靶向Siglec-15的单克隆抗体、制备方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物医学技术领域，更具体地涉及一种靶向Siglec-15的单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术

免疫治疗是应用免疫学原理和方法，通过主动或被动方式激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的治疗方法，在多种癌症的治疗中展现出了良好的治疗效果。免疫治疗包括过继性免疫细胞治疗、细胞因子疗法、免疫检查点阻断疗法以及肿瘤疫苗等。其中，免疫检查点阻断疗法因其显著疗效而备受瞩目。

免疫检查点是机体自身免疫和抗肿瘤作用之间维持平衡的一系列重要因子，在维持自身免疫耐受和机体免疫稳态中起关键作用。细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA-4)和PD-1是最早发现的免疫检查点之一。CTLA-4与共刺激受体CD28高度同源，竞争性地与共同配体CD80/CD86结合，中断了CD28刺激T细胞的活化反应并传递免疫抑制信号。PD-1与PD-L1结合后会促进SHP2磷酸酶的募集，再通过下游信号通路抑制TCR介导的T细胞增殖和细胞因子的分泌。目前发现的免疫检查点还有T细胞免疫球蛋白黏液素3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)等。

为了逃避免疫系统的监视，癌细胞在增殖过程中会通过异常激活免疫检查点来抑制免疫系统的活性，这与肿瘤的免疫逃逸有关。如肿瘤细胞表面高表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合后会抑制T细胞的活性。在晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌的临床试验中，PD-1/PD-L1抗体药物(纳武单抗、派姆单抗等)已取得了良好的药物反应率和反应持久度。尽管免疫检查点阻断疗法已成为最成功的癌症治疗方法之一，但在实体瘤中仍面临耐药性和治疗毒性等诸多障碍。实际上，PD-1/PD-L1抗体药物对实体瘤总体只有20％～30％的有效率。因此，继续寻找新的免疫检查点及开发相应的抑制性抗体成为了目前肿瘤治疗的主要目标之一。

唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(Siglec)家族可通过识别含有唾液酸的糖链来介导不同细胞之间的相互作用，这与细胞的活化有关，此外Siglecs在自身免疫病和肿瘤的生长中具有发挥重要调控的作用。在大多数人正常的组织和免疫细胞中，Siglec-15的mRNA的表达量很低，主要在巨噬细胞上表达，但在多种人的癌细胞中其表达量会上升(如结肠癌和肝癌等)。Siglec-15在体外可有效抑制T细胞的活性，这意味着肿瘤可通过Siglec-15这一免疫检查点来实现免疫逃逸。遗憾的是，Siglec-15在T细胞上的受体至今仍是未知的。目前市面上的Siglec-15抗体主要以多克隆抗体为主，特异性不强，因此，研制一种新的特异性强、亲和力高的Siglec-15单克隆抗体，对于后续Siglec-15抗体药物及用于相应检测方法的开发具有重要意义。

发明内容

鉴于上述问题，本申请提供了一种靶向Siglec-15的单克隆抗体、制备方法及其应用，该单克隆抗体能与人的Siglec-15蛋白特异性结合，以期为后续抗体药物和相应检测方法的研发提供新的选择。

为实现上述目的，本发明的第一个方面，发明人提供了一种靶向Siglec-15的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含VHCDR3和VLCDR3，其中，所述VHCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述VHCDR3的编码DNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述VLCDR3的编码DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述单克隆抗体特异性识别人的Siglec-15蛋白。

优选地，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。

本发明的第二个方面，发明人提供了一种组合物，该组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

本发明的第三个方面，发明人提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物以本发明第一方面所述的单克隆抗体为载体制备而成。

本发明的第四个方面，发明人提供了一种检测试剂盒，该检测试剂盒中包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

本发明的第五个方面，发明人提供了一种生产如本发明第一方面所述的单克隆抗体的细胞。

本发明的第六个方面，发明人还提供了一种本发明第一方面所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1、构建人的Siglec-15胞外区蛋白H-Siglec-15的表达载体，表达纯化，得到人的胞外区蛋白H-Siglec-15；

S2、将所述人的胞外区蛋白H-Siglec-15作为抗原免疫兔子，分离出兔PBMC中的单个B细胞，调取所述B细胞中抗体的轻重链可变区片段；

S3、将所述B细胞中抗体的轻重链可变区片段构建至含有兔轻重链恒定区的轻重链表达载体上，表达兔单克隆抗体；

S4、筛选特异性最高的兔单克隆抗体，即为所述新的靶向Siglec-15的单克隆抗体。

在本发明优选的实施方式中，S2步骤中为采用巢式PCR的方法调取所述B细胞中抗体的轻重链可变区片段。巢式PCR的方法调取可提高扩增出来的产物量，而且可以避免产生突变。

区别于现有技术，上述技术方案至少有以下有益效果：

1、提供了一种靶向Siglec-15的单克隆抗体，相较于现有技术中靶向Siglec-15的多克隆抗体而言，特异性更强、亲和力更好；

2、提供了一种新的靶向人的Siglec-15蛋白的单克隆抗体，有望在未来开发出靶向性强、疗效好以及副作用小的抗肿瘤药物，为免疫检查点阻断疗法提供新的途径；

3、用单个B细胞抗体制备技术来制备Siglec-15单克隆抗体。在使用Expi293真核表达系统表达纯化出人的Siglec-15胞外区蛋白后，将其作为抗原来免疫兔子。免疫3次后分离出兔PBMC中的单个B细胞，再用巢式PCR的方法调取B细胞中抗体的轻重链可变区片段。接着，进一步成功克隆出19株Siglec-15兔单克隆抗体，并对其中特异性最高的抗体进行了一系列功能活性鉴定，结果显示这株抗体在Western blotting、ELISA、Flow Cyto Metry(FCM)和Immunofluorescence(IF)中均可识别与结合人的Siglec-15蛋白，并且在WB中识别人Siglec-15蛋白的能力方面，与商业化的多克隆抗体相比具有更强的特异性。

附图说明

在说明书附图中：

图1为具体实施方式中H-Siglec-15胞外区DNA片段琼脂糖凝胶电泳结果，其中，1-5：扩增出的H-Siglec-15胞外区DNA片段；M：DL2000 Marke；

图2为具体实施方式中H-Siglec-15-TEV-FC和GST-TEV-H-Siglec-15载体测序结果；

图3为具体实施方式中Expi293细胞上清的SDS-PAGE鉴定和Western blotting鉴定，其中1：Mock细胞沉淀；2：转染后第三天细胞上清；3：转染后第四天细胞上清；4：转染后第五天细胞上清；5：转染后第六天细胞上清；M：250kDa Marker；

图4为H-Siglec-15-FC蛋白的纯化与鉴定结果；其中，1：转染后第三天Expi293细胞上清；2：转染后第四天细胞上清；3：转染后第五天细胞上清；4：转染后第六天细胞上清；5：转染后第六天细胞上清与细胞沉淀；6：流穿液；7：洗脱液；8：清洗液；9：蛋白浓缩液；10：加DTT处理后的Siglec-15-FC蛋白；M：180kDa Marke；

图5为GST-H-Siglec-15蛋白的SDS-PAGE与Western blotting鉴定结果，其中，A：GST-H-Siglec-15蛋白的SDS-PAGE鉴定；B：GST-H-Siglec-15蛋白的Western blotting鉴定；M：180kDa Marker；GST-S15：GST-H-Siglec-15蛋白；

图6为TEV蛋白酶的纯化与鉴定结果，其中，泳道：1：菌沉淀；2：菌上清液；3：流穿液；4：20mMIM洗脱液；5：80mMIM洗脱液；6：200mMIM洗脱液；M：180kDaMarker；

图7为H-Siglec-15-FC蛋白的酶切与鉴定，其中，A：H-Siglec-15-FC蛋白酶切反应液的SDS-PAGE鉴定；B：H-Siglec-15-FC蛋白酶切反应液的Western blotting鉴定；1：酶切后的H-Siglec-15-FC蛋白；2：反挂柱流穿液；3：浓缩后的流穿液；M：180kDaMarker。

图8为GST-H-Siglec-15蛋白的酶切与鉴定，其中，A：GST-H-Siglec-15蛋白酶切反应液的SDS-PAGE鉴定；B：GST-H-Siglec-15蛋白酶切反应液的Western blotting鉴定；1：GST-H-Siglec-15蛋白酶切前；2：GST-H-Siglec-15蛋白酶切后；M：180kDaMarker；

图9为兔血清效价的鉴定结果；

图10为放大50倍显微镜视野下的B细胞；

图11为H-Siglec-15抗体阳性B细胞的鉴定结果；

图12为抗体轻重链可变区DNA片段琼脂糖凝胶电泳图，其中，A：1-11：不同的B细胞轻链可变区片段扩增结果；12-22：不同的B细胞重链可变区片段扩增结果；B：1-11：不同的B细胞轻链可变区片段扩增结果；12-22：不同的B细胞重链可变区片段扩增结果；M：DL2000Marker；

图13为轻重链载体酶切结果，其中，1：未经酶切过的轻链表达载体质粒；2：酶切过的轻链表达载体质粒；3：未经酶切过的重链表达载体质粒；4：酶切过的重链表达载体质粒；M：DL 10000Marker；

图14为小量表达后得到的19株克隆抗体的效价鉴定热图；

图15为26H4抗体的SDS-PAGE鉴定结果图，其中，1：上清液；2：流穿液；3：清洗液；4：洗脱液；5：用不含β-ME的loadding buffer制的蛋白样；6：用含β-ME的loadding buffer制的蛋白样；M：180kDaMarker；

图16为抗体亲和力的鉴定结果；

图17为Western blotting中抗体检测293T-S15细胞中的H-Siglec-15蛋白结果，其中，A：Positive抗体稀释1000倍后在Western blotting中检测293T-S15细胞中的H-Siglec-15蛋白结果；B：26H4抗体稀释1000倍后在Western blotting中检测293T-S15细胞中的H-Siglec-15蛋白结果；WT：293T-WT细胞；S15：293T-S15细胞；M：180kDaMarker；

图18为流式细胞术中抗体检测293T-S15和RAW264.7细胞结果，其中，A：流式细胞术中抗体检测293T-S15细胞结果；B：流式细胞术中抗体检测RAW264.7细胞结果；

图19为免疫荧光中抗体检测293T-S15细胞中的H-Siglec-15蛋白的结果。

具体实施方式

为详细说明本申请可能的应用场景，技术原理，可实施的具体方案，能实现目的与效果等，以下结合所列举的具体实施例并配合附图详予说明。本文所记载的实施例仅用于更加清楚地说明本申请的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本申请的保护范围。

除非另有定义，本文所使用的技术术语的含义与本申请所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本发明中术语“人Siglec-15”是指具有来自人的氨基酸序列的Siglec-15蛋白。

本发明中术语“PBMC”指的是外周血单个核细胞(Peripheral Blood MononuclearCell)。

本发明中“VH”表示重链可变区，“VL”表示轻链可变区，“CDR”表示互补决定区。

本发明用到的试剂及其来源如表1所示。

表1主要试剂及其来源

本发明用到的主要仪器及其来源如表2所示。

表2主要仪器及其来源

本发明具体实施方式中用到的主要溶液的配制方法如下：

(1)卡那抗性溶液(100mg/mL)：用量筒量取30mL的超纯水至50mL烧杯中，加入3g的卡那抗性粉末，用玻璃棒搅拌均匀后用0.22μm的滤膜进行过滤，放入-20℃冰箱中保存。

(2)红细胞裂解液：用电子天平称量4.16g的NH

(3)抗体纯化A液：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入7.15g的Na

(4)抗体纯化B液：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入7.5g的甘氨酸，用玻璃棒搅拌均匀，调节pH为3.0，放入4℃层析柜中保存。

(5)1xPBS：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入0.3gKCl粉末、8.3g的NaCl粉末、0.26gKH

(6)GST洗脱液：用量筒量取50mL50mM Tris-HCl8.0至100mL烧杯中，加入0.154g还原性谷胱甘肽，用玻璃棒搅拌均匀后用0.22μm的滤膜进行过滤，放入4℃冰箱中保存。

(7)SDS-PAGE电泳液：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入3.1g的Tris-base粉末、14.5g的甘氨酸和1.0g的SDS，用玻璃棒搅拌均匀后在室温保存。

(8)转膜液：用量筒量取800mL的超纯水至1L的烧杯中，加入5.7g的Tris-base、2.8g的甘氨酸、0.36g的SDS和200mL的甲醇，用玻璃棒搅拌均匀后放入4℃层析柜中保存。

(9)TBST：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入8.7g的NaCl粉末、20mL1MTris-HCl8.0和500μL的Tween20，用玻璃棒搅拌均匀后在室温保存。

(10)IPTG(1mol/L)：在50mL离心管中加入5mL超纯水，再加入2.4g的IPTG粉末，充分溶解混匀后用0.22μm的滤膜进行过滤，放入-20℃冰箱中保存。

(11)Lysis BufferI：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入17.6g的NaCl粉末、6.1g的Tris-base粉末和1.4g的Imidazole粉末，用玻璃棒搅拌均匀，调节pH为8.0，再用0.22μm的滤膜过滤后放入4℃层析柜中保存。

(12)80mM咪唑洗脱液：150mM NaCl、25mM Tris-HCl8.0、80mM Imidazole、0.2mMPMSF和3mMβ-ME，调节pH为7.6后用0.22μm的滤膜过滤，放入4℃层析柜中保存。

(13)200mM咪唑洗脱液：150mM NaCl、25mM Tris-HCl、200mM Imidazole、0.2mMPMSF和3mMβ-ME，调节pH为7.6后用0.22μm的滤膜过滤，放入4℃层析柜中保存。

(14)10xTEV酶切buffer：500mM Tris-HCl、5mM EDTA、1％Tween-20、10mM DTT，调节pH为7.4后用0.22μm的滤膜过滤，放入4℃冰箱中保存。

(15)PBST：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入0.3g的KCl粉末、0.26gKH

(16)ELISA显色A液：用量筒量取1L的超纯水至1L的烧杯中，加入3.3g的柠檬酸粉末、27.3g的CHCOONa粉末和600μL的30％的H

(17)ELISA显色B液：用量筒量取900mL的超纯水至1L的烧杯中，加入1.8g的柠檬酸粉末、0.4g的Na

(18)ELISA终止液：用量筒量取400mL的超纯水至1L的烧杯中，再缓慢加入100mL的浓硫酸，用玻璃棒搅拌均匀后于室温下避光保存。

(19)1MHepes溶液：用量筒量取40mL超纯水至50mL烧杯中，加入11.9g的Hepes粉末，用玻璃棒搅拌混匀后调节pH为7.0，再用0.22μm的滤膜进行过滤，于-20℃冰箱中保存。

实施例1

H-Siglec-15

选择人的Siglec-15蛋白作为抗原。H-Siglec-15是一种膜蛋白，全长有328个氨基酸，蛋白大小为35kDa左右，其第20-263个氨基酸为蛋白的胞外区，也是蛋白的功能区，大小为27kDa左右。由于表达全长蛋白的难度较大，本实施例选择表达H-Siglec-15的胞外区蛋白，将人外周血单个核细胞(PBMC)的cDNA作为PCR的模板，扩增出H-Siglec-15蛋白胞外区的DNA序列后，使用Expi293真核表达系统来表达H-Siglec-15的胞外区蛋白。

1.1外周血单个核细胞(PBMC)的分离

使用Ficoll密度梯度离心法来分离血液中的PBMC细胞，步骤如下：

①将1640培养基和Ficoll放入37℃水浴锅中预热，预热完成后倒入10mL的Ficoll至50mL离心管中；②加入5mL新鲜血液和5mL1640培养基至50mL离心管中，用移液器吹匀；③将混匀好的溶液加至含有Ficoll的50mL离心管中，该步骤一定要慢，避免破坏血液和Ficoll的分层；④2000rpm离心10min，升降速调到最低档；⑤离心完毕后，离心管中的溶液会分为四层，其中最上层为血浆，最下层为红细胞和粒细胞，第二层为Ficoll，Ficoll下的白色浑浊层则是PBMC，将PBMC全部吸至1个新的15mL离心管中，加入5mL的1640培养基来洗涤细胞，2000rpm离心10min，弃掉培养基上清，重复两次；⑥往15mL离心管中加入适量的红细胞裂解液，静置2min，2000rpm离心5min，弃掉上清，加入2mL1640培养基来重悬细胞沉淀，离心1次以去掉含有红细胞裂解液的1640培养基，留下离心管底部的PBMC。

1.2PBMC的RNA提取与逆转

①加入900μL的Trizol至上一步含有PBMC的15mL离心管中，吹匀后用漩涡振荡器震荡，使细胞充分裂解，将Trizol溶液转移至1.5mL离心管中；加入200μL的氯仿至1.5mL离心管中，用漩涡振荡器震荡10s，静置10min，放入4℃离心机，12000rpm离心10min；③离心完毕后，离心管中的溶液会分为三层，RNA在上层上清中，小心吸取上清至干净的1.5mL离心管中；④加入与上清等量的异丙醇至1.5mL离心管中，上下颠倒混匀，静置10min，放入4℃离心机，12000rpm离心20min，弃掉上清；⑤往含有RNA沉淀的1.5mL离心管中加入1mL70％的乙醇，轻轻将RNA沉淀吹起，吹打几次后放入4℃离心机中，7500rpm离心5min，弃掉上清，重复2次；⑥弃掉多余的70％乙醇，打开离心管盖子，在室温静置5min，待70％乙醇挥发干净后，加入30μL的DPEC水，用超微量分光光度计NanoDrop2000C测量RNA的浓度；⑦往PCR管中加入4μL的4xgDNAwiperMix和1μg的RNA，用RNase-freeH

1.3 H-Siglec-15

为了确保H-Siglec-15蛋白的成功表达，现同时构建两种H-Siglec-15胞外区蛋白表达载体(H-Siglec-15-TEV-FC和GST-TEV-H-Siglec-15)。

(1)H-Siglec-15

扩增所需的引物和反应体系如表3和表4所示。

表3 H-Siglec-15

表4 PCR反应体系

将上述反应体系加至PCR管，吹打混匀后放入PCR仪中，设置反应程序为98℃5min、98℃10s、58℃5s、72℃30s、35个循环、72℃10min。反应完成后，将PCR产物放入4℃冰箱中保存。

(2)PCR产物的鉴定及纯化回收

加入1μL的100xGelRed染料、1μL的Loading buffer和2μL的PCR产物至PE手套上，用移液枪吹打混匀后上样至现配的1％琼脂糖凝胶孔中，将电泳仪的参数设置为200V10min。电泳完毕后，使用凝胶成像仪进行拍照。扩大琼脂糖凝胶电泳体系，使用OMEGA的Gel&PCRCleanUpKitD2000对PCR产物进行割胶回收，具体步骤如下：①用小刀将含有目的条带的胶切下来后放在滤纸上，去除多余的电泳液，将胶切碎，放入1.5mL离心管中；②往1.5mL离心管中加入550μL的XP5buffer，上下颠倒混匀，放入55℃的金属水浴锅中，10min后将离心管从金属水浴锅中取出，期间上下颠倒几次；③待溶液恢复至室温后，取700μL离心管中的溶液至DNAXScolumn柱中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，重复该步骤直至1.5mL离心管中的溶液都转移至收集管中，弃掉废液；④往柱中加入650μL的DNA agarosesolution，静置2min，12000rpm离心1min，弃掉废液，重复该步骤1次；⑤弃掉收集管，将柱子插到一个干净的1.5mL离心管中，打开盖子，自然烘干10min后加入30μL的洗脱液，静置5min，12000rpm离心1min，用Nano Drop2000C测量收集管液体中的DNA片段浓度，放入-20℃冰箱中储存。

(3)蛋白表达载体质粒的提取

使用天根的去内毒素小提中量试剂盒来提取带FC和GST标签的两种蛋白表达载体质粒，具体步骤如下：①从-80℃冰箱中取出含有质粒的甘油菌，化冻后取200μL菌液至含有10mLLB培养基的试管中，放入37℃、220rpm的摇床中培养；②将过夜培养的菌液转移至15mL离心管中，3200rpm离心10min后弃掉培养基上清，留下离心管底部的菌；③加入500μL的溶液BL至CP4柱中，12000rpm离心1min，弃掉废液；④往15mL离心管中加入550μL的溶液P1(已加入RNaseA)，吹打混匀后用漩涡振荡器震荡，将重悬后的菌液转移至2mL的离心管中；⑤加入550μL的溶液P2至2mL离心管中，上下颠倒8次，再加入550μL的溶液P4，上下颠倒混匀，此时可看到白色絮状沉淀，静置8min，12000rpm离心10min；⑥离心完毕后，在2mL的离心管中会出现分层，取700μL上清至过滤柱CS柱中，12000rpm离心1min，将收集管中的液体转移至2mL的离心管中，重复1次；⑦往2mL离心管中加入400μL的异丙醇，上下颠倒混匀，取700μL离心管中的溶液至CP4吸附柱中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，重复2次；⑧加入500μL的去蛋白液PD至CP4柱中，静置2min，12000rpm离心1min，弃掉废液；⑨往CP4柱中加入650μL的漂洗液PW，静置3min，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，重复1次，12000rpm离心3min，以去除残留的漂洗液PW；⑩离心完毕后弃掉收集管，将CP4柱插到一个干净的1.5mL离心管中,打开盖子，室温静置10min，加入35μL预热过的洗脱液，静置5min，12000rpm离心1min，用NanoDrop 2000C测量收集管液体中的质粒浓度，放入-20℃冰箱中储存。

(4)蛋白表达载体质粒的酶切

使用NheI和NotI这两种酶对两种蛋白表达载体进行酶切，体系如表5所示：

表5质粒酶切体系

往1.5mL离心管中加入上述反应体系，吹打混匀，放入37℃水浴锅中。反应20min后对酶切产物进行割胶纯化回收，具体步骤参照(2)PCR产物的鉴定及纯化回收。

(5)H-Siglec-15 DNA片段与载体的连接

在扩增出的H-Siglec-15DNA片段中含有载体的同源臂序列以及NheI、NotI这两种酶的酶切位点，因此可使用同源重组的方法进行连接。使用

表6 DNA片段与载体连

将上述体系加至PCR管，放入PCR仪中，设置反应程序为50℃15min。反应完毕后，将PCR管插在冰上，待连接产物冷却至4℃时进行转化。

(6)连接产物的转化与单克隆菌落的挑取

①从-80℃的冰箱中取出感受态Trans1-t1。待其在冰上融化后，将20μL连接产物加至100μL感受态中，用移液枪来回吹打混匀，冰浴35min，于42℃水浴锅中热激1min30s；②热激完毕后立即插在冰上，冰浴2min。加入550μL无抗性的LB培养基至1.5mL离心管中，放入37℃、220rpm的摇床中培养；③培养2h后，吸取60μL的菌液至含有卡那抗性的LB固体平板中，用涂布棒涂布均匀，倒置平板，放入37℃的培养箱中培养；④过夜培养后，平板中会长出单克隆菌落，用10μL的枪尖从板中挑取5-6个单克隆菌落至含有500μLLB培养基的1.5mL离心管中，放入摇床中培养；⑤培养3h后，取200μL菌液送去测序，将测序正确的菌加入适量的甘油后放入-80℃冰箱中保存。

请参照图1所示的H-Siglec-15胞外区DNA片段琼脂糖凝胶电泳结果；其中1-5泳道为扩增出的H-Siglec-15胞外区DNA片段；泳道M为：DL2000Marker。从中可见本实施例成功扩增出了大小为730bp左右的H-Siglec-15胞外区(aa20-263)DNA片段。

在扩增出的DNA片段中，含有载体质粒的同源臂序列，使用同源重组的方法进行DNA片段与蛋白表达载体质粒的连接。转化后挑取的菌单克隆测序结果，请参阅图2，显示Siglec-15胞外区DNA片段已与载体质粒成功连接，这意味着本实施例成功构建了H-Siglec-15-TEV-FC和GST-TEV-H-Siglec-15。

1.4 H-Siglec-15

(1)大提质粒

使用Expi293真核表达系统表达蛋白时需要大量的质粒，这里使用的大提质粒Kit为天根的去内毒素大提试剂盒，具体步骤如下：①加入300μL的菌液至含有200mLLB培养基的500mL锥形瓶中，放入37℃、220rpm的摇床中培养，培养16h后将菌液转移至500mL的离心管中，8000rpm离心5min，尽量去除多余的LB培养基上清；②往CP6柱中加入2.5mL的溶液BL，8000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液；③用移液器吸取10mL的溶液P1(已加入RNaseA)至500mL的离心管中，吹匀离心管底部的菌液，使用漩涡振荡器震荡30s，以彻底重悬菌液；④加入10mL的溶液P2，上下颠倒8次，静置5min，再加入10mL的P4，上下颠倒混匀，此时可看到白色絮状沉淀，静置8min，8000rpm离心10min；⑤离心完毕后，500mL离心管中会出现上清和沉淀两种分层，将上清倒入过滤柱CS1柱中，缓慢推动推柄进行过滤，收集过滤好的上清至50mL离心管中；⑥往50mL离心管中加入0.3倍上清体积的异丙醇，上下颠倒8次混匀；⑦用移液器吸取10mL混匀液至CP6柱中，8000rpm离心2min，重复2次；⑧加入10mL的漂洗液PW至CP6柱中，8000rpm离心2min，重复1次；⑨往CP6柱中加入3mL的无水乙醇，8000rpm离心5min，以去除残留的无水乙醇；⑩将CP6柱插到一个干净的收集管中，打开盖子，室温静置10min，加入1mL预热的洗脱液，静置5min，8000rpm离心2min，用NanoDrop2000C测量收集管液体中的质粒浓度，放入-20℃冰箱中储存。

(2)Expi293细胞的培养与转染

Expi293细胞是一种改造过的293细胞，与293T细胞相比，其在瞬时转染后蛋白表达量更高。以下是Expi293细胞的培养和转染步骤：①Expi293细胞保存在-160℃的液氮罐中，取出装有细胞的冻存管，放入37℃的水浴锅中；②待细胞完全融化后，将冻存管放入离心机中，1200rpm离心5min，弃掉上清，加入1mL OPM-CD05培养基，用移液枪吹打混匀后将细胞接种至含有15mLOPM-CD05培养基的50mL细胞摇瓶中，放入37℃、8％CO

H-Siglec-15-FC蛋白理论大小为27kDa+26kDa＝53kDa，但该蛋白在真核表达的过程中会形成类似抗体的多聚体(200kDa左右)，使用DTT处理蛋白后可以打破这种多聚体结构。GST-H-Siglec-15蛋白则不会出现这种情况，其大小为27kDa+27kDa＝54kDa。在转染Expi293细胞后，取1mL第3天至第6天的细胞上清，制成蛋白样，使用SDS-PAGE和Westernblotting的方法来鉴定细胞上清中是否含有H-Siglec-15-FC蛋白。图3的结果显示，随着表达天数的不断增加，细胞上清中的H-Siglec-15-FC蛋白含量也在不断上升，表明本实施例成功表达了H-Siglec-15-FC蛋白。

1.5H-Siglec-15(aa20-263)蛋白的纯化与鉴定

H-Siglec-15-FC和GST-H-Siglec-15蛋白的N端带有一个IL-2信号肽，因此这2种蛋白从Expi293细胞中表达出来后会被分泌至细胞上清中。转染7天后，Expi293细胞的活率会从最初的90％下降至70％左右，此时可对细胞上清中的蛋白进行纯化。H-Siglec-15-FC和GST-H-Siglec-15蛋白所带的标签不同，使用的蛋白纯化方法也是不同的。FC标签可与Protein A Resin FF结合，故使用ProteinAResin FF来纯化H-Siglec-15-FC蛋白，GST标签可与GST Resin结合，所以使用GST Resin来纯化GST-H-Siglec-15蛋白。

(1)H-Siglec-15-FC蛋白的纯化

①将200mL含有H-Siglec-15-FC蛋白的细胞培养基倒入500mL离心管中，8000rpm离心10min，收集细胞上清，使用0.22μm的滤膜进行过滤，放入4℃层析柜中；②取出一根新的重力柱，在其下端接上一个阀门，这可以控制重力柱的流速，往重力柱中加入5mL的ProteinAResin FF填料，再加入1个柱体积的抗体纯化A液来冲洗填料，重复3次；③往细胞上清中加入200mL的抗体纯化A液，上下颠倒混匀，加至重力柱中，控制阀门的流速为6s一滴；④待上清全部过完柱后，加入1个柱体积的抗体纯化A液来冲洗填料，此时阀门流速可调到最大，重复3次；⑤准备一个含有20mL中和液(Tris-HCl8.0)的50mL离心管，加入20mL的抗体纯化B液至重力柱中，控制阀门流速为6s一滴，收集流穿液至50mL离心管中，在收集的过程中，应不断晃动离心管；⑥B液全部流穿后，加入1个柱体积的抗体纯化A液来冲洗填料，重复2次，再往重力柱中加入1个柱体积的20％乙醇，盖好盖子，以便下次使用；⑦将50mL离心管中的溶液倒入30kDa的超滤管中，3000rpm离心30min，弃掉收集管中的废液；⑧往超滤管中加入15mL的PBS，放入4℃离心机中，3000rpm离心15min；⑨用移液枪吸取超滤管中的蛋白溶液至干净的1.5mL离心管中，加入适量甘油，用NanoDrop2000C测量蛋白浓度，放入-80℃冰箱中保存，使用过的浓缩管应用超纯水冲洗几次，并浸没在20％的乙醇中，以便下次使用。

(2)GST-H-Siglec-15蛋白的纯化

①将200mL表达GST-H-Siglec-15蛋白的细胞培养基倒入500mL离心管中，8000rpm离心10min，收集细胞上清，使用0.22μm的滤膜过滤后放入4℃层析柜中；②取出一根新的重力柱，在其下端接上一个阀门，往重力柱中加入5mL的GST Resin填料，再加入1个柱体积的PBS(已在4℃预冷)来冲洗填料，重复3次；③往细胞上清中加入200mL的PBS，上下颠倒混匀后加到重力柱中，控制阀门的流速为6s一滴；④待上清全部过完柱后，加入1个柱体积的PBS来冲洗填料，此时阀门流速可调到最大，重复3次；⑤加入20mL的GST洗脱液至重力柱中，控制阀门流速为6s一滴，让流穿液滴至50mL离心管内；⑥洗脱液全部流穿后，加入1个柱体积的PBS来冲洗填料，重复2次，往重力柱中加入1个柱体积的20％乙醇，盖好盖子，以便下次使用；⑦将50mL离心管中的溶液倒入10kDa的超滤管中，3000rpm离心30min，弃掉收集管中的废液；⑧往超滤管中加入15mL的PBS，放入4℃离心机中，3000rpm离心15min；⑨用移液枪吸取超滤管中的蛋白溶液至干净的1.5mL离心管中，加入适量甘油，用NanoDrop2000C测量蛋白浓度，放入-80℃冰箱中保存，使用过的浓缩管应用超纯水冲洗几次，并浸没在20％的乙醇中，以便下次使用。

(3)蛋白胶的配制

使用雅酶公司的SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒来配制10％的蛋白胶，操作步骤如下：①将制胶的玻璃板和1.0mm的梳子用水洗干净后放入烘箱中烘干，用夹子夹紧玻璃板，放在制胶架上；②加入2.7mL的下层胶溶液、2.7mL的下层胶缓冲液以及60μL的改良型促凝剂至15mL离心管中，使用漩涡振荡器充分震荡离心管；③用移液枪吸取1mL的下层胶混合液，注入玻璃板的缝隙中，该过程要避免产生气泡；④在加入4.5mL的下层胶后用异丙醇来压平，待下层胶凝固时，弃去多余的异丙醇；⑤加入750μL的上层胶溶液、750μL的上层胶缓冲液以及15μL的改良型促凝剂至15mL离心管中，使用漩涡振荡器充分震荡离心管；⑥用移液枪吸取1mL的上层胶混合液，注入玻璃板的缝隙中，垂直插入梳子，待上层胶凝固后，用水将玻璃板周围清洗干净，配制好的蛋白胶应储存在电泳液中。

(4)蛋白的SDS-PAGE鉴定

①往PCR管中加入10μL的5xloadingbuffer和40μL纯化的蛋白样品，放入PCR仪中，设置反应程序为99.9℃10min。反应完毕后，放入-20℃冰箱中保存；②用夹子将蛋白胶加紧，放入电泳槽，分别往内槽和外槽中倒入适量的电泳液，拔出梳子，加入10μL制好的蛋白样至上样孔中，按照“黑对黑，红对红”的顺序盖上带有电极的帽子，将电泳仪的参数设置为120V70min，启动电泳仪；③电泳完毕后，小心拆开玻璃板，将其中的蛋白胶放入可加热的盒子中，倒入适量的考马斯亮蓝染色液，使其能刚好没过蛋白胶，放置在水平摇床上进行染色；④染色15min后，回收考马斯亮蓝染色液，往盒子中加入适量的脱色液，放置在水平摇床上进行脱色；⑤过夜脱色后，使用凝胶成像系统对蛋白胶进行拍照并记录。

(5)蛋白的Western blotting鉴定

①用夹子将蛋白胶夹紧后放入电泳槽，分别往内槽和外槽中倒入适量的电泳液，拔出梳子，加入10μL制好的蛋白样至上样孔中，按照“黑对黑，红对红”的顺序盖上带有电极的帽子，将电泳仪的参数设置为80V20min、120V1h，启动电泳仪；②转膜：电泳完毕后，小心拆开玻璃板，取出里面的蛋白胶，按照从下往上为“海绵-滤纸-蛋白胶-PVDF膜-滤纸-海绵”的顺序，将湿转夹装成一个“三明治”的结构；③将湿转夹放置在装膜槽中，设置电泳仪参数为100V60min，启动电泳仪；④转膜完毕后，用镊子把“三明治”中的PVDF膜取出，放入事先装好TBST的盒子中，在水平摇床上清洗3min，加入10mL的封闭液(5％的BSA)，封闭2h；⑤倒掉封闭液，用TBST洗3次，加入10mL的一抗(Siglec-15抗体：5％BSA＝1：1000)，放入4℃层析柜中的摇床上；⑥过夜孵育一抗后，回收抗体，加入TBST，在水平摇床上清洗5min，洗3次后加入10mL的二抗(1：10000TBST)，放入水平摇床上孵育2h；⑦回收二抗，加入TBST，在水平摇床中清洗15min，洗3次后用双色红外激光成像仪进行扫膜。

在转染7后收集细胞上清，使用ProteinA柱来纯化上清中的H-Siglec-15-FC蛋白，取少量蛋白制成蛋白样后进行SDS-PAGE鉴定。从图4显示的结果中可以看出本实施例成功纯化出了H-Siglec-15-FC蛋白(泳道9)。在纯化出的蛋白样品中加入DTT后，H-Siglec-15-FC蛋白变成了53kDa。

同样，在转染7天后使用GST Resin对细胞上清中的GST-Siglec-15蛋白进行纯化，取少量蛋白制成蛋白样后进行SDS-PAGE鉴定和Westernblotting进行鉴定。从图5的结果中可以看到本实施例成功表达出了54kDa左右的GST-H-Siglec-15蛋白。

(6)TEV蛋白酶的表达

在表达的融合蛋白中，H-Siglec-15蛋白和标签之间含有TEV酶切位点，因此可使用TEV蛋白酶来去除H-Siglec-15蛋白上的标签。本发明使用原核表达系统来表达TEV蛋白酶，具体步骤如下：①从-80℃冰箱中取出含有表达TEV蛋白酶质粒的甘油菌，化冻后用移液枪吸取200μL菌液至含有10mLLB培养基的试管中，放入37℃、220rpm的摇床中培养；②过夜培养后，将这10mL菌液全部接种到含有1L抗性为卡那的LB培养基的锥形瓶中，放入37℃、220rpm的摇床中培养，培养3h后，菌的OD600值可达到0.6-1.0左右，将菌放入4℃层析柜中，待温度降至18℃左右时加入500μL浓度为1mol/L的IPTG，放入18℃、220rpm的摇床中培养。③培养16h后，将菌倒入500mL的离心管中，5000rpm离心15min，弃掉上清；④往500mL离心管中加入20mL的Lysis BufferI，用移液器将菌液吹打混匀后，再用漩涡振荡器震荡30s，将菌液倒入50mL的小烧杯中，插在冰上，放入超声破碎仪中进行破碎，超声破碎仪设置的参数为30％功率，工作5s，间隔8s；⑤30min后取出菌液，倒入超速离心管中，12000rpm，4℃离心1h，收集上清至干净的50mL离心管中，再用0.22μm的滤膜过滤；⑥用移液枪吸取5mLNi填料，洗去残留的酒精后加至上清中，放入层析柜的摇床上；⑦孵育2h后，将含有填料的上清倒入重力柱中，将阀门开打最大，收集流传液，待上清都流穿后，加入3个柱体积的Lysis BufferI，以洗去残留的上清；⑧分别用2个柱体积的80mM咪唑洗脱液和200mM咪唑洗脱液来洗脱柱子，收集洗脱液；⑨往重力柱中加入1个柱体积的20％乙醇，盖好盖子，以便下次使用；⑩将各个阶段中收集的样品制成蛋白样品后进行SDS-PAGE鉴定，具体步骤参照(4)蛋白的SDS-PAGE鉴定。

(7)融合蛋白的酶切

使用TEV蛋白酶来酶切H-Siglec-15-FC和GST-H-Siglec-15蛋白，酶切体系如表7所示。

表7蛋白酶切体系

在1.5mL离心管中配好上述体系，用移液枪吹打混匀几次，放入4℃层析柜的摇床中。过夜酶切后，将Siglec-15-FC蛋白液加至含有Protein A填料的重力柱中，收集流穿液，再加到Ni柱中，这样可以去除未切掉标签的Siglec-15-FC蛋白和TEV蛋白酶，此时Ni柱的流穿液即为不含标签的H-Siglec-15蛋白。同理，将过夜酶切后的GST-Siglec-15蛋白液加至含有GST Resin的重力柱和Ni柱中，以去除未切掉标签的GST-Siglec-15蛋白和TEV蛋白酶。将各个阶段中收集到的样品制成蛋白样，用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。

TEV蛋白酶可识别并切割H-Siglec-15-FC和GST-H-Siglec-15蛋白中的TEV酶切位点，从而将H-Siglec-15蛋白和标签分离。本实施例使用原核表达系统来表达TEV蛋白酶。图6的结果显示本实施例成功表达并纯化出了TEV蛋白酶(泳道6)。

使用TEV蛋白酶过夜酶切H-Siglec-15-FC和GST-H-Siglec-15蛋白，将酶切反应液反挂柱，收集流穿液，取少量样品进行SDS-PAGE和Western-Blot鉴定。从图7的结果中可以看到H-Siglec-15-FC蛋白在酶切后从原来的200kDa(图7泳道1)变成了30kDa(图7泳道3)左右，这说明本实施例成功切开了H-Siglec-15-FC蛋白。GST-H-Siglec-15蛋白在酶切后从原来的55kDa(图8泳道1)变成了30kDa(图8泳道2)左右，这意味着本实施例成功切开了GST-H-Siglec-15蛋白，并且从Western blotting的结果(图8B)中可以看出酶切效率是比较高的。

实施例2单个B细胞抗体制备技术来制备Siglec-15的兔单克隆抗体

2.1新西兰公兔的免疫

将DTT处理过的H-Siglec-15-FC蛋白与佐剂混匀后采用皮下注射的方式来免疫兔子：选取年龄在3个月内，体重为3kg左右的新西兰公兔为免疫对象；在免疫前对兔子耳朵剃毛、消毒后用注射器采取600μL的静脉血，待血凝固，3000rpm离心10min，收集上层的血清，放入-80℃冰箱中保存；采用皮下多点注射的方式来免疫新西兰公兔，每个位点注射0.1mg的蛋白；每两周免疫一次兔子，一共免疫三次，在第三次免疫时将免疫的蛋白量提升为0.7mg，每次免疫前取600μL的静脉血，分离出血清后放入-80℃冰箱中保存。

2.2ELISA鉴定血清效价

将兔子血清作为ELISA中的一抗来检测Siglec-15蛋白，这可以用来判断兔子在免疫完后是否产生了针对H-Siglec-15的抗体。在免疫兔子前取静脉血，分离出血清后按1：10

2.3B细胞的分离

免疫3次后，兔的体内已含有大量能产生H-Siglec-15的记忆B细胞，对兔子进行心脏采血，提取PBMC(参照实施例1中1.1外周血单个核细胞PBMC的分离)。用磁珠分选的方法分离出能产生Siglec-15抗体的记忆B细胞：使用

2.4阳性B细胞的鉴定

将B细胞有限稀释至96孔板中，使每个孔只含有单个B细胞，再用ELISA的方法鉴定出阳性B细胞孔；图11展示除了其中2块96孔板的结果，其中酶标仪的读值结果以热图的形式呈现。将OD

提取阳性B细胞的RNA，逆转录成cDNA，作为PCR的模板来进行扩增。不同B细胞产生的抗体可变区序列是不同的，其针对的抗原位点也不同。要制备出不同的抗体，最重要的就是要获得不同的抗体可变区序列。通过PCR的方法来扩增抗体轻重链的可变区序列，具体步骤如下：只经过一轮PCR扩增出来的产物量很少，而且容易产生突变，选用巢式PCR的方法来扩增抗体轻重链的可变区序列，即将第一轮的PCR产物作为第二轮的PCR模板，用巢式PCR的方法调取抗体的轻重链可变区片段，请参阅图12所示的部分PCR结果；巢式PCR引物、巢式PCR第一轮反应体系和巢式PCR第二轮反应体系分别如表8、表9和表10所示。

表8巢式PCR引物

表9巢式PCR第一轮反应

在PCR管中加入上述反应体系，用移液枪吹打混匀后放入PCR仪中，设置反应程序为98℃5min、98℃10s、58℃5s、72℃30s、35个循环、72℃10min。反应完成后，将PCR产物放入4℃冰箱中保存。

表10巢式PCR第二轮反应

在PCR管中加入上述反应体系，用移液枪吹打混匀后放入PCR仪中，设置反应程序为98℃5min、98℃10s、58℃5s、72℃30s、35个循环、72℃10min。反应完成后，将PCR产物放入4℃冰箱中保存。取少量二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增出正确的轻重链可变区条带后进行割胶纯化回收，将纯化出的轻重链可变区片段送去测序。

2.5抗体表达载体的构建

将调取的轻重链可变区片段构建至含有兔轻重链恒定区的轻重链表达载体上，轻链表达载体含有兔轻链恒定区，重链表达载体则含有兔重链恒定区。小量表达克隆抗体；在扩增出的轻重链片段中含有载体的同源臂以及EcoRI和Eco91I这两种酶的酶切位点，因此可使用同源重组的方法进行连接。

使用EcoRI和Eco91I两种酶去酶切轻重链表达载体质粒时，切开的片段很小(20bp左右)，因此在DNA胶图中并不能很直观地看出质粒是否被切开。质粒酶切后会变成线性结构，在琼脂糖凝胶电泳过程中，线性化的质粒在DNA胶中的移动速度会比未经酶切的环状质粒慢。将原始质粒与酶切过的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，以判断质粒是否被切开。如图13所示，酶切过的轻链表达载体质粒(泳道2)在琼脂糖凝胶电泳中的移动速度比未经酶切的质粒(泳道1)慢，同样酶切过的重链表达质粒(泳道4)的移动速度也比未经酶切过的重链表达质粒(泳道3)慢，这说明本实施例成功切开了轻重链表达载体质粒。

2.6抗体的小量表达于ELISA鉴定

提取所有成功构建的抗体轻重链表达载体质粒，将轻重链表达质粒配对后使用Expi293真核表达系统来小量表达抗体。使用ELISA对抗体进行鉴定，将其作为ELISA中的一抗来检测H-Siglec-15蛋白，酶标仪的读值结果在这里以热图的形式呈现(图14)。其中，B9为细胞上清，B10为阳性兔子血清，B11为阳性对照。从图中可以看到OD

表11 26H4抗体的CDR3氨基

2.7抗体的大量表达与纯化

大量表达OD450值大于1.0的抗体，具体步骤参照第一章Expi293细胞的培养与转染。大量表达纯化26H4这株抗体后，取少量抗体样品，分别用不含β-ME的蛋白loaddingbuffer和含β-ME的loadding buffer将其制成两种蛋白，进行SDS-PAGE鉴定。从图15中可以看到26H4抗体(泳道5)的大小为正常抗体的大小(150kDa左右)。β-ME可以打断抗体中的二硫键，轻链和重链因此会分开。可以看到在loadding buffer中加入β-ME后，26H4抗体(泳道6)含有50kDa左右大小的重链和25kDa左右大小的轻链，这说明制备的26H4抗体是完整的。

实施例3

H-Siglec-15抗体的功能活性鉴定

3.1抗体亲和力的测定

抗体的相对分子量大小约为150kDa，据此可以将抗体浓度(mg/mL)换算成摩尔数，即1mg/mL的抗体在稀释66倍后的摩尔浓度为0.1nM。用PBS分别将商业化的Siglec-15抗体(雅吉生物的Siglec-15抗体，YS162205)和本发明制备的26H4抗体稀释(使用TBST)成0.1nM、0.01nM、0.001nM和0.0001nM后，作为ELISA中的一抗来检测H-Siglec-15蛋白。测量出的OD

3.2抗体特异性的鉴定

将26H4抗体用作Western blotting、flow cytometry(FCM)和immunofluorescence(IF)中的一抗，这可以用来判断本发明制备的抗体是否能成功识别并结合人和鼠的Siglec-15蛋白。

(1)抗体对蛋白的特异性识别

使用5％的BSA将26H4抗体稀释1000倍后，作为Westernblotting中的一抗来检测293T-S15细胞中的H-Siglec-15蛋白。结果如图17所示，使用雅吉生物的Siglec-15抗体(Positive)去孵育PVDF膜时(图17A)，出现了很多杂带，这可能与该抗体为多克隆抗体有关。相反，使用本发明制备的26H4(图17B)抗体去孵育PVDF膜时，均孵出了单一的目的条带(35kDa)。从以上结果可以看出本发明制备的26H4抗体可在293T-S15细胞的总蛋白中识别并结合H-Siglec-15蛋白，并且特异性要比该商业化的Siglec-15抗体强。

(2)抗体对细胞表面蛋白的特异性识别

Siglec-15蛋白是一种膜蛋白。293T细胞在过表达人的Siglec-15基因后，Siglec-15蛋白会分布在细胞膜表面。使用Siglec-15抗体孵育293T-S15细胞后，抗体会与细胞膜上的Siglec-15蛋白结合，再用带有荧光标记的二抗去结合Siglec-15抗体，这样293T-S15细胞便可被流式细胞仪识别出。在RAW264.7细胞中，Siglec-15蛋白的表达量较高，因此也可用Siglec-15抗体对其进行标记。请参阅图18A，该结果显示，使用26H4抗体去孵育293T-S15细胞时，流式分析出的过表达人Siglec-15蛋白的293T细胞数量占293T细胞总数的93.20％，这与雅吉生物的Siglec-15抗体(Positive)的结果(97.11％)非常接近。此外，使用26H4抗体去孵育RAW264.7细胞时(请参阅图18B)，流式分析出的表达鼠Siglec-15蛋白的RAW264.7细胞数量占RAW264.7细胞的总数的26.49％，与该商业化的Siglec-15抗体的结果(83.73％)具有显著性差异，这说明本发明制备的26H4抗体对鼠Siglec-15蛋白的结合力并不强，或许是因为人和鼠的Siglec-15抗原位点有所不同。

(3)抗体的免疫荧光分析用于细胞定位

分别使用雅吉生物的Siglec-15抗体和本发明制备的26H4抗体孵育293T-S15细胞，用带红光的二抗对细胞标记后，在共聚焦显微镜下观察。从图19中可以看到，使用本发明制备的26H4抗体去孵育293T-S15细胞时，可在共聚焦显微镜中看到细胞膜上带红光的H-Siglec-15蛋白。相反，该商业化的抗体不能用于免疫荧光分析，孵育雅吉生物的Siglec-15抗体(Positive)的293T-S15细胞同293T-WT一样，并不能在共聚焦显微镜中看到带红光的H-Siglec-15蛋白。

综上，从ELISA的结果中可以看到，本发明制备的26H4抗体在结合H-Siglec-15蛋白的能力方面与商业化的Siglec-15抗体非常接近。Western blotting、Flowcytometry的结果表明，26H4抗体可同时识别并结合人和鼠Siglec-15的蛋白，并且在WB中识别人Siglec-15蛋白的能力方面，26H4抗体的特异性要比该商业化的Siglec-15抗体强。此外，与雅吉生物的Siglec-15抗体有所不同，本发明制备的26H4抗体可在Immunofluorescence中使用。

最后需要说明的是，尽管在本申请的说明书文字及附图中已经对上述各实施例进行了描述，但并不能因此限制本申请的专利保护范围。凡是基于本申请的实质理念，利用本申请说明书文字及附图记载的内容所作的等效结构或等效流程替换或修改产生的技术方案，以及直接或间接地将以上实施例的技术方案实施于其他相关的技术领域等，均包括在本申请的专利保护范围之内。