猪NDUFAF6基因相关肉质性状分子标记及应用

技术领域

本申请涉及猪肉肉质性状检测技术领域，具体涉及猪NDUFAF6基因相关肉质性状分子标记及应用。

背景技术

猪肉是我国动物性蛋白的最主要来源，品质是影响消费者对猪肉偏好的重要因素。肉质性状是生猪养殖和生产的重要性状，可以通过几个指标来衡量：猪肉色评分、大理石纹评分、肉色A值、C值、L值、24小时pH值、肌内脂肪含量、嫩度、pH值、肉色、眼肌面积、滴水损失等。

在猪的生产和选育中，采用传统方式测量这些指标对猪进行选育，周期长，制约了优质猪选育效率。随着分子生物学技术的发展，采用分子辅助标记选择与常规育种相结合的方法大大加速了猪育种的进程，缩短了育种年限。用于辅助选择的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性(SNP)标记等。SNP标记是指基因组上单个核苷酸变异引起的DNA序列的多态性，它具有数量多、准确性高、多态性高等特点，在育种实践中可以利用SNP对某些优良基因进行定位，并结合表型确定标记与特定性状之间的关联性，还可以将分子标记在群体中进行验证并应用在分子育种上。

发明内容

NDUFAF6基因编码的蛋白质位于线粒体调节亚基ND1，是线粒体复合物I的组装因子，NDUFAF6在真核生物中高度保守，是最常突变的基因之一，大多与复合物I活性降低相关，敲低NDUFAF6会降低线粒体复合物I的丰度和活性。NDUFAF6基因发生突变，对氧化磷酸化影响很大。McKenzie等人报道了NDUFAF6基因具有不同的转录本，可以在几种组织中差异表达，有研究证明NDUFAF6是杜洛克×二花脸群体体重和日增重性状的候选基因。综上，大多数关于NDUFAF6基因的研究的围绕着人类线粒体相关疾病，在猪上关于该基因的多态性研究尚未报道，鉴于其作为肌内脂肪含量的候选基因，且前期发现有eQTL调控其表达，因此将其作为研究对象开发新的分子标记。

本申请根据NDUFAF6基因在第一外显子上的SNP突变位点设计特异性引物并进行扩增，利用限制性内切酶AciI对该位点进行多态性检测，根据多态性检测的结果来区分猪个体间的肉质差异。利用该分子标记设计引物，对包含该SNP位点的核苷酸序列进行PCR扩增的，能够够在较短的时间内鉴别NDUFAF6基因的多态性，从而检测猪肉肉质性状的差异，以为猪肉品种的选育提供指导，且不需要昂贵的设备。另外，本申请提供的引物能够特异性扩增NDUFAF6的基因第一外显子包含的SNP位点序列，检测方法成本低。只需要通过PCR扩增的方法即可检测，不需要进行大量的群体规模采样与测定即可进行比较不同猪只之间肉质的差异。

为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：

(1)：猪肉肉质性状的分子标记，包括猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处发生单核苷酸突变G>A形成的核苷酸序列。

(2)：猪肉肉质性状的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.4所示的DNA分子和如SEQID NO.5所示的DNA分子。

(3)：一种核酸分子，由(2)所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与所述猪肉肉质性状关联。

(4)：一种试剂盒，包括(2)所述的分子标记引物以及其他PCR扩增所需试剂。

(5)：猪肉肉质性状的检测方法，包括：

获取待测猪基因组DNA；

通过(2)所述的分子标记引物进行PCR扩增；

根据扩增产物的核苷酸序列检测猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处的基因型；

根据所述基因型确定所述猪肉肉质性状。

(6)：猪的筛选方法，包括如权利要求8所述的检测方法。

(7)：(1所述的分子标记、(2)所述的分子标记引物、(3)所述的核酸分子或(4)所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：

1)所述猪肉肉质性状的检测与分析，所述猪肉肉质性状选自猪肉色评分、大理石纹评分和肉色L值中的至少一种；

2)猪的筛选与育种。

附图说明

图1是NDUFAF6基因启动子序列；图中，框线为SNP位点，下划线序列为NDUFAF6-PF和NDUFAF6-PR的结合序列；红色序列为NDUFAF6-vector-PF和NDUFAF6-vector-PR1的结合区域。

图2是NDUFAF6基因启动子区域PCR产物电泳图。

图3是两种不同的单倍型的NDUFAF6启动子载体鉴定到的8个突变位点。

图4是两种不同单倍型的NDUFAF6启动子表达载体的相对荧光素酶活性。

图5是两种不同单倍型的NDUFAF6置换(2kb左右)启动子表达载体的相对荧光素酶活性。

图6是两种不同单倍型的NDUFAF6第二次置换(2kb左右)启动子表达载体的相对荧光素酶活性。

图7是g4:41657299点突变启动子表达载体的相对荧光素酶活性。

图8是限制性内切酶AciI基因分型结果电泳图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

本申请实施例通过对NDUFAF6基因启动子区域的突变位点进行测序发现，NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处的基因型与猪肉肉质性状关联。

为此，本申请实施例公开了猪肉肉质性状的分子标记，包括猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处发生单核苷酸突变G>A形成的核苷酸序列。其中，猪NDUFAF6基因参考GenBank数据库中，GeneBank收录号：NC_010446.5。

在一些实施例中，所述猪肉肉质性状选自猪肉色评分、大理石纹评分、肉色A值、C值、L值和24小时PH值中的至少一种。

在一些实施例中，猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处，GG基因型个体猪肉色评分显著低于AA基因型个体和AG基因型个体。

在一些实施例中，猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处，GG基因型个体肉色L值显著高于AA基因型个体和AG基因型个体。

基于此，根据猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处的基因型，可以对猪个体的猪肉肉质性状进行遗传标记，以利于选育具有优良肉质的猪品种。

由此，参考GenBank数据库中猪NDUFAF6基因第一外显子设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)，以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收并且进行测序分析，得到如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的基因片段。

基于此，本申请实施例还公开了猪肉肉质性状的分子标记引物，包括如SEQ IDNO.4所示的DNA分子和如SEQ ID NO.5所示的DNA分子。其中，“分子标记引物”是用来扩增包含猪肉肉质性状联锁的分子标记，例如SNPs的核苷酸序列，以分析该分子标记的基因型，从而得知猪胴体性状。

另外一方面，本申请实施例还公开了一种核酸分子，由所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与所述猪肉肉质性状关联。进一步地，所述核酸分子如SEQ ID NO.6～8所示。

另外一方面，本申请实施例还公开了一种试剂盒，包括所述的分子标记引物以及其他PCR扩增所需试剂。

基于此，本申请实施例还公开了猪肉肉质性状的检测方法，包括：获取待测猪基因组DNA；通过所述的分子标记引物进行PCR扩增；根据扩增产物的核苷酸序列检测猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处的基因型；根据所述基因型确定所述猪肉肉质性状。例如，根据该基因型确定猪肉色评分、大理石纹评分、肉色A值、C值和/或L值。

在一些实施例中，该检测方法还包括将所述扩增产物进行酶切反应，将酶切产物进行电泳检测，根据电泳结果判断猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处的基因型。

基于此，本申请实施例还公开了猪的筛选方法，包括所述的检测方法，以确定猪猪肉色评分、大理石纹评分、肉色A值、C值和/或L值，进而对猪品种进行筛选，以获得优良猪品种。

基于此，本申请实施例还公开了所述的分子标记、所述的分子标记引物、所述的核酸分子或所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：

1)所述猪肉肉质性状的检测与分析，所述猪肉肉质性状选自猪肉色评分、大理石纹评分和肉色L值中的至少一种；

2)猪的筛选与育种。

现结合具体实例对本申请做进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本申请，但不构成对本申请的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。

一、影响NDUFAF6基因表达的突变位点发掘

1、引物设计

从ensembl数据库下载猪(Sscrofa11.1)的NDUFAF6基因序列，GeneBank收录号：NC_010446.5，其中第一外显子及其上游2Kb左右的区域DNA序列为SEQ ID NO:1；同时见图1中，横线表示后续实验酶切PCR产物扩增的序列信息，框线中的序列为后续实验检测到的SNP突变序列。

设计克隆NDUFAF6基因的启动子的引物DNA序列如下：

正向引物：NDUFAF6-vector-PF：

cgtgctagcccgggctcgagCTCAAAGAGGACAGAGTAAGCAAC，见SEQ ID NO:2；

反向引物：NDUFAF6-vector-PR1：cttagatcgcagatctcgagGACACCGACGCCGCGTGCCCT，见SEQ ID NO:3。

2、针对NDUFAF6基因表达量极端个体的选择

在已进行RNA-seq测序的189个个体中，发现针对NDUFAF6基因的表达量(FPKM值)在个体间存在极显著的差异。挑选NDUFAF6表达量在极端高组、极端低组中的代表性个体进行SNP多态性检测，每组5个，其中高组个体分别用H1，H2，H3，H4，H5来表示，低组个体用L1，L2，L3，L4，L5来表示。

3、PCR产物的扩增、纯化与克隆

10μL的PCR反应体系中含有1μL的猪的DNA模板，DNA浓度为50ng/μL，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 0.2μL，2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP Mix 0.2μL，10μM的正、反向引物各0.2μL以及无菌水3.2μL。扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸75s，35个循环，72℃终止延伸5min，15℃冷却2min。其中，本实施例中采用苯酚-氯仿法抽提猪的基因组DNA，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase购买自南京诺唯赞生物科技有限公司。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。扩增产物大小为2256bp，经琼脂糖电泳检测结果表明，PCR产物大小符合预期。M泳道为super DNA marker，第1泳道为阴性对照，第2泳道至第10泳道为PCR产物。

PCR产物的纯化：在紫外仪下从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶并放入2mL的离心管中，然后用购买自OMEGA公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

连接反应：借助Takara的pMD18-T vector试剂盒进行连接操作，取回收的PCR产物4μL与1μL pMD18-Tvector混合，并加入试剂盒中的Solution I 5μL，置16℃金属浴1h，得到连接产物。

转化：无菌状态下取购自北京全式金公司的Trans-5α化学感受态细胞25μL，置于灭菌的1.5mL离心管中，加入5μL的连接产物并轻柔混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，随后冰浴2min。加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1h。低速离心后去除200μL的上清液，然后悬浮沉淀并将其均匀涂布于含有氨苄青霉素60μg/mL的LB固体培养基平板上，37℃平放30min后倒置过夜培养。

阳性单菌落检测：挑取平板上的单菌落，接种于1mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养6-8h。以菌液为模板，按照第3步中的PCR扩增体系进行PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，挑选阳性的单克隆。

4、测序

将上述阳性单克隆菌液送至武汉擎科伟业生物科技技术有限公司进行测序，利DNAStar软件的SeqMan程序对测序结果进行拼接和序列比对。

5、构建双荧光素酶报告基因载体

通过对该基因表达水平高低组个体扩增产物的测序结果分析发现，高低组个体之间存在变异。选取高低组个体各一个进而抽提质粒。质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司，所有操作均按照说明书进行，得到两种不同的NDUFAF6基因启动子单倍型。

酶切体系：以PGL3-Basic载体(酶切位点为XhoI)为骨架，构建荧光素酶报告基因载体。振荡混匀后离心，37℃酶切时间为1h。酶切产物用1.5％的琼脂糖凝胶检测后回收，连接。所用的酶购自Thermo Fisher公司，所有实验操作按照说明书进行，酶切产物纯化同之前的PCR产物纯化。

连接体系：10μl目的片段与载体骨架的连接反应体系中含有5μl同源重组酶，0.02pmol的载体骨架，0.04pmol的目的片段，加入灭菌水至10μl，50℃连接1h。

转化及阳性单菌落检测同上，测序检测插入片段是否正确。

其中两种不同的单倍型启动子载体共有6个突变位点，如图3所示。用萤火虫荧光素酶报告基因载体实验，检测两种不同的NDUFAF6启动子表达载体质粒在猪肾上皮细胞(PK15)中的转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差，以表达海肾荧光素酶的质粒pRL-TK作为内参照，与上述质粒同时转染PK15细胞24h，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性，用二者的比值，即相对荧光素酶活性表示目的序列的转录活性，实验结果如图3所示，两种不同的启动子表达载体存在转录活性的差异。结果显示高组转录活性明显高于低组，倍数差异大概为2倍。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，所有实验操作均按照说明书进行。

为缩小功能变异位点的范围，进行了第一次置换载体的构建(前5个变异位点及后3个变异位点)，以原始单倍型为对照，结果如图4所示，包含H1组前5个变异位点H2组后3个变异位点的载体，表达活性还是相对较低，包含H2组前5个变异位点变H1组后3个变异位点变的载体，表达活性相对较高，初步鉴定到功能变异位点位于后3个变异位点之间。

为了进一步挖掘功能变异位点，扩增仅包含后三个变异位点的片段，对后3个变异位点进行置换(前2个变异位点及后1个变异位点)，以原始组载体为对照，结果如图5所示，包含H1组前2个变异位点和H2组后1个变异位点的载体，表达活性还是相对较低，包含H2组前2个变异位点和H1组后1个变异位点的载体，表达活性相对较高，初步鉴定到功能变异位点为最后1个变异位点。

对最后一个变异位点构建点突变载体，我们同样以原始组为模板，验证此变异位点是否具有功能。结果如图6所示，4:41657299位点，以H1组为模板，A>G突变表达活性变低，以H2组为模板，G>A突变表达活性依然是低的，初步鉴定该突变点是影响基因表达量的功能变异位点。所有双荧光素酶报告载体实验数据均重复3次及以上。

二、NDUFAF6基因SNP位点的检测

1、PCR扩增

采用北京擎科生物科技有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按照试剂盒说明书进行操作)提取“壮乡黑猪”的基因组DNA。并针对NDUFAF6基因在第一外显子处存在的SNP突变设计并合成特异性引物如下：

NDUFAF6-PF：5'-TAGAGACAATAAAACAAAAG-3'，见SEQ ID NO:4；

NDUFAF6-PR：5'-TAATTATGTGGGGTCTTTGT-3'，见SEQ ID NO:5；

利用NDUFAF6-PF/NDUFAF6-PR对猪基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应总体系为10μL，其中包括1μL的猪基因组DNA，浓度为50ng/μL；5μL的2×Taq PCR Mix；10μM的正、反向特异性引物各0.2μL；3.6μL的无菌水；扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；35个循环；72℃终止延伸5min；15℃冷却2min。其中2×Taq PCR Mix购买自北京艾德莱生物科技有限公司。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图7所示，获得扩增产物大小为474bp(序列)。

2、胶回收

在紫外仪下从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶并放入2mL的离心管中，然后用购买自OMEGA公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

3、酶切并判断基因型

酶切反应体积是5μL，其中10×FastDigest 0.5μL；PCR产物2μL；AciI限制性内切酶0.4μL；无菌水2.1μL；振荡混匀之后离心；然后37℃酶切30min；酶切产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测酶切结果，并判断基因型。酶切结果如图8所示，当NDUFAF6的剪接供体发生突变时，则会产生一个可被限制性内切酶AciI所识别的酶切位点，序列为5’GGCGG 3’。若酶切产物经电泳检测出现如SEQ ID NO.6(474bp)、如SEQ ID NO.7(263bp)和如SEQ ID NO.8(211bp)的条带，则判断待测“壮乡黑猪”于NDUFB9基因第一外显子g4:141657299处基因型为AG型；若酶切产物经电泳检测出现如SEQ ID NO.7(263bp)和如SEQ ID NO.8(211bp)的条带，则判断待测“壮乡黑猪”于NDUFB9基因第一外显子g4:15113272处基因型为GG型；若酶切产物经电泳检测出现如SEQ ID NO.8(211bp)的条带，则判断待测“壮乡黑猪”于NDUFB9基因第一外显子g4:15113272处基因型为AA型。

三、遗传多样性检测及与性状的关联分析

利用本申请实施例提供的方法检测猪NDUFAF6基因第一外显子g4:41657299处的基因型。结果如表1所示。

表1“壮乡黑猪”群体中猪NDUFAF6基因4:141657299基因型与等位基因频率

结果显示，在“壮乡黑猪”群体中，AA和AG基因型的个体占优势，GG基因型个体较少。

根据前期对“壮乡黑猪”的三个杂交组合共计402个个体进行了肉质性状的测定工作，将肉质性状测定的结果与NDUFAF6基因在群体中的基因型检测结果进行性状关联分析，并建立了如下线性模型：

Y

其中Y代表性状观察值，G代表基因型效应，B代表屠宰的批次效应，S代表性别效应，F代表公猪的效应，ε

表2“壮乡黑猪”群体中猪NDUFAF6基因4:141657299基因型与肉质性状关联分析

注：*表示显著关联(0.01

Note:*indicates significant association(0.01

分析结果显示，在“壮乡黑猪”实验群体中，SNP位点的多态性与肉质性状极显著关联(P≤0.01)。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。