一种近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针制备领域，涉及一种近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

过氧化氢(H

近年来，研究者们成功开发了一系列检测H

由于荧光强度增强或者降低变化的荧光探针的生物学应用很容易受到激发/发射效率、探针的生物分布及其局部微环境变化等的干扰影响，限制了荧光探针在生物体内H

因此，找到一种具有高效专一的选择性，具有较强的抗干扰能力，实现对过氧化氢的裸眼识别，具有良好生物应用价值的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针尤为重要。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提出一种近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用。本发明制备的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针具有高效专一选择性，较强的抗干扰能力，可裸眼识别，并具有较好的生物相容性。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针，其结构式为：

。

所述的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针的制备方法，其合成路线为：

。

（1）将商品化的6-羟基-2,3-二氢-1H-呫吨-4-甲醛和4-溴甲基苯硼酸频哪酯溶解于DMF中，搅拌条件下加入碳酸钾，在153℃回流反应完成后，将反应液倒入水中，萃取，收集有机相并干燥浓缩，柱层析色谱分离纯化得到黄色固体中间体1，结构式为

（2）将步骤（1）所得的黄色固体和1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴鎓溶解于乙酸酐，80℃条件下反应完全后，减压除去乙酸酐，溶解，洗涤，收集有机相干燥浓缩，粗产品柱层析分离纯化得到蓝色固体即探针NIR1，结构式为

所述步骤（1）中6-羟基-2,3-二氢-1H-呫吨-4-甲醛、4-溴甲基苯硼酸频哪酯和碳酸钾的摩尔比为1:1-6:1.5-5。

所述步骤（1）中回流反应时间6-24小时。

所述步骤（1）中萃取使用二氯甲烷萃取，干燥采用无水MgSO

所述步骤（1）中分离纯化使用柱层析色谱分离采用体积比为2-10:1的石油醚和乙酸乙酯，中间体1产率为40%-70%。

所述步骤（2）中中间体1和1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴鎓的摩尔比为1:1-4。

所述步骤（2）中反应时间为4-16小时。

所述步骤（2）中溶解采用二氯甲烷，洗涤采用饱和食盐水洗涤，分离纯化采用体积比为15-50:1的二氯甲烷：甲醇溶液，探针NIR1产率为30%-60%。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明所述近红外比率型荧光探针制备方法简单，产率高。分析测试结果表明该探针NIR1对过氧化氢具有高效专一的选择性，具有较强的抗干扰能力，其最低检出限为15.9 nM，探针NIR1与过氧化氢响应后，荧光发射光谱中，在715 nm处荧光强度明显增强，675 nm处荧光强度显著降低，可以实现对过氧化氢的近红外比率型检测，该特性可以克服环境中和生物体及组织中背景荧光的干扰，具有较强的组织穿透性，具有较好的实际应用价值。

2、传统的用于过氧化氢检测的荧光探针是简单的荧光增强或者淬灭型，其作用机理是基于探针的荧光增强或者淬灭，这类探针易受检测环境中如酸碱度、探针浓度、温度、溶液极性等的影响，还具有难以定量的缺点，而本发明所述比率型检测过氧化氢的方法识别机理为荧光比率型机理，该机理通过使用在两个不同波长（675nm和715 nm）处测定的荧光强度比值（F

3、本发明的探针对过氧化氢的识别可以达到裸眼识别的效果，识别过氧化氢后，探针溶液由原来的蓝色变为浅绿色，溶液颜色变化明显，易于分辨，实现了可视化检测，达到了裸眼识别的效果。

4、本发明的荧光探针具有较好的生物相容性，能够特异性的定位于亚细胞器线粒体中（Pearson系数为0.9792，重叠系数为0.9940），具有对线粒体中过氧化氢成像的能力。可被用于一种快速响应的显色分析工具，用于检测真实样品和生物体系中的过氧化氢，具有高特异性和灵敏度，在生物成像领域应用前景广泛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的荧光探针NIR1核磁共振氢谱图（溶剂为CD

图2为本发明的荧光探针NIR1核磁共振碳谱图（溶剂为CD

图3为本发明的荧光探针NIR1高分辨质谱图（正离子模式，溶剂为CH

图4为本发明的荧光探针NIR1识别过氧化氢的荧光发射光谱选择性图，激发波长645 nm。

图5为本发明的荧光探针NIR1识别过氧化氢紫外吸收光谱选择性图，插图：单独探针，探针识别过氧化氢和探针识别其他分析物的溶液颜色变化图。

图6为本发明的荧光探针NIR1识别过氧化氢的荧光抗干扰性柱状图，激发波长645nm，发射波长675 nm和715 nm。

图7为本发明的荧光探针NIR1识别不同浓度过氧化氢的荧光发射光谱图，激发波长645 nm，发射波长675 nm和715 nm。

图8为本发明的荧光探针NIR1识别过氧化氢的最低检出限图，激发波长645 nm，发射波长675 nm和715 nm。

图9为本发明的荧光探针NIR1识别过氧化氢的pH适用范围图，激发波长645 nm，发射波长675 nm和715 nm。

图10为本发明的荧光探针NIR1在生物活细胞中识别过氧化氢后与商业化绿色线粒体染料共定位成像图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在本实施例的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）向100 mL圆底烧瓶中加入6-羟基-2,3-二氢-1H-呫吨-4-甲醛(228.3 mg，1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪酯(445.5 mg，1.5 mmol)倒入5 mL的DMF溶解固体，搅拌下将碳酸钾(207 mg，1.5 mmol)加入混合液，在153℃下回流6小时。反应完全后将反应液倒入50mL水中，用二氯甲烷萃取三遍，有机相用无水MgSO

中间体1的核磁共振氢谱图可知

中间体1的核磁共振碳谱图可知

（2）向25 mL的圆底烧瓶中加入1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴鎓(283.0 mg, 1 mmol)与中间体1 (444.3 mg, 1 mmol)溶于10 mL的乙酸酐中，80℃反应5小时，反应完全后，用旋转蒸发仪减压除去乙酸酐得到粗产品，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤三次后，粗产品柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇 = 50：1，产物为蓝色固体(250 mg，0.35 mmol)，产率为35%。

探针NIR1的核磁共振氢谱图如图1所示，由图1可知

探针NIR1的核磁共振碳谱图如图2所示，由图2可知

探针NIR1的高分辨质谱图如图3所示，由图3可知HR-ESI-MS m/z: calcd forC

实施例2

在本实施例的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）向100 mL圆底烧瓶中加入6-羟基-2,3-二氢-1H-呫吨-4-甲醛(228.3 mg，1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪酯(891 mg，3 mmol)倒入5 mL的DMF溶解固体，搅拌下将碳酸钾(414 mg，3 mmol)加入混合液，在153℃下回流12小时。反应完全后将反应液倒入50 mL水中，用二氯甲烷萃取三遍，有机相用无水MgSO

中间体1的核磁共振氢谱图可知

中间体1的核磁共振碳谱图可知

（2）向25 mL的圆底烧瓶中加入1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴鎓(283.0 mg, 1 mmol)与中间体1 (444.3 mg, 1 mmol)溶于10 mL的乙酸酐中，80℃反应5小时，反应完全后，用旋转蒸发仪减压除去乙酸酐得到粗产品，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤三次后，粗产品柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇 = 35：1，产物为蓝色固体(321 mg，0.45 mmol)，产率为45%。

探针NIR1的核磁共振氢谱图如图1所示，由图1可知

探针NIR1的核磁共振碳谱图如图2所示，由图2可知

探针NIR1的高分辨质谱图如图3所示，由图3可知HR-ESI-MS m/z: calcd forC

实施例3

在本实施例的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）向100 mL圆底烧瓶中加入6-羟基-2,3-二氢-1H-呫吨-4-甲醛(228.3 mg，1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪酯(1336.5 mg，4.5 mmol)倒入5 mL的DMF溶解固体，搅拌下将碳酸钾(621 mg，4.5 mmol)加入混合液，在153℃下回流20小时。反应完全后将反应液倒入50 mL水中，用二氯甲烷萃取三遍，有机相用无水MgSO

中间体1的核磁共振氢谱图可知

中间体1的核磁共振碳谱图可知

（2）向25 mL的圆底烧瓶中加入1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴鎓(849 mg, 3 mmol)与中间体1 (444.3 mg, 1 mmol)溶于10 mL的乙酸酐中，80℃反应12小时，反应完全后，用旋转蒸发仪减压除去乙酸酐得到粗产品，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤三次后，粗产品柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇 = 25：1，产物为蓝色固体(357.1 mg，0.5 mmol)，产率为50%。

探针NIR1的核磁共振氢谱图如图1所示，由图1可知

探针NIR1的核磁共振碳谱图如图2所示，由图2可知

探针NIR1的高分辨质谱图如图3所示，由图3可知HR-ESI-MS m/z: calcd forC

实施例4

在本实施例的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）向100 mL圆底烧瓶中加入6-羟基-2,3-二氢-1H-呫吨-4-甲醛(228.3 mg，1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪酯(1782 mg，6 mmol)倒入5 mL的DMF溶解固体，搅拌下将碳酸钾(690 mg，5 mmol)加入混合液，在153℃下回流24小时。反应完全后将反应液倒入50 mL水中，用二氯甲烷萃取三遍，有机相用无水MgSO

中间体1的核磁共振氢谱图可知

中间体1的核磁共振碳谱图可知

（2）向25 mL的圆底烧瓶中加入1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴鎓(1132 mg, 4 mmol)与中间体1 (444.3 mg, 1 mmol)溶于10 mL的乙酸酐中，80℃反应16小时，反应完全后，用旋转蒸发仪减压除去乙酸酐得到粗产品，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤三次后，粗产品柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇 = 15：1，产物为蓝色固体(428.6 mg，0.6 mmol)，产率为60%。

探针NIR1的核磁共振氢谱图如图1所示，由图1可知

探针NIR1的核磁共振碳谱图如图2所示，由图2可知

探针NIR1的高分辨质谱图如图3所示，由图3可知HR-ESI-MS m/z: calcd forC

实施例5

在本实施例的近红外比率型识别过氧化氢的荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）向100 mL圆底烧瓶中加入6-羟基-2,3-二氢-1H-呫吨-4-甲醛(228.3 mg，1mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪酯(297 mg，1 mmol)倒入5 mL的DMF溶解固体，搅拌下将碳酸钾(690 mg，5 mmol)加入混合液，在153℃下回流24小时。反应完全后将反应液倒入50 mL水中，用二氯甲烷萃取三遍，有机相用无水MgSO

中间体1的核磁共振氢谱图可知

中间体1的核磁共振碳谱图可知

（2）向25 mL的圆底烧瓶中加入1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴鎓(1132 mg, 4 mmol)与中间体1 (444.3 mg, 1 mmol)溶于10 mL的乙酸酐中，80℃反应4小时，反应完全后，用旋转蒸发仪减压除去乙酸酐得到粗产品，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤三次后，粗产品柱层析分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇 = 20：1，产物为蓝色固体(214.3 mg，0.3 mmol)，产率为30%。

探针NIR1的核磁共振氢谱图如图1所示，由图1可知

探针NIR1的核磁共振碳谱图如图2所示，由图2可知

探针NIR1的高分辨质谱图如图3所示，由图3可知HR-ESI-MS m/z: calcd forC

对上述实施例探针NIR1进行实验测试分析：

（1）荧光选择性实验

将探针NIR1溶解于二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1 mM的探针母液备用，配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液。在DMSO-PBS（3/7, v/v）缓冲体系中用荧光光谱仪考察了探针NIR1对过氧化氢的选择性。结果如图4，在645 nm处激发条件下，单独的探针NIR1(10 µM)在DMSO-PBS（3/7, v/v）缓冲体系中675 nm处具有较强的荧光发射强度，当加入过氧化氢(100 µM)后，溶液体系在715 nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入其它物质（常见阴离子、活性小分子和氨基酸，浓度均为100µM）时，溶液体系的荧光发射谱图与单独探针体系的荧光发射谱图相比没有明显变化。探针NIR1具有专一的荧光选择性。

（2）紫外选择性实验

将探针NIR1溶解于二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1 mM的探针母液备用，配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液。在DMSO-PBS（3/7, v/v）缓冲体系中用紫外-可见分光光度计考察了探针NIR1对过氧化氢的选择性。结果如图5所示，由图5可得，单独的探针NIR1(10 µM)在缓冲体系中在660 nm处具有较大的紫外吸收强度，当加入过氧化氢(100 µM)后，溶液体系在693 nm处的紫外吸收强度明显升高，溶液颜色由原来的蓝色变为浅绿色；但是加入其它物质（常见阴离子、活性小分子和氨基酸，浓度均为100µM）时，溶液体系的紫外吸收（693 nm）强度与单独探针相比没有明显的变化，溶液颜色变化不明显。结果表明，该探针对过氧化氢具有专一的紫外选择性，并能够实现裸眼识别。

（3）抗干扰性实验

通过荧光发射光谱测试其他活性小分子存在的条件下，探针NIR1识别过氧化氢的效果，在645 nm激发下，向单独探针溶液中分别加入其它物质（常见阴离子、活性小分子和氨基酸，浓度均为100 µM）再都加入100 µM的过氧化氢，分别检测溶液675nm和715 nm处荧光发射强度。结果如图6所示，由图6可知，加入其他物质作为干扰物种的溶液荧光发射比率（F

（4）最低检出限实验

良好的检出限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。将探针NIR1溶解于DMSO配制成浓度为1 mM的探针母液备用，配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液。固定探针NIR1的浓度为10 µM，测定其对不同浓度的过氧化氢的响应强度，随着过氧化氢浓度的增加，体系荧光发射强度在675 nm处的荧光发射强度明显降低，在715 nm处的荧光发射强度明显增强，如图7，研究发现溶液荧光发射比率（F

（5）酸碱度（pH）对探针识别能力的影响

为了测试探针可以在不同的酸碱度（pH）条件下识别过氧化氢，考察了其在不同酸碱度（pH）对其识别过氧化氢的影响。分别配制pH为3.8，4.8，5.8，6.8，7.4，8.8，9.7的PBS缓冲溶液（浓度均为10 mM），并将探针NIR1溶解于DMSO配制成浓度为1 mM的探针母液备用。在DMSO-PBS（3/7, v/v）缓冲体系中，改变缓冲体系的pH值（3-10），单独探针(10 μL)的荧光发射比率值（F

应用例1

探针NIR1在亚细胞器线粒体中识别过氧化氢的定位成像实验

将本发明的探针NIR1应用于人宫颈癌细胞（HeLa）中，加入商业化绿色线粒体染料进行定位对比成像，如图10所示，具体步骤如下：

1）一定量的活细胞，用含有10 μM商业绿色线粒体染料的培养基孵育30分钟；用PBS洗净，再用含有10 μM探针NIR1的培养基孵育30 分钟；

2）上述细胞用PBS洗净，再用含有100 μM H

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。