一种基于硼亲和作用的高选择性木犀草素检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种基于硼亲和作用的高选择性木犀草素检测方法。

背景技术

木犀草素是一种天然黄酮类化合物，其化学名为3',4',5,7-四羟黄酮，最初是从木犀草属的草本植物木犀草中分离出而得名。木犀草素在花生壳、忍冬和马鞭草等药材中广泛存在。近年来，木犀草素因具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等多重药理活性而在医药和临床领域得到了广泛的关注。然而，在中药材中木犀草素含量低且中药提取液基质复杂，因此，开发一种简便、灵敏的木犀草素检测方法对药物质量控制和临床医学研究均具有重要意义。

目前，木犀草素的检测方法有很多且存在诸多不足：

高效液相色谱法分析成本高，液相色谱仪价格及日常维护费用贵，分析时间一般比气相色谱法长，甲醇和乙腈等流动相成本高。如安捷伦液相色谱仪(通用型1260InfinityII)市场价约30万元。

用紫外可见分光光度计对木犀草素直接进行定性分析时，必须用木犀草素标准品与相应的色谱峰进行对比，或与其他方法(如质谱、光谱)联用，才能获得直接肯定的结果。在定量分析时，常需要用木犀草素纯样品对检测后输出的信号进行校正。

毛细管电泳法在测定成分时存在几个弊端，首先，由于进样量少，因而制备能力差；其次，由于毛细管直径小，使光路太短，灵敏度较低；此外，电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性。

电化学分析法精密度较差，当要求精密度较高时不宜采用此法，电极点位值的重现性受实验条件的影响较大。

上述方法在木犀草素检测时面临仪器昂贵、操作复杂、耗时等固有缺点，在一定程度上阻碍了上述方法在木犀草素检测中的进一步应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种基于硼亲和作用的高选择性木犀草素检测方法，用于解决现有技术在检测木犀草素时存在仪器昂贵、操作复杂、耗时等的技术问题，从而达到可对木犀草素进行快速检测并且具有高灵敏度的目的。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于硼亲和作用的高选择性木犀草素检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：量子点的制备及纯化：将3-羧基苯基硼酸和3-氨基苯基硼酸溶解在纯净水中，进行加热反应后，冷却至室温得到初步的量子点，将所述初步的量子点用水透析除去杂质，并进行干燥后得到纯化后的量子点；

步骤S2：量子点的表征：利用傅里叶变换红外光谱确定所述纯化后的量子点表面是否含有丰富的硼酸基团，若是，则认为所述纯化后的量子点适合用于木犀草素的检测；

步骤S3：待测液的制备：将待测样品干燥后进行粉碎得到样品粉末，称取所述样品粉末，用乙醇溶液进行回流提取得到一提取液，将所述提取液进行离心去除杂质后，取上清液进行稀释得到木犀草素待测液；

步骤S4：木犀草素检测：对所述纯化后的量子点进行稀释得到稀释的量子点，将所述稀释的量子点与PBS缓冲溶液和木犀草素待测液进行混合后，得到一反应溶液，测量所述反应溶液在415nm的激发波长下经历一段孵育时间后的荧光强度，根据所述荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到所述木犀草素待测液中木犀草素的含量。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S1中，所述3-羧基苯基硼酸的用量为0.5-1.0g，所述3-氨基苯基硼酸的用量为0.3-0.6g，所述纯净水的用量为20-40ml。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S1中，所述加热反应的具体条件包括：加热温度为120-200℃，加热时间为6-8h。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S1中，所述透析的具体条件包括：截留分子量为1000道尔顿，透析时间为48-72h。

作为本发明优选的实施方式，所述步骤S3具体为：用75％乙醇溶液回流提取30min得到一提取液，将所述提取液以4000r/min离心30min以除去杂质。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S4中，所述稀释的具体过程为：称取所述纯化后的量子点用水稀释20倍得到所述稀释的量子点。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S4中，所述反应溶液的具体制备过程为：将所述稀释的量子点、所述PBS缓冲溶液以及所述木犀草素标准溶液以1：1：1的体积比进行混合，得到所述反应溶液。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S4中，所述木犀草素线性回归方程的建立过程，包括：依照所述步骤S4对梯度浓度的木犀草素标准溶液进行检测，建立木犀草素浓度以10为底的对数值与相应荧光强度间的木犀草素线性回归方程。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S4中，所述PBS缓冲溶液pH值的确定过程，包括：将稀释的量子点、木犀草素标准溶液以及梯度pH值的PBS缓冲溶液进行混合，得到梯度pH值的反应溶液，测量所述梯度pH值的反应溶液的荧光强度，得到其中最低荧光强度所对应PBS缓冲溶液的pH值，即为用于木犀草素检测的PBS缓冲溶液的pH值。

作为本发明优选的实施方式，在所述步骤S4中，所述孵育时间的确定过程，包括：将稀释的量子点、木犀草素标准溶液以及PBS缓冲溶液进行混合，得到一反应溶液，测量所述反应溶液在415nm的激发波长下经历不同孵育时间后的荧光强度，得到其中荧光强度不再发生变化时的孵育时间，即为在415nm的激发波长下，用于木犀草素检测的孵育时间。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用荧光检测法检测木犀草素，高检测灵敏度荧光分光光度计F93市场价约1.2万元，因此采用荧光检测法相较于现有的高效液相色谱法分析成本更低，另外本发明采用荧光检测法检测木犀草素时，无需有机流动相或者载气，有效避免了有机试剂和氮气等的使用；

(2)本发明基于木犀草素与量子点结合后分子能量变化从而引起光学信号变化的原理实现木犀草素的检测，检测结果可直观反映，因此无需额外联用其他检测或分离设备，而现有的紫外可见分光光度计对木犀草素直接进行定性分析时，必须用木犀草素标准品与相应的色谱峰进行对比，或与其他方法(如质谱、光谱)联用，才能获得直接肯定的结果；

(3)本发明制备得到的量子点表面含有丰富的硼酸基团，可充分利用苯硼酸功能化的量子点可特异性地与木犀草素含有的顺式二醇结构结合从而导致荧光淬灭的特性，实现对木犀草素的高灵敏度检测；

(4)本发明制备得到的量子点对木犀草素具有高选择性，从而能进一步地保证木犀草素检测的高灵敏度；

(5)本发明从量子点的制备到待测液的制备，以及最后的木犀草素检测，过程均较为简单，从而实现了木犀草素的快速检测。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1-是本发明实施例的量子点2的红外光谱图；

图2-是本发明实施例的苯硼酸与含顺式二醇化合物的相互作用示意图；

图3-是本发明实施例的量子点检测木犀草素线性回归方程图；

图4-是本发明实施例的梯度pH值的PBS缓冲溶液下的荧光强度图；

图5-是本发明实施例的反应溶液孵育时间考察图；

图6-是本发明实施例的量子点2的选择性考察图。

具体实施方式

本发明所提供的基于硼亲和作用的高选择性木犀草素检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：量子点的制备及纯化：将0.5-1.0g的3-羧基苯基硼酸和0.3-0.6g的3-氨基苯基硼酸溶解在20-40ml纯净水中置于100ml内衬特氟隆的不锈钢高压釜中，在120-200℃下加热反应6-8h。冷却至室温后，将制备的产品用水透析(Mw 1000)48-72h以除去杂质，得到初步的量子点。将初步的量子点在40-60℃条件下真空干燥过夜，得到浅黄色的粉末即为纯化后的量子点。

步骤S2：量子点的表征：利用傅里叶变换红外光谱确定经步骤S1得到的纯化后的量子点表面是否含有丰富的硼酸基团，若是，则认为纯化后的量子点适合用于木犀草素的检测。

量子点1：将0.5g的3-羧基苯基硼酸和0.3g的3-氨基苯基硼酸溶解在20ml纯净水中置于100ml内衬特氟隆的不锈钢高压釜中，在120℃下加热反应6h。冷却至室温后，将制备的产品用水透析(Mw 1000)48h以除去杂质，得到初步的量子点。将初步的量子点在40℃条件下真空干燥过夜，得到量子点1。

量子点2：将0.7g的3-羧基苯基硼酸和0.5g的3-氨基苯基硼酸溶解在30ml纯净水中置于100ml内衬特氟隆的不锈钢高压釜中，在160℃下加热反应7h。冷却至室温后，将制备的产品用水透析(Mw 1000)60h以除去杂质，得到初步的量子点。将初步的量子点在50℃条件下真空干燥过夜，得到量子点2。

量子点3：将1.0g的3-羧基苯基硼酸和0.6g的3-氨基苯基硼酸溶解在40ml纯净水中置于100ml内衬特氟隆的不锈钢高压釜中，在200℃下加热反应8h。冷却至室温后，将制备的产品用水透析(Mw 1000)72h以除去杂质，得到初步的量子点。将初步的量子点在60℃条件下真空干燥过夜，得到量子点3。

用傅里叶变换红外光谱分别研究量子点1、量子点2以及量子点3的表面基团，均证明量子点1、量子点2以及量子点3表面含有丰富的硼酸基团。

图1为量子点2的红外光谱图，图中约3418cm

量子点选择性考察：

用麦芽糖、蔗糖、K

步骤S3：待测液的制备：取适量待测样品在80℃条件下干燥然后粉碎得到样品粉末，精确称量样品粉末250mg，用20ml 75％乙醇溶液回流提取30分钟，得到一提取液。将提取液以4000r/min离心30min以除去杂质，然后取50uL上清液转移至50mL容量瓶中，用纯净水稀释至所需体积，摇匀后得到木犀草素待测液，并将其在4℃下避光保存。

步骤S4：木犀草素检测：精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及木犀草素待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到一反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到木犀草素待测液中木犀草素的含量。

检测原理如下：

当环境中pH为碱性时，硼原子和环境中的-OH发生络合反应，硼原子由三元杂化结构(sp2)转变四面体硼酸根阴离子(sp3)，再与顺式二羟基发生共价反应形成五元或六元环，从而使顺式二羟基化合物被吸附分离。

当环境中pH低于硼酸基团的pKa时，硼酸基团与顺式二羟基解离，释放出目标物，硼原子的杂化状态恢复为sp2杂化，如图2所示。红外表征证明了以3-羧基苯基硼酸和3-氨基苯基硼酸为原料合成的量子点表面具有硼酸基团，因此，对含有顺式二醇结构的木犀草素可在碱性条件下进行特异性结合。

进一步地，在步骤S4中，木犀草素线性回归方程的建立过程：

木犀草素的检测在室温(约25℃)下进行。将5mg纯化后的量子点定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及一定浓度的木犀草素标准溶液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到一反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的激发波长下经历40min的孵育时间后，测量反应溶液的荧光强度。

依次用梯度浓度的木犀草素标准溶液重复该检测流程，建立木犀草素浓度以10为底的对数值与相应荧光强度间的线性回归方程，如图3所示。所得线性关系为：Y＝-0.4479X+1.3283，R

进一步地，在步骤S4中，PBS缓冲溶液pH值的确定过程：

PBS缓冲溶液pH值的确定对该量子点检测木犀草素具有重要意义。在本申请中将稀释的量子点、0.5mM的木犀草素标准溶液和固定pH值的PBS缓冲溶液(梯度pH值依次为5.5、6.5、7.5、8.5和9.5)各取1ml，混合在4ml比色皿中，得到一反应溶液。用荧光分光光度计在415nm的激发波长下经历40min的孵育时间后测量荧光强度，测得荧光强度越低，说明在该pH值条件下木犀草素与量子点结合最充分。测定结果如图4所示，当pH为8.5时，量子点表面苯硼酸由sp2转化为sp3构型，与木犀草素含有的顺式二醇最大限度结合形成五元环，导致量子点体系中能量最低，荧光淬灭程度最大。

进一步地，在步骤S4中，孵育时间的确定过程：

将稀释的量子点，0.5mM的木犀草素标准溶液，pH为8.5的PBS缓冲溶液各取1ml，混合在4ml比色皿中，得到一反应溶液。用荧光分光光度计在415nm的激发波长下经历不同的孵育时间后，测量反应溶液的荧光强度，测得荧光强度越低，说明在该时间木犀草素与量子点结合最充分。测定结果如图5所示，当孵育时间为40min后，随后荧光强度不再发生变化，说明40min时量子点与木犀草素充分结合。

以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的范围并不限制于此。

实施例1(金银花)

将0.7g的3-羧基苯基硼酸和0.5g的3-氨基苯基硼酸溶解在30ml纯净水中置于100ml内衬特氟隆的不锈钢高压釜中，在160℃下加热反应7h。冷却至室温后，将制备的产品用水透析(Mw 1000)60h以除去杂质，得到初步的量子点。将初步的量子点在50℃条件下真空干燥过夜，得到纯化后的量子点后，利用傅里叶变换红外光谱确定得到的纯化后的量子点表面含有丰富的硼酸基团。

取适量金银花在80℃条件下干燥然后粉碎得到金银花样品粉末，精确称量金银花样品粉末250mg，用20ml 75％乙醇溶液回流提取30分钟，得到金银花提取液。将金银花提取液以4000r/min离心30min以除去杂质，然后取50uL上清液转移至50mL容量瓶中，用纯净水稀释至所需体积，摇匀后得到金银花待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及金银花待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到金银花反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量金银花反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到金银花待测液中木犀草素的含量。

实施例2(葡萄)

依照实施例1得到葡萄待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及葡萄待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到葡萄反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量葡萄反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到葡萄待测液中木犀草素的含量。

实施例3(黄芩)

依照实施例1得到黄芩待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及黄芩待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到黄芩反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量黄芩反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到黄芩待测液中木犀草素的含量。

实施例4(杭白菊)

依照实施例1得到杭白菊待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及杭白菊待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到杭白菊反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量杭白菊反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到杭白菊待测液中木犀草素的含量。

实施例5(花生壳)

依照实施例1得到花生壳待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及花生壳待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到花生壳反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量花生壳反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到花生壳待测液中木犀草素的含量。

实施例6(女贞子)

依照实施例1得到女贞子待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及女贞子待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到女贞子反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量女贞子反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到女贞子待测液中木犀草素的含量。

实施例7(芹菜)

依照实施例1得到芹菜待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及芹菜待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到芹菜反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量芹菜反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到芹菜待测液中木犀草素的含量。

实施例8(辣椒)

依照实施例1得到辣椒待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及辣椒待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到辣椒反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量辣椒反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到辣椒待测液中木犀草素的含量。

实施例9(荷叶)

依照实施例1得到荷叶待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及荷叶待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到荷叶反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量荷叶反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到荷叶待测液中木犀草素的含量。

实施例10(独一味)

依照实施例1得到独一味待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及独一味待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到独一味反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量独一味反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到独一味待测液中木犀草素的含量。

实施例11(胡萝卜)

依照实施例1得到胡萝卜待测液。

精确称量纯化后的量子点5mg加水定容在100ml容量瓶中得到稀释的量子点，将该稀释的量子点与pH为8.5的PBS缓冲溶液以及胡萝卜待测液各取1ml混合在4ml比色皿中，得到胡萝卜反应溶液，用荧光分光光度计在415nm的检测波长下经历40min的孵育时间后，测量胡萝卜反应溶液的荧光强度，并利用木犀草素线性回归方程进行换算后，得到胡萝卜待测液中木犀草素的含量。

采用标准添加法在实施例1-11的待测液中加入一定量木犀草素标准溶液进行回收实验，加标的量设为低、中、高三个水平，分别为实施例1-11的待测液中木犀草素含量的0.5、1、1.5倍。实施例1-11的待测液中木犀草素含量及加标回收率分析结果如表1所示：

表1实施1-11的待测液中木犀草素含量及加标回收率分析结果表

由表1记录的数据可看出，该方法对各类实际样品的回收率稳定在85.23％-111.63％之间，说明本发明所提供的木犀草素检测方法具有广阔的应用前景。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。