一种明胶微载体裂解液残留的检测方法

技术领域：

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种明胶微载体裂解液残留的检测方法。

背景技术：

明胶是近年来发展起来的一种新型细胞培养基质，具有优良的生物相容性和生物降解性，无毒、无免疫原性等优点。它由动物胶原水解得到，可被人体组织吸收和利用。明胶的主要成分是胶原蛋白，与细胞外基质中的胶原蛋白相似，因此能够提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，同时保护细胞不受外界环境的影响，从而提高细胞的生长和分裂速度。

明胶微载体的尺寸一般处于微米级，在悬浮培养体系中能够为单层细胞的生长繁殖提供较大的面积。这种微载体材料的设计可以更好地满足细胞生长和繁殖的需求，同时也有利于细胞的形态和功能表达。明胶微载体在细胞培养中具有广泛的应用。它可以作为细胞培养的支架材料，提供细胞生长的三维环境，促进细胞的贴附、生长和增殖。

传统的微载体在细胞培养中通常用于收集细胞产物，例如疫苗、蛋白质和病毒。然而，使用传统微载体生产细胞治疗所需的细胞存在一个难题，即在培养后有效地收集微载体上的细胞。在传统微载体的应用领域中，分离细胞时需要使用EDTA和胰蛋白酶溶液将细胞从微载体表面消化，使细胞与微载体分离。分离后的细胞可通过自然沉降法或筛网过滤去除微载体，然后进行离心和过滤液来获取细胞。然而，这种方法需要进一步的分离步骤，增加了整个生产过程的成本和复杂性。此外，长时间的细胞消化会对细胞造成损伤，因此无法获得高质量的用于治疗的细胞制品已经成为常见问题。另外，如果微载体颗粒不能有效去除，其残留物可能会引起后续细胞制品注射到体内时的安全性问题。

为了解决这一问题，我们可以采用明胶微载体和微载体裂解液的组合。通过微载体裂解液对微载体进行裂解，将微载体从固态溶解为液态，从而释放载体上的细胞到溶液中。通过离心的方式，我们可以将细胞与溶液分离，从而获得纯净的细胞样品。与传统方法不同的是，裂解液仅针对微载体进行裂解，对细胞本身温和，保持细胞的活性并保留其自身分泌的蛋白质。这样一来，我们不再需要繁琐的步骤去除微载体颗粒，并且避免了由此产生的安全隐患。

然而，引入微载体裂解液也带来了新的挑战。为了确保细胞制剂在临床应用中的安全性，需要对微载体裂解液残留进行检测。目前，有技术采用了荧光修饰明胶的方法，根据荧光显示确定微载体裂解液的残留量。但传统荧光修饰需要专门的定向可修饰荧光基团，成本高，原料受限，修饰之后有些基团会丧失荧光特性从而造成灵敏度下降，还需要进一步的改进。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是传统荧光修饰需要专门的定向可修饰荧光基团，成本高，原料受限，修饰之后有些基团会丧失荧光特性从而造成灵敏度下降，还需要进一步的改进。

为解决上述问题，本发明通过包埋的方式，利用包埋物与裂解液反应，产生单独游离的荧光素，即可以实现光谱性应用，不需要用到专门的定向可修饰荧光基团。并且游离基团灵敏度要高于修饰基团，检测效果更准确。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种明胶微载体裂解液残留的检测方法，将包封有荧光素钠的明胶底物与待测样品混合反应(在37℃下反应1-60min)，在吸收波长495nm、发射波长515nm处检测样品的荧光强度，判定待测样品中明胶微载体裂解液的残留程度。若待测样品中含有明胶微载体裂解液，则明胶底物被明胶微载体裂解液催化，包埋在内的荧光素钠会释放出来，其荧光强度与待测样品中胶原酶活性成正比。

进一步的，以明胶微载体裂解液配置一系列的标准品溶液，绘制浓度与荧光强度的标准曲线，实现定量检测微载体裂解液的残留浓度。

进一步的，所述包封荧光素钠的明胶底物的制备方法，包括以下步骤:

(1)连续相配置：将连续相与表面活性剂进行混合，连续相可为正己烷，液体石蜡，植物油，表面活性剂可为span80、span85；

(2)分散相和交联剂溶液配置：分别将明胶溶解在水或磷酸盐缓冲液中作为分散相，将交联剂溶解在水或磷酸盐缓冲液中作为交联剂溶液，交联剂可为戊二醛、京尼平、谷氨酰胺转氨酶、EDC/NHS；

(3)包封荧光素钠的明胶底物制备：将连续相分散均匀后，将分散相与交联剂混合5～300s，迅速置于连续相中100～3000转/min搅拌0～24h。

(4)明胶底物的清洗、分离：将乳化体系中的连续相倒出，用乙醇、丙酮溶液和去离子水或其任意比例混合溶液洗涤大孔水凝胶微球，去除残余连续相和表面活性剂，随后可用不同目数的筛网获得不同粒径分布的包封荧光素钠的明胶底物，在避光条件下冷冻干燥备用。

进一步的，步骤(1)连续相与表面活性剂的配比为200：1～20(v/v)。

进一步的，步骤(2)中分散相的浓度为5～40g/L；交联剂溶液的浓度为5～25g/L。

进一步的，步骤(3)中连续相、分散相与交联剂的配比为体积比200：10～50：2.4～12.5。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明利用明胶包埋荧光基团的方式，若待测样品中含有明胶微载体裂解液，则明胶底物被明胶微载体裂解液催化，包埋在内的荧光素钠会释放出来，其荧光强度与待测样品中胶原酶活性成正比，即可实现明胶微载体裂解液的定性和定量检测。

(2)本发明利用明胶包埋荧光基团的方式，其制备过程、应用过程不需要避光，制备过程简单，不会出现荧光淬灭。制备得到的包封荧光素钠的明胶底物可永久保留，适应性强。

(3)本发明利用包埋在明胶内的荧光基团进行检测，其灵敏度要高于修饰基团，检测效果更准确。

附图说明

图1：实施例1中包封荧光素钠的明胶底物的光学显微镜图像。

图2：实施例2中包封荧光素钠的明胶底物的光学显微镜图像。

图3：为实施例3明胶微载体培养细胞中裂解液残留检测结果。

图4：明胶微载体培养细胞中裂解液残留检测结果。

图5：异硫氰酸荧光素修饰明胶制备微载体(样品A)与直接包埋制备微载体(样品B)经过裂解液处理后荧光信号图。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：包封荧光素钠的明胶底物制备：

(1)连续相配置：将1000mL正己烷与50mL span80进行混合；

(2)分散相和交联剂溶液配置：将6g明胶溶解在200mL纯水中作为分散相，将0.8g谷氨酰胺转氨酶溶解在50mL纯水中作为交联剂溶液。

(3)包封荧光素钠的明胶底物制备：将连续相分散均匀后，将分散相与交联剂混合10s，迅速置于连续相中1500转/min搅拌8h。

(4)明胶底物的清洗、分离：将乳化体系中的连续相倒出，用乙醇、丙酮溶液和去离子水或其任意比例混合溶液洗涤大孔水凝胶微球，去除残余连续相和表面活性剂，随后可用不同目数的筛网获得不同粒径分布的明胶底物，在避光条件下冷冻干燥备用。

如图1所示，在制备的包封荧光素钠的明胶底物的光学显微镜图像可以看出，封荧光素钠的明胶底物呈球形颗粒、均匀分布。

实施例2：包封荧光素钠的明胶底物制备：

(1)连续相配置：将1000mL液体石蜡与20mL span85进行混合；

(2)分散相和交联剂溶液配置：将6g明胶溶解在200mL纯水中作为分散相，将5mL戊二醛溶液溶解在50mL纯水中作为交联剂溶液。

(3)包封荧光素钠的明胶底物制备：将连续相分散均匀后，将分散相与交联剂混合10s，迅速置于连续相中800转/min搅拌3h。

(4)明胶底物的清洗、分离：将乳化体系中的连续相倒出，用乙醇、丙酮溶液和去离子水或其任意比例混合溶液洗涤大孔水凝胶微球，去除残余连续相和表面活性剂，随后可用不同目数的筛网获得不同粒径分布的明胶底物，在避光条件下冷冻干燥备用。

如图2所示，在制备的包封荧光素钠的明胶底物的光学显微镜图像可以看出，封荧光素钠的明胶底物呈球形颗粒、均匀分布。

实施例3：明胶微载体裂解液残留荧光检测法的建立及应用：

1、待测样品的制备：

(1)取出培养细胞的微载体自然沉降或离心，去除上清，使用PBS或D-hanks缓冲液清洗2次得到含有细胞的三维微载体；

(2)将含有细胞的三维微载体加入3D-MIC Digest微载体裂解液(购自青岛海洋食品营养与健康创新研究院)，其中微载体质量与裂解液体积的比例可为1mg：0.2mL，37℃孵育10min，裂解其中三维微载体；

(3)将步骤(2)中三维微载体裂解完全后，在1800rpm/min条件下离心8min去除上清，再加入PBS重复上述离心步骤2次，去除上清获得干细胞，最终将细胞重悬在1mLPBS溶液中作为待测样品1和待测样品2，使用PBS配置250ng/mL的胶原酶溶液作为阳性对照。。

其中，所述细胞可为脐带间充质干细胞

2、包封荧光素钠的明胶底物配制：

取20mg底物，溶于10ml纯水中，避光保存；试验前，使用Buffer溶液稀释到浓度为0.5mg/ml，充分混匀，备用。

3、标准溶液配制

取20mg裂解液配置标准品中加入20mlPBS中，完全溶解后，轻轻混匀；使用Buffer溶液稀释到浓度为250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml充分混匀，备用。

4、实验过程

取1mL底物加入5mL待测样品或标准品溶液中，加入PBS缓冲液定容到10mL，37℃孵育30min，孵育后4000rpm/min条件下离心3min，空白对照以PBS缓冲液替代待测样品或标准品溶液。取上清液与荧光分光光度计中，在吸收波长495nm、发射波长515nm处检测样品的荧光强度，根据标准品溶液的浓度与吸光度值绘制标准曲线。将待测样品的荧光强度值代入标准曲线中来测定样品中的裂解液残留。

图2的结果可以看出裂解液残留检测的标准曲线及其方程为y＝0.6248x+2.9179，计算结果如图3所示，样品1和样品2中微载体裂解液的残留量分别为116.33ng/mL和159.33ng/mL，阳性对照中的裂解液的残留量为244.76ng/mL。

5.修饰与包埋异硫氰酸荧光素微载体的制备

(1)异硫氰酸荧光素于无水DMSO配制成浓度为0.1mg/mL的溶液。随后明胶蛋白加热(55℃)溶解在0.1M pH 9.0碳酸盐缓冲液中，终浓度3％。随后1mL异硫氰酸荧光素溶液添加到50mL明胶溶液中，并在50℃避光反应4h，随后样品用含40％乙醇水溶液透析去除残留FITC。获得的样品测定蛋白浓度调节至2％，随后按照实施例1不添加荧光素制备微载体。

(2)2％明胶水溶液50mL添加1mL 0.1mg/mL异硫氰酸荧光素DMSO溶液，避光充分混合后，按照实施例1制备微载体。

获得为两种微载体取相同含量，随后添加相同体积的微载体裂解液，分别与30℃条件下裂解5min，随后离心去除残留固体，上清液荧光480nm激发波长，520nm发射波长检测荧光信号。

结果如图4所示，异硫氰酸荧光素修饰的微载体同包埋异硫氰酸荧光素的微载体均具有良好荧光释放特性。

本发明提供一种新的明胶微载体裂解液残留检测方法，要求检测者对明胶基微载体，培养后新鲜收获的细胞，快速进行明胶微载体裂解液成分胶原蛋白酶、蛋白内切酶、蛋白外切酶、风味酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶及其复合酶的定量或定性检测，从而保障用于临床细胞治疗的细胞制剂在本项检测内容的安全性。本发明可以通过使用市售试剂盒和新的测试方法，在使用微载体悬浮培养细胞，并使用青岛海洋食品营养与健康创新研究院的3D Digest明胶微载体裂解液收获细胞后，可以应用该方法对于收获后的细胞进行检测，从而保障了细胞制剂在本项内容的安全性。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。