一株产刺五加苷E的刺五加内生真菌HASZ1及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株产刺五加苷E的刺五加内生真菌HASZ1及其应用。

背景技术

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax seuticosus(Rupr.et Maxim.)Harms。其干燥根、根茎或茎，具有抗肿瘤、抗抑郁、抗疲劳、增强免疫力、改善睡眠、调节血压、降血糖等多种生物活性，由于需求量的增加及盲目采挖使得刺五加资源急剧下降，现为国家三类濒危保护植物。

刺五加苷E是刺五加的有效成分，也是刺五加质量分析的指标性成分之一，具有抗疲劳，提高机体适应能力，改善血液循环，双向调节血压等作用。因此在医药行业具有广阔的应用前景。

目前，刺五加苷E的获取主要是以刺五加植物为原料，采用柱色谱法进行提取分离，但经过多次分离纯化操作后其产率较低，且植物资源消耗较大。因此，扩大刺五加苷E的获取渠道尤为重要。

发明内容

本发明是要解决现有获得刺五加苷E的生产方法存在严重消耗植物资源的问题，提供一株产刺五加苷E的刺五加内生真菌HASZ1及其应用。

本发明提供一株产刺五加苷E的刺五加内生真菌HASZ1，它为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)HASZ1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2023年8月11日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231448。

本发明刺五加内生真菌HASZ1的菌落呈白色，菌丝疏松，基质呈橘黄色。

将本发明刺五加内生真菌HASZ1的ITS rDNA序列提交至NCBI数据库，BLAST分析并进行比对，使用MEGA7软件对刺五加内生真菌HASZ1序列同源性较高的菌株序列进行分析，刺五加内生真菌HASZ1与Fusarium avenaceum(MT463390)的相似性达到了100％。将刺五加内生真菌HASZ1鉴定为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)。

本发明还提供刺五加内生真菌HASZ1在发酵产刺五加苷E中的应用。

进一步的，所述发酵方法为：在无菌条件下挑取菌丝接种于PDB培养基中，于25～28℃、120～140r/min条件下摇床振荡培养2～3d，制成1×10

本发明还提供刺五加内生真菌HASZ1在制备抗氧化药物中的应用。

进一步的，当刺五加内生真菌HASZ1发酵液浓度为100μg·mL

进一步的，当刺五加内生真菌HASZ1发酵液浓度为100μg·mL

本发明的有益效果：

本发明在刺五加中分离出一株刺五加内生真菌HASZ1，经鉴定为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)。该菌株具有良好的抗氧化活性，当刺五加内生真菌HASZ1发酵液浓度为100μg·mL

本发明的刺五加内生真菌HASZ1能够发酵产刺五加苷E。采用刺五加内生真菌HASZ1发酵法生产刺五加苷E，能够节省植物资源，同时也为刺五加苷E的生产提供新的方法，发酵方法反应条件温和，利于规模化生生产。因此，刺五加内生真菌HASZ1具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明刺五加内生真菌HASZ1的菌落形态图；

图2为本发明刺五加内生真菌HASZ1的菌丝形态图；

图3为本发明刺五加内生真菌HASZ1的系统发育树；

图4为刺五加内生真菌HASZ1发酵液对DPPH自由基的清除能力；

图5为刺五加内生真菌HASZ1发酵液对·OH自由基的清除能力；

图6为刺五加内生真菌HASZ1发酵液HPLC分析结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

本实施例产刺五加苷E的刺五加内生真菌HASZ1为燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)HASZ1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2023年8月11日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231448。

本实施例刺五加内生真菌HASZ1的获取方法为：

取健康五加科植物刺五加Acanthopanax seuticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的种子(此刺五加采自黑龙江省庆安县)，表面消毒，消毒程序：将种子在75％酒精中浸泡30s，然后无菌水洗，再置于次氯酸钠中漂洗6min，用无菌水洗，接着用75％酒精浸泡30s，最后用无菌水洗三次。

用无菌手术刀将消毒后的种子从中间切开，切面置于MS培养基中，于25℃～28℃恒温培养5～7d。

取消毒程序最后一次无菌水洗液，涂布接种于MS培养基中。并将消毒后不切块的实验材料置于MS培养基上，滚动一圈后取出，作为对照。同内生真菌分离培养基共同培养。

MS培养基的制法：称取10g琼脂边搅拌边加入1L沸水中，然后依次加入4.42gMS，30g蔗糖，待其完全溶解后，再加入0.2mL6-BA、0.2mLNAA，调pH为5.8～6.2，分装、灭菌(121℃，0.1MPa，30min)、放冷备用。

从刺五加种子中分离得到内生真菌HASZ1，阴性对照平板和阴性对照液培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，从而证明所分到的菌是刺五加内生真菌。

实施例2：刺五加内生真菌HASZ1的鉴定

采用菌落及孢子形态学观察及ITS rDNA序列分析法进行菌株鉴定。

刺五加内生真菌HASZ1的菌落形态图如图1所示，菌丝形态图如图2所示。刺五加内生真菌HASZ1的菌落呈白色，菌丝疏松，基质呈橘黄色。

将本发明刺五加内生真菌HASZ1的ITS rDNA序列(532bp)提交至NCBI数据库，BLAST分析并进行比对，使用MEGA7软件构建内生真菌HASZ1的系统发育树，如图3所示。刺五加内生真菌HASZ1与Fusarium avenaceum(MT463390)的相似性达到了100％。将刺五加内生真菌HASZ1鉴定为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)。

刺五加内生真菌HASZ1的ITS rDNA序列如下：

GCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTTAATGTTGCCTCGGCGGATCA

GCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCAAACTCTAATGTTTCTTATTGTAACTTCTGAGTAAAA

CAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAA

GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCTGGTATTCCGGCGGGCAT

GCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCTCTGCCTTCTGGCGGTGCCG

CCCCCGAAATACATTGGCGGTCTCGCTGCAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAACGCGGCGCG

GCCATGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT

实施例3：刺五加内生真菌HASZ1的抗氧化活性分析

内生真菌HASZ1活化：取内生真菌HASZ1，于无菌条件下接种至PDA培养基的表面上，25℃恒温培养3d，备用。

内生真菌HASZ1发酵液制备：取已活化内生真菌HASZ1，在无菌条件下挑取菌丝接种于50mL PDB培养基中，于25℃、120r/min条件下摇床振荡培养3d，制成1×10

(1)DPPH自由基清除能力测定

将5.9mg DPPH溶于甲醇并定容至100mL，制备质量浓度为0.15mmol·L

取上述刺五加内生真菌HASZ1发酵液冻干粉溶于适量甲醇后制成浓度为200μg·mL

依次稀释上述对照品液和供试品溶液，将各个溶液浓度稀释至梯度为100μg·mL

式中，A

刺五加内生真菌HASZ1发酵液对DPPH自由基的清除能力见图4。从图4可以看出，刺五加内生真菌HASZ1发酵液浓度在6.25μg/mL～100μg/mL时，其抗氧化能力与其发酵液质量浓度呈正相关。结果表明，刺五加内生真菌HASZ1发酵液具有较好的抗氧化活性。

(2)·OH自由基清除能力的测定

吸取上述不同浓度的各供试品溶液2mL置于试管中，依次加入2mL 6mmol·L

式中，A

刺五加内生真菌HASZ1发酵液对·OH自由基的清除能力见图5。从图5可以看出，刺五加内生真菌HASZ1发酵液浓度在6.25μg/mL～100μg/mL时，其抗氧化能力与其发酵液质量浓度呈正相关。结果表明，刺五加内生真菌HASZ1发酵液具有较好的抗氧化活性。

当刺五加内生真菌HASZ1发酵液浓度为100μg·mL

实施例4：刺五加内生真菌HASZ1的发酵液HPLC分析：

内生真菌HASZ1活化：取内生真菌HASZ1，于无菌条件下接种至PDA培养基的表面上，25℃恒温培养3d，备用。

内生真菌HASZ1发酵液制备：取已活化内生真菌HASZ1，在无菌条件下挑取菌丝接种于50mL PDB培养基中，于25℃、120r/min条件下摇床振荡培养3d，制成1×10

(1)供试品溶液的制备

取300mL内生真菌HASZ1发酵液，于50℃条件下减压浓缩，将浓缩后的发酵液以乙酸乙酯萃取3次(3×100mL)，合并萃取液，50℃低温浓缩至干，用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液，备用。

(2)对照品溶液的制备

精密称取刺五加苷E对照品0.1mg，置于1mL离心管中，加入1mL色谱甲醇溶解，制成对照品溶液备用。

取PDB培养液300mL于50℃条件下减压浓缩，将浓缩后的PDB培养液以乙酸乙酯萃取3次(3×100mL)，合并萃取液，50℃低温浓缩至干，用1mL甲醇溶解后作为空白对照液，备用。

(3)HPLC条件

色谱柱：Venusil XBP-C

采用HPLC分析内生真菌HASZ1发酵液，以刺五加苷E为对照品，HPLC结果如图6。图中A为HASZ1发酵液；B为PDB；C为刺五加苷E对照品。由图3可知，刺五加内生真菌HASZ1发酵液供试品在同一保留时间处与刺五加苷E对照品有相同色谱峰，且空白对照(PDB)无干扰，说明该菌发酵液中含有刺五加苷E。