一种具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉及其制备方法和应用。

背景技术

肥胖已被WHO认定为疾病，会引发多种慢性疾病，近年来有关肥胖危害的研究居高不下。肥胖不仅会增加2型糖尿病、心血管疾病、慢性肾病、肌肉骨骼疾病、感染等一系列代谢疾病发生，还会对大脑小胶质细胞具有损伤作用，加快大脑老化，最新研究发现肥胖可显著增加抑郁和焦虑的风险。

有研究表明活的益生菌对降低体重、抑制脂质积累，有改善作用。然而活的益生菌由于具有复制能力，存在在人体内维持微生物活性带来的风险，从对一些特殊人群，如新生儿、敏感人群不适应。后生元是对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。近年来已经有不少研究探究了后生元可能存在的健康益处，目前后生元已经被应用于普通食品、营养保健品、特殊医学食品、婴幼儿食品等领域，随着后生元研究的不断深入，后生元也逐渐开始应用于预防或治疗疾病方面，而行业对微生物特定培养基的制备属于供不应求阶段。

中国专利申请号202310013365.7公开了一种植物乳杆菌J26组合物、制法和在减肥产品中的应用，组合物包括按照质量比例1:1复配的植物乳杆菌J26与副干酪乳杆菌JY56胞外多糖。副干酪乳杆菌JY56保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62988。本发明减低由高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体重，显著降低肥胖小鼠血清和肝脏中TC、TG、LDL-C和GLU的含量，降低肥胖小鼠血清中的ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ含量。减轻肥胖小鼠肝脏脂肪变性情况，缓解炎症细胞浸润和纤维组织增生现象。该专利提供的植物乳杆菌J26组合物具有较好的减肥效果，但由于其使用的是活的益生菌组合物，对一些特殊人群，如新生儿、敏感人群不适应，导致了其应用受限。

基于上述背景，本领域有必要开发天然的非药物类食用级别的具有减肥降脂的后生元功能产品。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉及其制备方法和应用，该冻干粉具有显著减肥降脂的作用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、菌株活化：将植物乳杆菌J26以5%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃需氧条件下培养13h，取菌液在MRS琼脂培养基进行三区划线，进行有氧培养，挑取单菌落至MRS液体培养基继续培养13h，得到活化菌株；

S2、基础培养基发酵：将步骤S1中的活化菌株以5%的接种量接种于脱脂乳粉培养基中， 37℃扩大培养13h，得到发酵液，随后向发酵液中加入复合载体，于5-10℃下放置4-6h，得到混合液；

S3、植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备：将步骤S2中的混合液采用巴氏杀菌-超声联合灭活，灭活后加入秋葵提取液、单甘酯、蔗糖酯，搅拌均匀后进行冷冻干燥，得到所述植物乳杆菌J26后生元冻干粉。

优选的，步骤S1中所述MRS液体培养基的组成为：蛋白胨5-8g/L、胰蛋白胨10-15g/L、乙酸钠5-9g/L、磷酸氢二钾2-4g/L、葡萄糖20-30g/L、牛肉膏5-10g/L、酵母粉5-8g/L、硫酸锰0.25-0.5g/L、硫酸镁0.58-0.8g/L、柠檬酸氢二铵2-4g/L、吐温-80 0.1-0.2g/L；所述有氧培养的温度为37℃，时间为48h。

优选的，步骤S2中所述复合载体的加入量为发酵液质量的0.4-0.8%；所述脱脂乳粉培养基中脱脂乳粉的含量为100-140g/L，碳源含量为40-80g/L，氮源含量为40-80g/L。

优选的，所述碳源为蔗糖、麦芽糖、甘露醇、纤维二糖中的一种或几种，所述氮源为L-半胱氨酸、鸟嘌呤、四氧嘧啶中的一种或几种。

优选的，步骤S2中所述复合载体制备方法如下：将凹凸棒土加入质量浓度为5%的盐酸溶液中浸渍2-3h，浸渍完成后过滤、洗涤、干燥，得到预处理凹凸棒土；将预处理凹凸棒土加入去离子水中，接着加入柠檬酸改性壳寡糖，用盐酸调节pH至3-4，进行搅拌反应，反应完成后继续加入羟丙基-β-环糊精，进行加热反应，反应完成后过滤，干燥，即得所述复合载体。

优选的，所述柠檬酸改性壳寡糖的制备方法如下：将20g壳寡糖加入200mL去离子水中，接着加入5g柠檬酸、0.2g次磷酸钠，于110-120℃下反应2-4h，冷却至室温，加入无水乙醇进行沉淀、洗涤，固液分离，固体产物进行干燥，即得所述柠檬酸改性壳寡糖；所述预处理凹凸棒土、柠檬酸改性壳寡糖、羟丙基-β-环糊精的质量比为100:20-30:10-20；所述搅拌反应的温度为60-80℃，反应时间为3-5h，所述加热反应的温度为80-90℃，反应时间为2-3h。

优选的，步骤S3中所述秋葵提取液的制备方法如下：将新鲜秋葵洗净后打成泥状，加入3-5倍的水，在50-70℃条件下搅拌水提2-3h，随后冷却至-10~-5℃，保温3-4h，然后加热至60-70℃，水提1-2h，随后冷却至常温，固液分离，得到第一滤液和滤渣；将滤渣加入5-7倍的蒸馏水中，在55-70℃、200-300W下超声反应20-30min，反应完成后固液分离，得到第二滤液；将第一滤液与第二滤液混合后进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/5，即得秋葵提取液。

优选的，步骤S3中所述秋葵提取液的添加量为灭活后混合液质量的3-6%，单甘酯的添加量为灭活后混合液质量的0.4-0.6%，蔗糖酯的添加量为灭活后混合液质量的0.4-0.6%；所述灭活工艺为：在65℃、超声功率为400-500W的条件下灭活20-30min；所述冷冻干燥的温度为-60~-80℃，时间为24-48h。

本发明还保护一种所述制备方法制备得到的具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉。

本发明还保护一种所述具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉在功能性食品或保健产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

（1）本发明制备的具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉，具有减肥降脂的作用，具体体现在：显著缓解高脂饮食诱导肥胖小鼠的体重增加、Lee’s指数上升、体脂率升高；显著降低高脂饮食诱导肥胖小鼠血清中TC、TG、LDL-C的水平，提高HDL-C的水平；显著恢复高脂饮食诱导肥胖小鼠葡萄糖耐量的差异性；显著降低高脂饮食诱导肥胖小鼠血清中胰岛素、提高胰高血糖素样肽的水平；显著降低高脂饮食诱导肥胖小鼠血清中瘦素、提高脂联素的含量；因此，其在减肥降脂相关产品中，具有巨大的应用前景。

（2）本发明提供的具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备方法，将植物乳杆菌J26进行活化，得到活化菌株，随后再将活化菌株在脱脂乳粉培养基中进行发酵培养，采用本发明的发酵方法制得的后生元中有效成分含量高，提高了制剂并在发酵后加入复合载体，复合载体以凹凸棒土为原料，先将凹凸棒土进行酸化处理，提高其表面的活性基团，有利于下一步反应的进行，接着将预处理的凹凸棒土与柠檬酸改性壳寡糖进行反应，使凹凸棒土表面接入壳寡糖，继续再加入羟丙基-β-环糊精进行反应，使凹凸棒土表面接入羟丙基-β-环糊精，凹凸棒土有着优异的综合性能，如较大的比表面积、良好的化学稳定性、良好的生物相容性、较强的吸附性能，将其作为载体原料，一方面可吸附菌株和菌株代谢产物在其表面及内部固定化，使制备的后生元冻干粉性能更加稳定，引入的壳寡糖可进一步提高凹凸棒土的生物相容性，并且其含有的丰富活性基团，可与植物乳杆菌代谢产物中氨基酸、生物酶大分子产生相互作用，提高后生元产品的稳定性，引入的羟丙基-β-环糊精可对后生元中的小分子成分进行包合，使后生元成分具有良好的缓释作用，提高后生元的利用率；接着采用巴氏杀菌-超声联合对混合液进行灭活，该方法可避免杀菌不彻底以及对后生元产品成分损伤的问题，保证后生元冻干粉的功效；随后加入的秋葵提取液可以在后生元冻干粉表面形成秋葵提取液薄膜，可减少后生元的流失，后生元冻干粉进入肠道会缓慢释放后生元，且由于复合载体能吸收食糜中的水分的作用，使得肠道内食糜黏度增加、流动速度减缓，进而延长后生元的作用时间，有利于进一步提高后生元的利用率；同时秋葵含有维生素C和果胶，具有降血糖、降胆固醇、预防心血管疾病等功效，进一步提高了后生元冻干粉的减肥降脂效果。

附图说明

图1为小鼠体重-时间变化图；

图2为小鼠的Lee’s指数图；

图3为小鼠的体脂率变化图；

图4为生化指标变化图，a、血清总胆固醇（TC），b、血清总甘油三酯（TG），c、血清高密度脂蛋白（HDL-C），d、血清低密度脂蛋白（LDL）；

图5为口服糖耐量（OGTT）变化图；

图6为胰岛素指标变化，a、胰岛素含量（INS），b、胰高血糖素样肽（GLP-1）；

图7为脂肪因子变化图，a、瘦素（LEP），b、脂联素（ADP）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）J26（原植物乳杆菌NDC75017），分离自内蒙古通辽地区牧民自制发酵乳制品，已于2011年11月8日藏于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5448。

本发明中凹凸棒土为食品级凹凸棒土，目数为1000目；所述壳寡糖购自扶风斯诺特生物科技有限公司，分子量<2000；所述羟丙基-β-环糊精购自陕西唐尧生物科技有限公司，CAS号：128446-35-5。

本发明实施例中所述MRS液体培养基的组成为：蛋白胨5g/L、胰蛋白胨10g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、葡萄糖20g/L、牛肉膏5g/L、酵母粉5g/L、硫酸锰0.25g/L、硫酸镁0.58g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、吐温-80 0.1g/L；

所述柠檬酸改性壳寡糖的制备方法如下：将20g壳寡糖加入200mL去离子水中，接着加入5g柠檬酸、0.2g次磷酸钠，于110℃下反应3h，冷却至室温，加入无水乙醇进行沉淀、洗涤，固液分离，固体产物进行干燥，即得所述柠檬酸改性壳寡糖。

实施例1

一种具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、菌株活化：将植物乳杆菌J26以5%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃需氧条件下培养13h，取菌液在MRS琼脂培养基进行三区划线，37℃有氧培养48h，挑取单菌落至MRS液体培养基继续培养13h，得到活化菌株；

S2、基础培养基发酵：将步骤S1中的活化菌株以5%的接种量接种于脱脂乳粉培养基中，37℃扩大培养13h，得到发酵液，随后向发酵液中加入复合载体，于5℃下放置6h，得到混合液；所述脱脂乳粉培养基中脱脂乳粉的含量为120g/L，麦芽糖含量为60g/L，L-半胱氨酸含量为60g/L；所述复合载体的加入量为发酵液质量的0.6%；

S3、植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备：将步骤S2中的混合液采用巴氏杀菌-超声联合灭活，灭活工艺为：在65℃、超声功率为400W的条件下灭活30min；灭活后加入秋葵提取液、单甘酯、蔗糖酯，搅拌1h后进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-80℃，时间为24h，得到所述植物乳杆菌J26后生元冻干粉；所述秋葵提取液的添加量为灭活后混合液质量的5%，单甘酯的添加量为灭活后混合液质量的0.5%，蔗糖酯的添加量为灭活后混合液质量的0.5%。

由于超高温灭菌乳易出现变色、营养价值损失等问题，而巴氏杀菌可最大程度上保留灭菌乳中的营养价值但存在保质期较短、保存条件局限等问题，非热杀菌技术可规避热杀菌的弊端，但是单种非热杀菌技术常常杀菌不彻底或对后生元类似产品易出现过度处理损伤其成分的问题，因此本发明使用热杀菌与非热杀菌结合方式，以巴氏处理的样品结合不同超声功率，从而提高杀菌效率及保证后生元产品中的有效成分。

其中，步骤S2中所述复合载体制备方法如下：将100g凹凸棒土加入1L质量浓度为5%的盐酸溶液中浸渍3h，浸渍完成后过滤、洗涤、干燥，得到预处理凹凸棒土；将100g预处理凹凸棒土加入1L去离子水中，接着加入25g柠檬酸改性壳寡糖，用5wt%的盐酸调节pH至3，70℃搅拌反应4h，反应完成后继续加入15g羟丙基-β-环糊精，85℃加热反应3h，反应完成后过滤，干燥，即得所述复合载体。

通过对壳寡糖进行柠檬酸改性，提高了壳寡糖的反应活性，同时也将羧基引入壳寡糖中，使其能与羟丙基-β-环糊精进行反应。

步骤S3中所述秋葵提取液的制备方法如下：将新鲜秋葵洗净后打成泥状，加入5倍的水，在60℃条件下搅拌水提3h，随后冷却至-10℃，保温3h，然后加热至65℃，水提2h，随后冷却至常温，固液分离，得到第一滤液和滤渣；将滤渣加入6倍的蒸馏水中，在60℃、300W下超声反应20min，反应完成后固液分离，得到第二滤液；将第一滤液与第二滤液混合后进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/5，即得秋葵提取液。

对比例1

一种具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、菌株活化：将植物乳杆菌J26以5%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃需氧条件下培养13h，取菌液在MRS琼脂培养基进行三区划线，37℃有氧培养48h，挑取单菌落至MRS液体培养基继续培养13h，得到活化菌株；

S2、基础培养基发酵：将步骤S1中的活化菌株以5%的接种量接种于脱脂乳粉培养基中，37℃扩大培养13h，得到发酵液；所述脱脂乳粉培养基中脱脂乳粉的含量为120g/L，麦芽糖含量为60g/L，L-半胱氨酸含量为60g/L；

S3、植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备：将步骤S2中的发酵液采用巴氏杀菌-超声联合灭活，灭活工艺为：在65℃、超声功率为400W的条件下灭活30min，灭活后加入秋葵提取液、单甘酯、蔗糖酯，搅拌1h后进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-80℃，时间为24h，得到所述植物乳杆菌J26后生元冻干粉；所述秋葵提取液的添加量为灭活后发酵液质量的5%，单甘酯的添加量为灭活后发酵液质量的0.5%，蔗糖酯的添加量为灭活后发酵液质量的0.5%。

其中，步骤S3中所述秋葵提取液的制备方法如下：将新鲜秋葵洗净后打成泥状，加入5倍的水，在60℃条件下搅拌水提3h，随后冷却至-10℃，保温3h，然后加热至65℃，水提2h，随后冷却至常温，固液分离，得到第一滤液和滤渣；将滤渣加入6倍的蒸馏水中，在60℃、300W下超声反应20min，反应完成后固液分离，得到第二滤液；将第一滤液与第二滤液混合后进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/5，即得秋葵提取液。

对比例2

一种具有减肥降脂功效的植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、菌株活化：将植物乳杆菌J26以5%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃需氧条件下培养13h，取菌液在MRS琼脂培养基进行三区划线，37℃有氧培养48h，挑取单菌落至MRS液体培养基继续培养13h，得到活化菌株；

S2、基础培养基发酵：将步骤S1中的活化菌株以5%的接种量接种于脱脂乳粉培养基中，37℃扩大培养13h，得到发酵液，随后向发酵液中加入复合载体，于5℃下放置6h，得到混合液；所述脱脂乳粉培养基中脱脂乳粉的含量为120g/L，麦芽糖含量为60g/L，L-半胱氨酸含量为60g/L；所述复合载体的加入量为发酵液质量的0.6%；

S3、植物乳杆菌J26后生元冻干粉的制备：将步骤S2中的混合液采用巴氏杀菌-超声联合灭活，灭活工艺为：在65℃、超声功率为400W的条件下灭活30min，灭活后进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-80℃，时间为24h，得到所述植物乳杆菌J26后生元冻干粉。

其中，步骤S2中所述复合载体制备方法如下：将100g凹凸棒土加入1L质量浓度为5%的盐酸溶液中浸渍3h，浸渍完成后过滤、洗涤、干燥，得到预处理凹凸棒土；将100g预处理凹凸棒土加入1L去离子水中，接着加入25g柠檬酸改性壳寡糖，用5wt%的盐酸调节pH至3，70℃搅拌反应4h，反应完成后继续加入15g羟丙基-β-环糊精，85℃加热反应3h，反应完成后过滤，干燥，即得所述复合载体。

将实施例1、对比例1和对比例2中制备得到的植物乳杆菌J26后生元冻干粉进行小鼠实验，具体如下：

1.实验材料

雄性C57BL/6小鼠，鼠龄为5周，基础饲料和高糖高脂饲料均购自北京科奥协力饲料有限公司。

2.动物分组

将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分成5组（n=8只/组）：正常组、模型组、实施例1组、对比例1组、对比例2组适应性饲养3天后，正常组每天喂食基础饲料，其余各组喂食高糖高脂饲料，在喂食过程中正常组与模型组灌胃0.2mL 0.5%CMC-Na，实施例1组灌胃600 mg/(kg·d)实施例1制备得到的植物乳杆菌J26后生元冻干粉，对比例1组灌胃600 mg/(kg·d)对比例1制备得到的植物乳杆菌J26后生元冻干粉，对比例2组灌胃600 mg/(kg·d) 对比例2制备得到的植物乳杆菌J26后生元冻干粉。

3.体重指标测定

每周对小鼠进行称重和摄食量进行记录并计算小鼠体重增重，每周观察小鼠的精神状态。小鼠处死后测量小鼠体长（伸长为鼻尖到肛门的距离）。Lee’s 指数通过测量小鼠体重与体长之间的比例，从而反映肥胖程度。并通过单位体重的脂肪含量，即体脂率反应小鼠体内的脂肪积累情况。结果如图1所示。正常组随着标准饲料喂养体重缓慢上升，其他所有小组高脂饲料喂养，体重较正常组相比均有不同程度的上升。灌胃期间，模型组小鼠持续喂养高脂饲料，体重持续高增长，灌胃结束后小鼠体重情况为：模型组>对比例1组>对比全2组>实施例1组>正常组。从图2中可以看出，与正常组相比，模型组小鼠Lee’s指数升高，说明长时间的高脂饮食促使小鼠呈现肥胖状态。后生元干预后，Lee’s指数降低。从图3可以看出，高脂饮食显著提高了小鼠体内的脂肪含量，灌胃后生元冻干粉后，小鼠的体脂率均有所降低，但实施例1组降低的效果最显著，表明灌胃本发明制备的后生元冻干粉可以显著改善肥胖小鼠体内的脂肪积累程度，并且本发明实施例1制备的后生元冻干粉效果明显高于对比例1和对比例2的冻干粉。

4.血清生化指标的测定

采取眼球取血的方式获取全血，室温静置2h，4℃3000r/min离心10min，吸取上层血清，检测每组小鼠血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C浓度。结果如图4所示。经过长时间的高脂饮食，模型组小鼠血清中的TC、TG和LDL-C含量均显著提高，HDL-C含量显著下降。当灌胃小鼠后生元冻干粉后，血清中的TC、TG和LDL-C含量下降，HDL-C含量升高，而实施例1组效果最为显著，表明灌胃本发明制备的后生元冻干粉可以显著改善由高脂饮食引起的小鼠血脂和胆固醇含量的升高，进一步在一定程度上减少脂肪积累，且实施例1的效果明显优于对比例1和对比例2。

5.口服糖耐量测定

在小鼠空腹12h后，对小鼠尾椎进行取血测量其空腹血糖（FBG）。8周末隔夜禁食12h，给予40%的葡萄糖溶液，按照5ml/kg体积灌胃，灌胃标准为葡萄糖2g/kg。分别于空腹及糖负荷15min，30min，60min，90min，120min测定血糖值。结果如图5所示。通过口服糖耐量（OGTT）试验可判断胰岛细胞功能以及机体对血糖的调节能力。在试验结束时，对各组试验小鼠进行OGTT实验，从图5中可以看出，正常组小鼠在灌胃葡萄糖后，血糖水平先逐渐升高，随后下降并在2h时接近正常血糖值。表明正常组小鼠胰岛细胞功能正常，且机体具有调节血糖的能力。然而在高糖高脂饮食干预的模型组、实施例1组、对比例1组和对比例2组小鼠中，在灌胃葡萄糖后，血糖水平急速升高，和正常组小鼠相比，各组恢复水平高于模型组，实施例1组血糖恢复水平明显优于对比例1组和对比例2组。

6.胰岛素与胰高血糖素样肽1的测定

采用试剂盒法检测小鼠血清中胰岛素（INS）和胰高血糖素样肽（GLP-1）的含量。结果如图6所示。本研究检测血清中胰岛素含量和GLP-1水平。模型组的胰岛素含量显著高于正常组，表明高脂造模后，小鼠的肥胖程度明显升高。灌胃实施例1、对比例1和对比例2中后生元冻干粉各组的胰岛素含量相较模型组而言，均呈现下降趋势，但实施例1组效果最显著。与正常组相比，模型组血清中的GLP-1含量显著降低，而灌胃本发明实施例1制备的后生元冻干粉后，GLP-1含量显著升高，其效果明显优于对比例1和对比例2。

7.脂肪因子的检测

采用试剂盒法检测小鼠血清中瘦素（LEP）和脂联素（ADPN）的含量，结果如图7所示。模型组小鼠中LEP含量增加，与肥胖呈负相关的ADPN含量显著减少，表明高脂饮食诱导小鼠肥胖，导致瘦素抵抗和低脂联素现象。实施例1组、对比例1组、对比例2组对LEP的改善效果不同，实施例1组可显著降低LEP含量和增加ADPN的含量。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。