一种高产肌醇解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用

文献发布时间：2024-04-18 20:01:23

技术领域

本发明属于基因工程技术和代谢过程控制技术领域，尤其是一种高产肌醇解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

肌醇，又名环己六醇，广泛分布于动物和植物体内，是动物、微生物的生长因子，游离态的肌醇主要存在于肌肉、心脏、肺脏和肝脏中，是磷脂的一种磷脂酰肌醇组成成分，在医药、食品、饲料等领域内具有很大的实用价值。近年来，随着对肌醇的深入研究，结合当前消费者对健康饮食诉求的不断提高，国内外市场对肌醇的需求正在逐年增加。

传统生产肌醇主要以水解提取法和化学合成法为主，今年随着肌醇年需求量不断递增、生态环境的要求、生产成本的诉求，致使国内外科研工作者更多倾向于用微生物法解决肌醇的生产矛盾。

随着近几十年来细胞生物学相关研究的不断深入，肌醇在解淀粉芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌等代谢途径已基本清晰，但自然选育菌株的肌醇产率通常较低，单纯采用基因工程构建高产肌醇菌株的难度偏大且成功率较低，因此，同时考虑基因工程和发酵代谢控制技术，以具备清晰基因组信息及成熟基因操作工具的解淀粉芽孢杆菌进行改造，兼用发酵代谢过程控制的手段，获得高产肌醇的生产菌株及发酵技术。

因此，在明确出发菌株肌醇代谢途径及通路的情况下，采用基因工程技术构建重组菌株，同时结合发酵代谢控制技术对生产肌醇的发酵技术进行优化，以进一步提高肌醇的产量，解决了本领域技术人员底物利用率低、生产成本高的产业化问题。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产肌醇解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一株以如上所述的解淀粉芽孢杆菌为出发菌株构建的重组菌株。

如上所述的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

以解淀粉芽孢杆菌野生型CGMCC26351为出发菌株，采用同源重组系统对其基因编辑，敲除肌醇降解途径关键酶肌醇分解酶EC5.3.99.11，对影响肌醇合成的途径进行改造，顺序完成插入肌醇-3-磷酸合成酶EC5.5.1.4，替换6-磷酸果糖激酶EC2.7.1.11，敲除磷酸己糖异构EC5.3.1.9，以及替换葡萄糖苷酶EC2.7.1.2，得到重组菌株；

其中，肌醇分解酶EC5.3.99.11的基因序列为SEQ ID NO.1，肌醇-3-磷酸合成酶EC5.5.1.4的基因序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4，6-磷酸果糖激酶EC2.7.1.11的基因序列为SEQ ID NO.5，磷酸己糖异构EC5.3.1.9的基因序列为SEQ IDNO.9，葡萄糖苷酶EC2.7.1.2的基因序列为SEQ ID NO.10。

进一步地，具体包括如下步骤：

利用同源重组系统，敲除解淀粉芽孢杆菌的肌醇分解酶EC5.3.99.11。并分别将来源于德氏链霉菌、青春双歧杆菌和红球菌的肌醇-3-磷酸合成酶EC5.5.1.4的编码基因整合在肌醇分解酶基因位点；并将解淀粉芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶EC2.7.1.11基因替换为分别来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶基因；并将解淀粉芽孢杆菌的磷酸己糖异构EC5.3.1.9基因敲除；并将解淀粉芽孢杆菌的葡萄糖苷酶EC2.7.1.2基因替换为分别来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的葡萄糖苷酶基因；

其中，肌醇分解酶EC5.3.99.11的基因序列为SEQ ID NO.1，肌醇-3-磷酸合成酶EC5.5.1.4的基因序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4，来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶基因的基因序列分别为SEQ ID NO.6、SEQIDNO.7、SEQ ID NO.8，来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的葡萄糖苷酶基因的基因序列分别为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13。

如上所述的重组菌株在发酵生产肌醇方面中的应用。

一种利用如上所述的重组菌株生产肌醇的方法，所述方法包括以蔗糖为底物，以所述重组菌株通过生物发酵生产肌醇。

进一步地，所述方法还包括：在所述重组菌株发酵过程中添加发酵补充剂，所述发酵补充剂包括发酵补充剂1和发酵补充剂2，按照体积计：

发酵补充剂1为：硫酸锰0.03-0.08g/L，硝酸钾0.001-0.005g/L；

发酵补充剂2为：丙酮酸0.006-0.01g/L，6-磷酸果糖二钠0.01-0.02g/L，乙酸0.005-0.01g/L。

进一步地，所述重组菌株在发酵生产肌醇过程中，在发酵时间6-12h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂1，在发酵时间24-30h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂2。

进一步地，在发酵时间7.5h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂1，在发酵时间26h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂2。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明在选用特定菌种CGMCCNO.26351进行基因工程手段构建高产肌醇重组菌株的基础上，通过发酵过程控制技术以进一步提高肌醇产率并稳定发酵过程。选用价格低廉的蔗糖作为底物，具有更低的生产成本及极高的转化率，发酵过程中底物蔗糖利用率贴近100％，转化率最高可达143.33％，同时排废环境压力更小，更适合工业化生产，分析极高转化率的原因在于重组菌株优先将蔗糖分解为等摩尔量的葡萄糖和果糖，进一步将全部葡萄糖和部分果糖转化为肌醇，部分果糖用于菌体生长代谢所需。

2、本发明应用基因工程技术方法，由解淀粉芽孢杆菌CGMCC26351为出发菌株，通过引入外源基因构建重组菌株，并在以蔗糖为底物生产肌醇时，控制特异性营养盐的添加，达到发酵代谢控制的目的，可显著提高底物利用率和肌醇产量，在底物为40g/L蔗糖时，其底物利用率最高可达100％，肌醇产量最高可达59.35g/L，同时，当进一步采用过程补料及相关过程控制手段时，其肌醇产量可进一步提高。本发明将构建高产重组菌株与发酵控制营养盐技术相结合，通过构建代谢通路及发酵控制手段，方法简单，便于使用，降低生产成本，具有很好的应用前景及工业价值。

附图说明

图1为本发明中PCR检测重组解淀粉芽孢杆菌01的验证图；其中，泳道1、3、5、7为出发菌株PCR结果，泳道2、4、6、8分别为；重组解淀粉芽孢杆菌01Δ5.3.9.11::5.5.1.4，替换2.7.1.11，Δ5.3.1.9，替换2.7.1.2的PCR结果；

图2为本发明中PCR检测重组解淀粉芽孢杆菌02的验证图；其中，泳道1、3、5、7为出发菌株PCR结果，泳道2、4、6、8分别为；重组解淀粉芽孢杆菌02Δ5.3.9.11::5.5.1.4，Δ5.3.1.9，替换2.7.1.2的PCR结果；

图3为本发明中PCR检测重组解淀粉芽孢杆菌03的验证图；其中，泳道1、3、5、7为出发菌株PCR结果，泳道2、4、6、8分别为；重组解淀粉芽孢杆菌03插入5.5.1.4，替换2.7.1.11，Δ5.3.1.9，替换2.7.1.2的PCR结果。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，所述解淀粉芽孢杆菌的名称为：G2-9，分类名称为：解淀粉芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCCNO.26351，保藏日期：2022年12月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该解淀粉芽孢杆菌是从中国传统食醋醋醅中分离获取，于RCM培养基上培养，菌落呈圆形、浅黄色、不透明、边缘不整的形态。

一株以如上所述的解淀粉芽孢杆菌为出发菌株构建的重组菌株。

如上所述的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

较优地，具体包括如下步骤：

如上所述的重组菌株在发酵生产肌醇方面中的应用。

一种利用如上所述的重组菌株生产肌醇的方法，所述方法包括以蔗糖为底物，以所述重组菌株通过生物发酵生产肌醇。

较优地，所述方法还包括：在所述重组菌株发酵过程中添加发酵补充剂，所述发酵补充剂包括发酵补充剂1和发酵补充剂2，按照体积计：

发酵补充剂1为：硫酸锰0.03-0.08g/L，硝酸钾0.001-0.005g/L；

发酵补充剂2为：丙酮酸0.006-0.01g/L，6-磷酸果糖二钠0.01-0.02g/L，乙酸0.005-0.01g/L。

较优地，所述重组菌株在发酵生产肌醇过程中，在发酵时间6-12h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂1，在发酵时间24-30h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂2。

较优地，在发酵时间7.5h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂1，在发酵时间26h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂2。

具体地，相关制备及检测实施例如下：

实施例1：

构建肌醇高效生产菌株01，采用的基因编辑方法参照文献(RuanL,LiL,ZouD.etal.MetabolicengineeringofBacillusamyloliquefaciensforenhancedproductionof S-adenosylmethioninebycouplingofanengineeredS-adenosylmethioninepathwayandthetricarboxylicacidcycle.BiotechnolBiofuels12,211(2019).)，进行具体方法如下：

1、构建同源重组质粒

敲除解淀粉芽孢杆菌的肌醇分解酶EC5.3.99.11，并将肌醇-3-磷酸合成酶(EC5.5.1.4)的编码基因整合在肌醇分解酶基因位点。选取解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.26351的基因组DNA为模板，利用上下游同源臂引物分别扩增出肌醇分解酶EC5.3.99.11同源臂序列片段A和B。同时，利用对应引物扩增来源于青春双歧杆菌的肌醇-3-磷酸合成酶(EC5.5.1.4)片段C。利用重叠PCR将A，B和C进行整合，得到整合片段用于完成肌醇分解酶EC5.3.99.11与肌醇-3-磷酸合成酶EC5.5.1.4的插入。该片段与T2(2)-ori载体同时用限制性内切酶BamHI和XbaI进行双酶切，回收后用T4DNA连接酶连接，构建重组质粒T2Δ11::4，将其电转到解淀粉芽孢杆菌感受态细胞中。

2、基因重组菌株筛选

将电转后的感受态细胞涂布纸含有kan的固体LB平板上。PCR验证后，将阳性克隆接种至含有kan的LB液体培养基中，45℃，180rpm振荡培养8h。经进一步的kan抗性筛选和PCR验证，挑取单交换菌株，转入LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养8h，传代培养数次。最后将传代培养的菌体涂布至LB平板，并将每个单菌落划线至不含Kan的LB和含有Kan的LB平板上，筛选Kan敏感菌落，经引物checkF1和checkR1进行进一步PCR验证，可以发现存在与出发菌株大小不同的条带，且与预计条带大小1264bp相符，证明成功得到双交换菌株。

3、后续解淀粉芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶(EC2.7.1.11)基因替换，磷酸己糖异构(EC5.3.1.9)基因敲除，葡萄糖苷酶(EC2.7.1.2)基因替换，ADP-葡萄糖淀粉合成酶(EC2.4.1.21)基因敲除采用同样的方法进行。

如图1所示，经PCR验证，获得与理论结果相符的条带，证明重组解淀粉芽孢杆菌01构建成功。最终构建敲除解淀粉芽孢杆菌的肌醇分解酶EC5.3.99.11，并将来源于青春双歧杆菌的肌醇-3-磷酸合成酶(EC5.5.1.4)的编码基因整合在肌醇分解酶基因位点；并将解淀粉芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶(EC2.7.1.11)基因替换为来源于枯草芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶基因；并将解淀粉芽孢杆菌的磷酸己糖异构(EC5.3.1.9)基因敲除；并将解淀粉芽孢杆菌的葡萄糖苷酶(EC2.7.1.2)基因替换为来源于地衣芽孢杆菌的葡萄糖苷酶基因的重组解淀粉芽孢杆菌01，用于高效生产肌醇。

4、上述菌株构建过程涉及的引物见下表

表1重组解淀粉芽孢杆菌01构建与验证PCR引物

实施例2：

1、发酵生产肌醇选用如下发酵补充剂1和发酵补充剂2，以体积计：

发酵补充剂1：硫酸锰0.05g/L，硝酸钾0.003g/L；

发酵补充剂2：丙酮酸0.008g/L，6-磷酸果糖二钠0.015g/L，乙酸0.008g/L。

2、发酵补充剂添加时间：

发酵生产肌醇过程中，在发酵时间7.5h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂1，在发酵时间26h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂2。

对比例1：

构建用于生产肌醇的菌株02，基因编辑方法同实施例1。

如图2所示，经PCR验证，获得与理论结果相符的条带，证明重组解淀粉芽孢杆菌02构建成功。最终构建敲除解淀粉芽孢杆菌的肌醇分解酶EC5.3.99.11。并将来源于青春双歧杆菌的肌醇-3-磷酸合成酶(EC5.5.1.4)的编码基因整合在肌醇分解酶基因位点；并将解淀粉芽孢杆菌的磷酸己糖异构(EC5.3.1.9)基因敲除；并将解淀粉芽孢杆菌的葡萄糖苷酶(EC2.7.1.2)基因替换为来源于地衣芽孢杆菌的葡萄糖苷酶基因的重组解淀粉芽孢杆菌02，用于生产肌醇。

上述菌株构建过程涉及的引物见下表

表2重组解淀粉芽孢杆菌02构建与验证PCR引物

对比例2：

构建用于生产肌醇的菌株03，基因编辑方法同实施例1。

如图3所示，经PCR验证，获得与理论结果相符的条带，证明重组解淀粉芽孢杆菌03构建成功。最终构建将来源于青春双歧杆菌的肌醇-3-磷酸合成酶(EC5.5.1.4)的编码基因整合在肌醇分解酶基因位点下游；并将解淀粉芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶(EC2.7.1.11)基因替换为来源于枯草芽孢杆菌的6-磷酸果糖激酶基因；并将解淀粉芽孢杆菌的磷酸己糖异构(EC5.3.1.9)基因敲除；并将解淀粉芽孢杆菌的葡萄糖苷酶(EC2.7.1.2)基因替换为来源于地衣芽孢杆菌的葡萄糖苷酶基因的重组解淀粉芽孢杆菌03，用于生产肌醇。

上述菌株构建过程涉及的引物见下表

表3重组解淀粉芽孢杆菌03构建与验证PCR引物

对比例3：(添加时间对比)

1、发酵生产肌醇选用如下发酵补充剂1和发酵补充剂2，以体积计：

发酵补充剂1：硫酸锰0.05g/L，硝酸钾0.003g/L；

发酵补充剂2：丙酮酸0.008g/L，6-磷酸果糖二钠0.015g/L，乙酸0.008g/L。

2、发酵补充剂添加时间：

发酵生产肌醇过程中，在发酵时间开始0h即添加全部发酵补充剂。

对比例4：(补充剂配方对比)

1、发酵生产肌醇选用如下发酵补充剂1和发酵补充剂2，以体积计：

发酵补充剂1：硫酸锰0.05g/L；

发酵补充剂2：丙酮酸0.008g/L。

2、发酵补充剂添加时间：

发酵生产肌醇过程中，在发酵时间7.5h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂1，在发酵时间26h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂2。

对比例5：(补充剂配方对比)

1、发酵生产肌醇选用如下发酵补充剂1和发酵补充剂2，以体积计：

发酵补充剂1：硝酸钾0.003g/L；

发酵补充剂2：6-磷酸果糖二钠0.015g/L，乙酸0.008g/L。

2、发酵补充剂添加时间：

发酵生产肌醇过程中，在发酵时间7.5h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂1，在发酵时间26h时向发酵培养基中添加所述发酵补充剂2。

实验例：

按照上述实施例及对比例所述的菌株及发酵补充剂的添加方式发酵生产肌醇，其中所述的发酵培养基包括：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.1％。

将构建成功的重组解淀粉芽孢杆菌在34-38℃下活化并接种至LB培养基，34-38℃、150-250rpm培养15-20h至OD

利用10L发酵罐发酵生产肌醇，将培养好的种子液以5％的接种量接种于含有40g/L蔗糖底物的发酵培养基中进行催化发酵，比较不用重组菌株及发酵补充剂对肌醇产量的影响，结果如表4所示，不同菌株与发酵剂不同配比和添加方式的不同组合，对应的肌醇产量各有差异，其中以实施例1和实施例2所述菌株及发酵剂的肌醇产量最高。

补充说明，蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖缩合脱水而成，实施例1高产肌醇的一部分原因推测其可以近乎完全的利用蔗糖中的葡萄糖并利用一部分果糖，将其转化为肌醇。另，如选用发酵过程中补加蔗糖的方式，肌醇产量可进一步提高。

表4肌醇产量对比

本发明中使用的序列可以如下：

EC5.3.99.11

敲除序列

DNA834

ATGAAACTTTGCTTTAATGAAGCGACTACGCTGGAGAATTCAAACCTGAAACAGGATTT

AGAACTGTGCGAAAAGCACGGCTATGATATATTGAAATCCGCACAATGGATAAACTGCC

GGAATACTTAAAGACCATTCACTGGCCGATCTGGCGGAATATTTTCGCACCCATCACATT

AAACCGCTTGCCCTGAACGCACTGGTTTTCTTCAACAACCGTGATGAGAAGGGCTATAG

GGAGATCATTTCGGAATTCAAAAGCATGATGGAAACCTGCAGGACGCTCGGCGTGAAAT

ATGTGGTGGCCGTGCCGCTTGTGACAGAGCGGAAGATCTTGAAAGAAGAGATCAAAAA

GAGCATAGAGGTGCTGACTGAGCTTTCGGACATCGCGGAGCCGTACGGCGTAAACATTG

CCCTTGAATTTGTCGGCCACCCGCAATGTACGGTCAATACATTTGAACAGGCGTATGACA

TCGTGAACGCTGTCGGCCGCGATAATGTCGGACTGGTGTTTGACAGCTTCCATTTCCACG

CGATGGGCTCCAATATTGAGAGCTTGAAGCAGGCGGACGGAAAGAAAATTTTCATCTAT

CATCGACGATACAGAAGACTTTCCGATCGGCTTTTTAACAGATGAAGACCGCGTCTGGC

CTGGACAGGGTGCGATTGACTTAGACGCCCATCTGTCAGCGTTAAAGAAATCGGATTCA

ATGATGTTGTCTCCGTAGAGCTGTTCAGACCTGAATATTATAAGCTGACTGCGGAGGAAA

CGATCAAAACGGCAAAGGAAACAACGGAAGCCGTCGTATCAAATACTTCATGAAGGAG

GCGTGA

EC5.5.1.4

插入序列Streptomycesdrozdowiczii1078

ATGGGTTCGGTTCGCGTGCCATCGTCGGCGTGGGCAACTGCGCCGCCTCGCTGGTCCAG

GGCGTCGAGTACTACAAGGACGCCGATCCGGCCGGCAAGGTGCCCGGCCTGATGCACG

TCCAGTTCGGCGACTACCACGTGCGGGACGTCGAGTTCGTCGCCGCCTTCGACGTCGAC

GCGAAGAAGGTCGGCCTCGACCTCTCGGACGCCATCGGTGCGAGCGAGAACAACACCA

TCAAGCTCTGCGACGTGCCGCACGCCGGTGTCACCGTCCAGCGCGGCCAACCCACGAC

GGGCTCGGCAAGTACTACCGCCAGACCATCGAGGAGTCGGCCGAGGCCCCGGTCGACG

TCGTCCAGGTCCTCAAGGACCGCAAGGTCGACGTCCTCGTCTGCTACCTCCCGGTGGGT

TCCGAGGTGGCCGCGAAGTTCTACGCCCAGTGCGCCATCGACGCCAAGGTCGCGTTCGT

CAACGCTCTCCCGGTCTTCATCGCCGGCACCAAGGAGTGGGCGGACAAGTTCACCGAG

GCCGGTGTCCCGATCGTCGGCGACGACATCAAGTCGCAGGTCGGCGCCACCATCACGC

ACCGCGTGATGGCGAAGCTCTTCGAGGACCGGGGCGTCATCCTGGACCGCACGATGCA

GCTGAACGTCGGCGGCAACATGGACTTCAAGAACATGCTCGAGCGTGAGCGCCTGGAG

TCCAAGAAGATCTCCAAGACGCAGGCCGTCACCTCGCAGATCCGTGACCGCGAGCTCG

GCGCGGACAACGTCCACATCGGCCCGTCGGACTACGTGGCCTGGCTGGACGACCGCAA

GTGGGCGTACGTGCGCCTCGAGGGCCGCGCCTTCGGCGACGTCCCGCTGAACCTGGAG

TACAAGCTCGAGGTCTGGGACTCCCCGAACTCCGCCGGTGTCATCATCGACGCCGTCCG

TGCCGCGAAGATCGCCAAGGACCGCGGCATCGGCGGCCCGATCCTCTCGGCCTCCTCGT

ACTTCATGAAGTCCCCGCCGGTCCAGTACTTCGACGACGAGGCCCGCGAGAACGTCGA

GAAGTTCATCCGCGGTGAGGTCTCCAAC

EC5.5.1.4

插入序列Bifidobacteriumadolescentis1139

ATGAGCATTCGAGTGGCTATCGCCGGCGTGGGCAATTGCGCCTCGTCGCTGGTGCAGGG

CGTTGAGTATTACAAGGACACCAAGGACGAGGATAAGATTCCCGGCCTGATGCACAACA

ATTTCGGTGGCTACCGCGTGCGTGACATCGAATTCGTCACCGCGTTCGACGTGGATGCG

CTGAAGGTGGGCAAGGATCTGTCCGAGGCGATTGGCGCTTCTCAGAACAACACCATCA

AATTCGCGGACGTGCCGAATCTGGGCGTGGAGGTGCTGCGTGGCCCGACTAACGACGG

CTTGGGCGAATACTACCGCCAGATGATCGAAGAGTCGGACGCCGAACCGGTGGACGTG

GCCCAGGTGCTGCGTGACAAGAAGGTCGACGTGCTGGTTTCCTACCTGCCGGTTGGTTC

CGAGAAGGCGGACAAGGCTTACGCTCAGGCCGCTATGGACGCTGGCTGCGCGTTCGTG

AACTGCCTGCCGGTGTTCATCGCCTCCGATCCGGAGTGGGCGCAGAAGTTCCGTGACGC

TGGTGTGCCGATTGTCGGCGACGATATCAAGTCGCAGGTCGGCGCCACCATCACGCACC

GCGTGCTGGCCCGTCTGTTCGAGGATCGCGGCGTGCGTCTGGATCGTACGTACCAGCTT

AACGTCGGCGGCAACATGGACTTCATGAACATGCTGCAGCGTTCCCGCCTGGAATCCAA

GAAGATCTCCAGACCCGCGCCGTCACTTCCGTGGTGCCGCACGAGATGGATCCGCACAA

CGTGCATATCGGCCCGTCCGATTACGTGGCTTGGCTTGACGACCGCAAGTTCGCCTTCGT

GCGTCTTGAGGGCACCACGTTCGGCGATGTGCCGCTGAACCTCGAATACAAGCTCGAGG

TGTGGGATTCCCCGAATTCCGCCGGTATTGTGATCGACGCCGTGCGTGCGGCCAAGATC

GCGCTCGATCGTCATCTGGCCGGTCCGGTTCTGGCTCCGAGCTCCTACTTCATGAAGTCT

CCGGCCGTGCAGCACGAGGATGGCGAGGCCCGCCGCTTGGTGGAGGAATTCATCAAGG

GTGAGGTCGAAGGCACCGAAGAGCAGCTTGACGCCGATGTGGCGGCCGCGAAGGCCG

CCGGCAAGGATGTGTGGCGCGCA

EC5.5.1.4

插入序列Rhodococcus1081

ATGGCTGACACCAACCGCACGAGCGTGCGCGTCGCGATCGTGGGCGTGGGCAACTGTG

CCTCGTCCCTGGTCCAGGGCGTGCAGTACTACCAGGACGCCGACGAGAACGCGACGGT

CCCCGGCCTCATGCACGTCCGCTTCGGCCCTTACCACGTCCGCGACGTCGAGTTCGTCG

CCGCGTTCGACGTGGACGCCAAGAAGGTCGGCTTCGACCTGAACGAGGCGATCGTCTC

CAGCGAGAACAACACCATCAAGATCGCCGACGTGCCCCGACGGGCGTCATCGTCCAGC

GCGGCCCCACCAACGACGGTCTCGGCAAGTACTACCTGGAGACCATCACCGAGTCCGA

CGCCGAGCCGGTCGACATGGTCGCCGCGCTCAAGGACGCCGACGTCGACGTCCTGGTC

TGCTACCTCCCGGTGGGCTCGGAGGTCGCCGCCAAGCACTACGCGCAGTGCGCCATCGA

CGCGGGCGTGGCCTTCGTGAACGCCCTGCCGGTGTTCATCGCCTCCGACCCCGTGTGGG

CCAAGAAGTTCGAGGACGCGGGCGTGCCGATCGTCGGCGACGACATCAAGAGCCAGGT

GGGCGCGACCATCACCCACCGCGTGCTCGCCAAGCTGTTCGAGGACCGCGGCGTGCAG

CTCGACCGCACCATGCAGCTCAACGTCGGCGGCAACATGGACTTCAAGAACATGCTCG

AGCGCGAGCGCCTGGAGTCCAAGAAGATCTCCAAGACCCAGGCCGTCACGTCCAACCT

GCAGCGGGAAGTGGGCGCCAACAACGTCCACATCGGACCGTCGGGACTACGTCGCGTG

GCTCGACGACCGCAAGTGGGCCTACGTCCGCCTCGAGGGACGTGCGTTCGGTGACGTG

CCGCTGAGCCTGGAGTACAAGCTCGAGGTCTGGGACTCCCCGAACTCGGCCGGCATCAT

CATCGACGCCGTCCGGGCCGCGAAGATCGCCAAGGACCGCGGCATCGGTGGCCCCGTG

TTCGCCGCGGCCAGCTACCTGATGAAGTCGCCGCCGCGCCAGCTGGCCGACGACGTGG

CCCGCACCCAGCTCGAGGAGGTTCATCGCGGGC

敲除序列EC2.7.1.11

Bacillusamyloliquefaciens957

ATGAAGCGTATAGGAGTTTTAACGAGCGGCGGGGATTCCCCGGGTATGAACGCTGCGGT

GCGCGCGGTTGTGCGGAAAGCTATCTACCACGACGTCGAAGTGTACGGAATTTATAACG

GTTATTCAGGATTAATCAGCGGAAAAATAGAGAAACTGGAGCTTGGTTCGGTCGGTGAC

ATCATCCACCGCGGCGGAACAAAGCTGTATACGGCCAGATGTCCTGAATTCAAAACAGT

TGAAGGCCGTGAAAAAGGAATCGAAAATTTAAAGAAACTCGGCATTGAAGGTCTTGTC

GTCATCGGCGGAGACGGTTCATACATGGGTGCGAAAAAATTAACGGAACACGGGTTTCC

GTGTGTAGGTGTACCGGGTACGATAGATAATGACATCCCGGGAACTGATTTTACGATCGG

ATTTGATACGGCGCTAAACACCGTAATTGATGCGATTGATAAAATCCGTGACACCGCTAC

GTCTCATGAGCGTACATACGTTATTGAAGTGATGGGGCGCCATGCGGGCGACATTGCTTT

ATGGGCAGGTCTTGCAGGCGGAGCGGAATCAATTTTAATTCCTGAAGCGGACTACGATAT

GCAGGAAATTATCGGCCGTTTGAAGAGAGGGCACGACCGCGGCAAAAAACACAGTATC

ATCATCGTTGCAGAAGGGGTAGGCAGCGGAGTTGAATTCGGAAAACGCATCGAAGAAG

AAACGAACCTTGAAACACGGGTATCCGTTTTAGGGCACATCCAGCGCGGCGGATCTCCA

AGCGCTTCTGACCGGGTTCTTGCAAGCCGCCTCGGCGCTTACGCGGTTGAGCTTCTGCT

TAAAGGAAAAGGCGGACGCTGCGTAGGTATACAAAACAACAAGCTTGTAGACCATGATA

TTATAGAAATTTTAGAATCAAAACATACTGTTGAACCAAACATGTATCAGCTTTCAAAAG

AACTGTCTATT

替换序列EC2.7.1.11

Escherichiacoli960

ATGATTAAGAAAATCGGTGTGTTGACAAGCGGCGGTGATGCGCCAGGCATGAACGCCGC

AATTCGCGGGGTTGTTCGTTCTGCGCTGACAGAAGGTCTGGAAGTAATGGGTATTTATGA

CGGCTATCTGGGTCTGTATGAAGACCGTATGGTACAGCTAGACCGTTACAGCGTGTCTGA

CATGATCAACCGTGGCGGTACGTTCCTCGGTTCTGCGCGTTTCCCGGAATTCCGCGACG

AGAACATCCGCGCCGTGGCTATCGAAAACCTGAAAAAACGTGGTATCGACGCGCTGGT

GGTTATCGGCGGTGACGGTTCCTACATGGGTGCAATGCGTCTGACCGAAATGGGCTTCC

CGTGCATCGGTCTGCCTGGCACTATCGACAACGACATCAAAGGCACTGACTACACTATC

GGTTTCTTCACTGCGCTGAGCACCGTTGTAGAAGCGATCGACCGTCTGCGTGACACCTC

TTCTTCTCACCAGCGTATTTCCGTGGTGGAAGTGATGGGCCGTTATTGTGGCGATCTGAC

GTTGGCTGCGGCCATTGCCGGTGGCTGTGAATTCGTTGTGGTTCCGGAAGTTGAATTCA

GCCGTGAAGACCTGGTAAACGAAATCAAAGCGGGTATCGCGAAAGGTAAAAAACACGC

GATCGTGGCGATTACCGAACATATGTGTGATGTTGACGAACTGGCGCATTTCATCGAGAA

AGAAACCGGTCGTGAAACCCGCGCAACTGTGCTGGGCCACATCCAGCGCGGTGGTTCT

CCGGTGCCTTACGACCGTATTCTGGCTTCCCGTATGGGCGCTTACGCTATCGATCTGCTGC

TGGCAGGTTACGGCGGTCGTTGCGTAGGTATCCAGAACGAACAGCTGGTTCACCACGAC

ATCATCGACGCTATTGAAAACATGAAGCGTCCGTTCAAAGGCGACTGGCTGGACTGCGC

GAAAAAACTGTAT

替换序列EC2.7.1.11

Bacillussubtilis957

ATGAAACGTATAGGGGTATTAACGAGCGGCGGGGATTCCCCGGGAATGAACGCAGCAGT

TCGCGCAGTAGTCAGAAAAGCGATTTATCATGACGTTGAAGTTTACGGCATTTACAACG

GATACGCAGGATTGATCAGCGGAAAGATTGAAAAGCTTGAACTCGGATCTGTAGGCGAT

ATTATACATCGCGGAGGAACAAAGCTTTATACGGCAAGATGTCCTGAATTCAAAACGGTT

GAAGGCCGTGAAAAAGGGATAGAAAACTTGAAGAAGCTCGGTATTGAAGGCCTTGTTG

TCATCGGCGGAGACGGTTCCTATATGGGTGCCAAAAAATTAACGGAACACGGGTTTCCA

TGTGTAGGTGTACCGGGTACAATTGATAACGACATTCCGGGCACTGATTTTACAATCGGC

TTCGATACAGCTTTAAATACAGTAATTGACGCAATTGATAAGATTCGCGACACAGCGACT

TCTCATGAACGTACATATGTGATCGAAGTAATGGGCCGCCATGCCGGCGATATCGCATTG

TGGGCCGGTCTTGCAGGGGGCGCGGAATCAATCTTGATCCCTGAGGCAGACTATGACAT

GCACGAAATCATTGCCCGCTTAAAACGCGGCCACGAACGCGGCAAGAAGCACAGTATTA

TTATTGTCGCCGAAGGTGTAGGCAGCGGTGTTGAATTCGGGAAACGCATTGAAGAAGAA

ACAAATCTTGAAACTAGGGTATCTGTATTGGGCCATATCCAGCGCGGAGGTTCTCCGAGC

GCTGCTGACCGCGTGCTGGCAAGCCGTCTTGGCGCATATGCAGTTGAACTGCTGCTTGA

AGGAAAAGGCGGACGCTGTGTAGGTATACAAAACAATAAGCTTGTAGACCATGATATTAT

AGAAATACTGGAAACAAAACACACAGTTGAGCAAAACATGTATCAGCTTTCAAAAGAA

CTGTCTATT

替换序列EC2.7.1.11

Bacilluslicheniformis

DNA960

ATGAAACGTATCGGAGTATTGACAAGCGGCGGAGATTCCCCGGGAATGAACGCGGCGGT

CCGCGCGGTTGTCAGGAAAGCGATCTACCATGACGTAGAAGTATACGGAATTTACAACG

GGTATTCAGGTTTAATCAGCGGAAAAATAGAAAAGCTTGAAATCGGTTCTGTCGGAGAT

ATCATTCACCGCGGAGGAACGAAGCTATATACAGCAAGGTGTCCTGAGTTTAAAACGGT

AGAAGGACGGGAAAAAGGAATAGCGAATTTAAAAAAATATGGTATAGAAGGATTAGTCG

TCATTGGCGGCGACGGTTCTTATATGGGAGCCAAAAAGCTCACAGAACACGGTTTTCCT

TGTGTGGGAGTGCCGGGAACGATCGACAATGACATCCCAGGCACAGATCTGACGATCG

GATTCGATACGGCGCTAAATACCGTTATCGACGCCATCGATAAAATCAGGGATACAGCTA

CATCCCATGAACGTACATACGTGATTGAAGTAATGGGCCGCCATGCCGGGGACATTGCTT

TATGGTCAGGTTTGGCCGGAGGCGCGGAATCCATTTTGATTCCTGAAGCCGACTACGATA

TGGAAGAAATTATTGCAAGGCTGAAAAGAGGGCATGAGCGCGGCAAGAAACACAGCAT

CATCATTGTGGCGGAAGGCGTCGGCAGCGGCGTTGAATTCGGAAAAAGAATTGAAGAA

GCCACAAATCTCGAAACTAGAGTATCGGTGCTTGGACATATCCAGCGCGGCGGTTCCCC

GACTGCAGCAGACCGCGTATTGGCAAGCCGTCTAGGGGCATTTGCGGTTGAACTGCTTC

TTGAAGGAAAAGGCGGACGTTGTGTAGGAATTCAAAATAACCAGCTTGTGCATCATGAT

ATCATTGAAATACTCGAGCAAAAACATACAATTGATCAAAGCATGTACCGCTTGTCTCAA

GAACTGTCAATCTAG

敲除序列EC5.3.1.9

Bacillussubtilis1353

ATGACGCATGTACGCTTTGACTACTCAAAAGCGTTGACTTTCTTCAACGAACATGAACTT

ACATACCTGCGGGACTTTGTAAAAACAGCACACCATAATATCCATGAGAAAACAGGCGC

GGGCAGCGATTTTCTAGGCTGGGTGGACCTCCCTGAACATTATGATAAAGAAGAATTCG

CGCGCATCAAAAAAAGCGCGGAAAAAATCAAATCTGACTCTGATGTCTTGCTTGTTGTC

GGCATCGGCGGTTCTTATCTTGGAGCGCGGGCAGCGATTGAAGCGCTGAATCACGCGTT

TTATAACACTTTGCCAAAAGCAAAACGCGGCAATCCGCAAGTCATTTTTATCGGGAACA

ACATCAGTTCATCTTATATGAGAGACGTCATGGATCTTCTTGAAGATGTTGACTTCTCTAT

TAATGTGATTTCTAAATCAGGTACGACAACTGAACCTGCAATCGCTTTCCGTATTTTCCGC

AAGCTTCTTGAAGAGAAATACGGTAAAGAAGAAGCGAAAGCGCGGATTTATGCAACAA

CTGATAAAGAGCGCGGCGCATTAAAAACGCTTTCTAACGAAGAAGGCTTTGAATCATTC

GTAATTCCTGACGATGTCGGCGGCCGTTATTCAGTTTTAACAGCTGTAGGTCTCTTGCCG

ATTGCTGTCAGCGGCGTCAACATTGACGACATGATGAAAGGCGCCCTGGATGCGAGCAA

AGATTTTGCAACATCTGAACTGGAAGATAACCCAGCATACCAATATGCGGTTGTTCGCAA

TGTCCTTTATAATAAGGGCAAAACAATTGAAATGCTCATCAACTACGAACCGGCGCTTCA

ATACTTTGCGGAATGGTGGAAGCAGCTGTTCGGAGAAAGCGAAGGGAAAGATGAGAAG

GGCATTTATCCTTCTTCAGCGAACTATTCAACAGACCTTCATTCTTTAGGCCAGTATGTAC

AAGAAGGCCGCAGAGATTTATTCGAAACGGTCCTGAACGTAGAGAAGCCTAAACATGA

ACTGACAATTGAGGAAGCGGATAACGATCTTGACGGCTTGAACTATTTAGCCGGTAAAA

CTGTTGATTTCGTTAACAAAAAAGCATTCCAAGGTACAATGCTTGCCCATACAGACGGA

AATGTTCCGAACTTAATCGTTAACATTCCTGAGCTGAATGCATATACTTTTGGATACCTTG

TATATTTCTTCGAAAAAGCCTGCGCGATGAGCGGTTACCTCCTTGGCGTCAATCCGTTTG

ACCAGCCTGGTGTAGAAGCGTATAAAGTCAATATGTTTGCGTTACTCGGCAAACCTGGCT

TTGAAGAGAAAAAAGCAGAGCTTGAAAAACGTCTGGAAGATTAA

敲除序列EC2.7.1.2

Bacillusamyloliquefaciens963

ATGGAAGATACATGGTTTGCGGGGATTGATCTTGGCGGGACAACCATCAAGCTGGCCTT

CATCAACATGTACGGTGAAATTCAGCATAAATGGGAAGTTCCGACCGATAAATCAGGAA

ACACAATTACGGTCACGATCGCCAAAGCGCTTGACCAGAAGCTGGAAGAACTGAACAA

GCCGAAACGGATCGTAAAATGGATCGGAATGGGAGCGCCCGGACCCGTGGAAATGGCG

ACGGGAGTGGTCTATGAGACGACAAATATGGGGTGGAAAAACTATCCGCTGAAAGACCA

TCTCGAGGCGGAAACGGGTATTCCGGCCGTCATTGAAAACGATGCCAATATCGCGGCGC

TCGGAGAAATGTGGAAGGGTGCAGGTGACGGGGCCAAAGATGTCATTTTAGTGACGCT

CGGAACCGGAGTCGGCGGAGGCATCATCGTCAACGGAGAAATCGTTCACGGTAAAAAC

GGGGCCGGCGGAGAAATCGGTCATATTTGCAGTATTCCGGAAGGAGGAGCTCCGTGCAA

CTGCGGAAAATCCGGCTGCATCGAAACGATTGCGTCCGCAACCGGCATCGTCCGCATCG

CGAAAGAAAAGCTTGCGGCTGTTTCCGACTCTTCGCTCTTACAAGTGCGCGATCTGACG

GCACGTGACGTGTTCGAAGCGGCTAAACAGCAGGATAAGACAGCGCTTGAAGTCGTCG

ATTATGTCGCAAAACATTTAGGCCTCGTGCTCGGAAATCTGGCAAGCGCCATGAATCCGA

CGAAAATCGTGCTCGGCGGAGGCGTGTCCAAAGCGGGTGAAATCCTGCGGTCAAAAGT

GGAAGAGACTTTCAAAATCACCGCATTCCCGCGTTCTGCGGAAGCGGCGGATATTTCGA

TTGCGGCACTTGGAAATGACGCCGGAGTCATCGGCGGGGCGTGGATTGCCAAAAATGA

ATGGCTCAAACATCAAAACTGCTGA

11.

替换序列EC2.7.1.2

Escherichiacoli966

ATGACAAAGTATGCATTAGTCGGTGATGTGGGCGGCACCAACGCACGTCTTGCTCTGTG

TGATATTGCCAGTGGTGAAATCTCGCAGGCTAAGACCTATTCAGGGCTTGATTACCCCAG

CCTCGAAGCGGTCATTCGCGTTTATCTTGAAGAACATAAGGTCGAGGTGAAAGACGGCT

GTATTGCCATCGCTTGCCCAATTACCGGTGACTGGGTGGCGATGACCAACCATACCTGGG

CGTTCTCAATTGCCGAAATGAAAAAGAATCTCGGTTTTAGCCATCTGGAAATTATTAACG

ATTTTACCGCTGTATCGATGGCGATCCCGATGCTGAAAAAAGAGCATCTGATTCAGTTTG

GTGGCGCAGAACCGGTCGAAGGTAAGCCTATTGCGGTTTACGGTGCCGGAACGGGGCT

TGGGGTTGCGCATCTGGTCCATGTCGATAAGCGTTGGGTAAGCTTGCCAGGCGAAGGCG

GTCACGTTGATTTTGCGCCGAATAGTGAAGAAGAGGCCATTATCCTCGAAATATTGCGTG

CGGAAATTGGTCATGTTTCGGCGGAGCGCGTGCTTTCTGGCCCTGGGCTGGTGAATTTGT

ATCGCGCAATTGTGAAAGCTGACAACCGCCTGCCAGAAAATCTCAAGCCAAAAGATATT

ACCGAACGCGCGCTGGCTGACAGCTGCACCGATTGCCGCCGCGCATTGTCGCTGTTTTG

CGTCATTATGGGCCGTTTTGGCGGCAATCTGGCGCTCAATCTCGGGACATTTGGCGGCGT

GTTTATTGCGGGCGGTATCGTGCCGCGCTTCCTTGAGTTCTTCAAAGCCTCCGGTTTCCG

TGCCGCATTTGAAGATAAAGGGCGCTTTAAAGAATATGTCCATGATATTCCGGTGTATCTC

ATCGTCCATGACAATCCGGGCCTTCTCGGTTCCGGTGCACATTTACGCCAGACCTTAGGT

CACATTCTGTAA

12.

替换序列EC2.7.1.2

Bacillussubtilis

DNA966

ATGGACGAGATATGGTTTGCGGGCATTGACCTGGGAGGAACGACGATTAAACTCGCTTT

TATTAATCAATATGGCGAAATTCAGCATAAGTGGGAAGTTCCGACAGATAAAACCGGCG

ACACGATTACTGTCACAATTGCAAAAACAATCGACAGCAAGCTGGATGAGCTGCAAAA

ACCGAAGCACATCATCAAATACATCGGAATGGGTGCACCAGGCCCTGTAGATATGGCGG

CAGGAGTGGTTTATGAAACAGTAAATCTAGGGTGGAAAAATTATGCTTTGAAAAACCAT

CTGGAGACAGAAACCGGCATCCCAGCTGTTATAGAAAATGACGCGAATATTGCTGCGCT

CGGGGAAATGTGGAAGGGAGCGGGTGATGGCGCAAAAGACGTCATTCTCGTGACGCTT

GGCACAGGAGTTGGCGGCGGCATCATTGCAAATGGTGAAATTGTACATGGTATAAATGG

CGCCGGCGGAGAAATCGGCCATATTTGCAGCATCCCTGAAGGCGGAGCGCCCTGCAACT

GCGGCAAAACGGGCTGTATCGAAACAATTGCGTCAGCAACCGGAATTGTAAGAATTGCA

AAAGAAAAAATAGCAAATGCTAAAAAGACGACACGTTTAAAAGCAACCGAACAATTGT

CAGCGCGAGATGTGTTTGAAGCGGCGGGTGAAAATGATGAAATTGCCCTTGAGGTGGTT

GATTATGTAGCCAAGCATCTTGGTTTGGTGCTCGGAAATTTGGCAAGCTCGCTTAATCCA

TCCAAAATCGTTCTTGGCGGCGGCGTATCGAGAGCCGGAGAACTGCTGAGATCAAAAGT

CGAGAAAACATTCCGCAAATGCGCGTTTCCGCGGGCAGCCCAAGCTGCTGATATTTCAA

TCGCAGCACTTGGAAATGATGCCGGCGTTATCGGAGGCGCTTGGATCGCTAAAAATGAA

TGGCTGAAACATCAAAATTGTTAA

13.

替换序列EC2.7.1.2

Bacilluslicheniformis

DNA975

ATGAATGACAGCTGGCTGGTCGGGGTCGACCTTGGAGGAACAACAGTAAAACTCGCTT

TTGTAAGCGCTTATGGCGAAATCCTGCACAAGTGGGAAATCCCGACCGATAAATCAGGG

AAAACGGTTACGGTAAGCATCGCGAAAGCCATCGACAGCAAATTGAACGAGCTCGGCA

AACCGAAGCACATCTTAAAATGGATCGGCATGGGCGCTCCCGGACCCGTCAATACGGAG

ACCGGCATCGTTTATAAAACGACGAATATGGGCTGGGAAAACTACCCGTTGAAAGACCA

TCTGGAAGCAGAGACAGGGATAGCTGCGGTCATTGAAAATGACGCGAACATCGCAGCT

CTCGGCGAAATGTGGAAGGGAGCGGGAGACGGCGCGAAGGATTTGATTCTTGTTACATT

GGGAACGGGCGTTGGAGGCGGCATTATTGTAAACGGGGAAATCGTCCGCGGGCAAAAC

GGAGCAGGCGGTGAAATCGGCCACATCTGTTCTGTTCCAGAAGGCGGAGCGCCGTGCA

ACTGCGGAAAAAGCGGCTGTATCGAAACGATCGCTTCGGCTACCGGCATCGTCAGGATT

GCCAAAGAAAAAATAGAATCTGACCATCGAGATACAAGCTTGCGTGAATGTCTGGACAT

AACGGCGCGCGACATCTTTGAAGCCGCCAGAAAAAACGATCCTGTTGCCGGCGAAGTC

GTCGATTATGTGGCGGGTCATTTAGGAATGGTCCTCGCTAACTTGGCGAGCTCGCTTAAT

CCTTCAAAGATCGTAATCGGCGGAGGCGTGTCAAAAGCGGGAGAAATCCTGCGCTCCA

AAGTTGAACAATCTTTCAAGCGCTTTGTATTCCCGCGGGCCGGCGAGGCGGCTGAGATC

GTAATCGCTTCACTTGGAAACGACGCAGGCGTGATCGGCGGTGCATGGATCGCAAAAAA

CCAATGGCTGAAAAGCCAGGCGCAGCCTGTTTTATAA

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

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