物/非印迹聚合物(MIPs/NIPs)的制备：将20μLH5N1和80μLAPTES加入到12mLPBS中，在搅拌下加入100μLNH

(4)便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备：将分散在PBS(pH＝7.4，10mM)缓冲液中的不同浓度的H5N1病毒加入到纸基MIPs和NIPs中，于37℃下震荡1h后将溶液去除并用PBS缓冲液洗涤纸基MIPs/NIPs 3次，随后将超声分散的ZIF-8-NH

实施例2：所述便携式纸基病毒分子荧光传感器的可行性分析

采用纸基MIPs和NIPs对相同浓度的H5N1病毒进行检测来探究传感器的可行性，结果如图2所示，对比了纸基MIPs和NIPs在吸附病毒H5N1后590nm左右的荧光强度，可以看出纸基MIPs加入H5N1病毒后有较强的荧光强度，而纸基NIPs展示出微弱的荧光强度，这是由于纸基MIPs中有H5N1病毒的特异性识别位点以及功能单体的协同识别，因此具有较强荧光，而纸基NIPs由于不存在H5N1病毒的识别位点，导致荧光强度低，同时我们也验证了不加病毒，只加ZIF-8-NH

实施例3：所述便携式纸基病毒分子荧光传感器及中间产物的性能、形貌和结构表征。

采用扫描电子显微镜(SEM)、傅立叶变换红外光谱(FI-IR)、X射线衍射(XRD)对制备的ZIF-8-NH

图3中(K)ZIF-8(a)，RhB(b)，ZIF-8-NH

图3中(O)为上述各材料的XRD图，ZIF-8的XRD与文献报道的一致，接枝氨基后得到ZIF-8-NH

实施例3：所述便携式纸基病毒分子荧光传感器的应用

本实施例的实验条件为：MIPs的用量1张(1.3cm×1.3cm)，pH为7.4，病毒吸附时间为1h，ZIF-8-NH

(1)所述便携式纸基病毒分子荧光传感器对不同浓度H5N1的检测线性分析

按上述实验步骤，以本发明所述的便携式纸基病毒分子荧光传感器对不同浓度的H5N1进行检测线性分析，结果如图4所示，所制备的传感器对H5N1的分析浓度范围为5.8～58fmol/L，检测限为0.58fmol/L，结果显示线性范围较宽，检测限较低，具有良好的可视化效果。

(2)所述便携式纸基病毒分子荧光传感器对H5N1的选择性和竞争性实验

本实例采用了形状大小相似或不同的病毒之间的选择性和竞争性，选择了模板病毒H5N1、H7N9、HBV、RCV和EV71作为分析目标物。

实验按上述步骤进行，将所述传感器的选择性进行了分析，实验结果如图5A所示，所述的传感器具有与模板病毒H5N1形状大小相同的识别腔和功能单体的相互作用以及具有特异性适配体的结合，故与H5N1特异性结合，选择性高于其他病毒，对H5N1表现高的荧光强度，印迹因子IF＝4.55，对其他病毒的IF值均小于2，表明所述传感器具有良好的选择性。

同样，我们通过在目标病毒H5N1中加入相应的竞争性病毒，来考察所述传感器的竞争性，结果如图5B所示，由于竞争性病毒的形状大小的差异且与功能单体的作用力不同，不能被印迹腔识别，此外，适配体无法与其它病毒特异性识别，故竞争性病毒对目标病毒H5N1的检测影响较小。表明所述传感器对目标病毒具有优异的识别能力。

(3)所述便携式纸基病毒分子荧光传感器的抗干扰能力及重复使用性实验

通过血清中一些存在的物质来进一步考察所述便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的抗干扰能力，结果如图5C所示，在血清的干扰物中，发现与没加干扰物的荧光强度无明显差异，对目标病毒H5N1的检测影响可以忽略不计，说明所述便携式纸基病毒分子荧光传感器具有良好的抗干扰能力。

接下来对所述便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的重复性进行了研究，我们将同一批传感器进行吸附-解吸5个循环来考察传感器的重复使用性，结果如图5D所示，在5个循环后对H5N1检测的荧光强度为原始的71.2％，表明5个循环后，对传感器的印迹腔稍有破环，但仍具有良好的检测，表明传感器具有良好的重复使用性。

(4)所述便携式纸基病毒分子荧光传感器对H5N1的血清加标回收

所述便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器在100倍稀释的人血清样品中进行3次平行测定来检测H5N1(图6)。所述的传感器对目标物检测的回收率为92.66％～104.6％，表明该便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器在检测目标病毒H5N1时具有很大的实际应用潜力。

(5)所述便携式纸基病毒分子荧光传感器与ELISA检测H5N1的比较

将所述便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器与标准方法酶联免疫吸附测定(ELISA)在100倍稀释血清中进行比较，结果如图7所示，结果表明空白血清阴性，加标血清阳性，与ELISA试验完全一致，证实了我们开发的方法可靠性。此外，当使用ELISA标准方法检测浓度为11.6fmol/L的H5N1病毒溶液时，只能显示非常微弱的阳性信号(图7下方)，表明所述便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器(LOD＝0.58fmol/L)比ELISA标准方法具有更高的灵敏度。