一种土壤根际热点区有机酸原位识别与定量测定方法

技术领域

本发明涉及土壤微生物学、土壤化学、生态学、分子生物学、环境科学、自然地理学、全球气候变化等多学科领域，具体涉及一种土壤根际热点区有机酸原位识别与定量测定方法。

背景技术

传统的根际土壤有机酸分析方法均采用野外根系植物或根际土壤样品采集-仪器分析测试的方法，野外土壤采样通常采用分层采样或根际混合采样的方式，属于破坏性采样，然后在实验室进行样品磨碎、过筛后制成的悬浮液中测试。传统的方法无法对根际微生物活动进行原位识别和反映微生物活动的空间异质性特征，仅能提供一维的植物根系或微生物分泌的有机酸含量，不能精确的反映根际有机酸的空间分布情况。

在植物根系分泌物中有机酸如草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸、丙酸等的常见测定方法，包括气相色谱法(GC)，其要求被测物有较高的挥发性，而许多有机酸的沸点较高，不易气化，在分离前对其进行前处理衍生以增加其挥发性的过程在实际应用中比较繁琐，测试结果准确性难以保证；离子色谱法(IC)，虽然对于样品预处理的要求比较简单，但高浓度的无机阴离子可能干扰有机酸根离子的测定，对样品及仪器的要求较高，分析周期较长；毛细管电泳法(CE)，具有柱效高、分离时间短、消耗溶剂少等特点，也能测定有机酸，但由于毛细管柱内径小，导致检测光程变短,检测灵敏度较低；高效液相色谱法(HPLC)，采用离子抑制机理，以不同试剂缓冲液为流动相，在特定pH的条件下使有机酸呈分子状态，不同种类的有机酸由于分子量和极性的不同在色谱柱上依次分离，该方法简单、灵敏度高、柱效高和分析速率快，但是需要是根据不同组分之间理化性质的差异，选择适合实验要求的方法进行分离纯化。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种土壤根际热点区有机酸原位识别与定量测定方法，该方法基于土壤根际热点区有机酸原位识别系统对根际热点区有机酸进行原位识别，再经分区采样，然后通过高效液相色谱检测方法，实现了土壤浸提液覆盖7种有机酸的同时测定，在18分钟内能够同时完成定性和定量分析，成功实现土壤根际热点区有机酸的二维分布特征定性表达与有机酸含量定量化测定。

具体地，通过以下技术方案实现了本发明：

本发明提供了一种土壤根际热点区有机酸原位识别与定量测定方法，所述方法包括：

步骤一：基于土壤根际热点区有机酸原位识别系统对土壤根际热点区有机酸进行原位识别：

所述土壤根际热点区有机酸原位识别系统包括土壤根系培养装置、底物-纤维膜介质(2)、荧光反应暗室-谱成像装置和荧光影像处理系统(8)；所述土壤根系培养装置包括根箱(1)和玻璃挡板；所述荧光反应暗室-谱成像装置包括荧光反应暗室、控制器(3)、高分辨率相机(4)、紫外光源(5)、移动架(6)和调节阀(7)；

通过根箱进行土壤根系培养，植物根系培养形成后，通过抽插板取出底物-纤维膜介质移入荧光反应暗室，通过移动架水平移动和调节阀上下移动调整到适合位置放入底物-纤维膜介质，依靠控制器控制紫外光源激发和发射波长及照射时长，对底物-纤维膜介质进行紫外光照射，然后通过控制器控制高分辨率相机进行荧光成像并输出成像相片到计算机，通过荧光影像处理系统进行根际热点区有机酸的识别；具体步骤包括：

1)针对不同种类的植物挖掘不同尺寸的土壤剖面，放置于土壤根系培养装置的根箱内，经过1-3个月原位培养后，挖开土壤剖面，打开土壤根系培养装置，将底物-纤维膜介质覆盖在根系分布的土壤剖面上，使底物-纤维膜介质与根际土壤紧密贴合，原位培养1-4个小时；

2)依次将荧光标准物质-纤维膜介质和步骤1)获得的经原位培养的底物-纤维膜介质放入荧光反应暗室-谱成像装置中，紫外光照射1-3分钟；

3)对步骤2)获得的图像利用Image-J软件进行灰度值定量化处理，通过将荧光标准物质-纤维膜介质获得的图像灰度值和经原位培养的底物-纤维膜介质获得的图像灰度值进行对比，定性表达二维根际热点区土壤有机酸的分布特征；

步骤二：根际热点区和非热点区土壤样品采集与处理：

1)分区采样：移动根箱玻璃挡板，依据步骤一3)得到的二维根际热点区土壤有机酸的分布特征，对根际热点区和非热点区不同区域的土壤进行样品采集；

2)样品处理：取适量步骤二1)得到的土壤样品置于离心管中，加入土壤浸提液，即浓度为50mM的Na

步骤三：采用高效液相色谱检测有机酸含量：

1)配制草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的标准工作液；

2)将步骤三1)配制的标准工作液采用高效液相色谱仪进行分析得到草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的液相色谱图，根据色谱峰面积对标系列标准液中各有机酸的浓度，分别绘制各有机酸的标准曲线；

高效液相色谱分析条件

色谱柱：Acclaim

流动相：A相色谱纯级甲醇-B相50mM的Na

柱温：30℃；

流速：0.6mL/min；

进样量：5μL；

检测器：紫外检测器，检测波长210nm；

3)将上述步骤二(2)制备的土壤浸提液样品用上述高效液相色谱仪进行分析得到液相色谱图，以液相色谱图中各有机酸对应的色谱峰面积通过标准曲线得到土壤浸提液中各有机酸的含量，然后利用公式计算出土壤中各有机酸的含量，计算公式如下：

ω＝ρ×V×D/m

式中：

ω——土壤中有机酸的质量浓度，单位为毫克每公斤(mg/kg)；

ρ——由标准曲线得到的土壤浸提液样品中有机酸的含量，单位为毫克每升(mg/L)；

V——提取剂总体积，单位为毫升(mL)；

D——稀释倍数；

m——土壤样品称样量，单位为克(g)。

上述步骤一中：

所述土壤根系培养装置的尺寸为50cm×50cm×50cm或100cm×100cm×100cm，装置前方是可移动的玻璃挡板，为了根系富集，下方是45°倾斜可移动的用于放置底物-纤维膜介质的挡板。

所述荧光标准物质-纤维膜介质是由以下方法制得的：

采用甲基7-羟基香豆素作为荧光标准物质，膜材质为聚酯纤维膜，将纤维膜浸泡于不同浓度梯度的荧光标准物质中1-3分钟，制得高浓度的荧光标准物质-纤维膜介质。

所述底物-纤维膜介质是由以下方法制得的：

配制浓度为10μM的4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖苷或4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖胺底物溶液，将纤维膜浸泡于底物溶液中1-3分钟，制得底物-纤维膜介质。

上述步骤二中：

在一个优选的实施方案中，所述步骤2)样品处理包括：称取5.00g步骤二1)得到的土壤样品置于50mL离心管中，按照固液比1:2加入10mL土壤浸提液，即浓度为50mM的Na

上述步骤三中：

所述步骤1)配制草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的标准工作液包括：准确称取有机酸标准品草酸9.000mg，甲酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸各7.500mg，乙酸、琥珀酸各15.000mg于100.0mL容量瓶中，再加入50.0mM的Na

本发明中，所述的术语“土壤根际热点区”是指土壤中具有较高微生物活性的区域。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明的土壤根际热点区有机酸原位识别系统使用方便，能充分的可视化表达二维根际热点区土壤有机酸的分布特征。

(2)本发明采用高效液相色谱检测方法，利用硫酸钠水溶液-甲醇混合流动相经Acclaim C

(3)本发明利用土壤根际热点区有机酸的原位识别系统，结合高效液相色谱检测方法，可以成功实现土壤根际热点区有机酸的二维分布特征定性表达与有机酸含量定量化测定，为系统理解高异质性土壤和根际环境下微生物及其影响因素提供依据。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的土壤根际热点区有机酸原位识别系统的示意图。

图2为7种有机酸的液相色谱图。

图3为草酸的标准曲线。

图4为甲酸的标准曲线。

图5为苹果酸的标准曲线。

图6为乳酸的标准曲线。

图7为乙酸的标准曲线。

图8为柠檬酸的标准曲线。

图9为琥珀酸的标准曲线。

图10为草地根际热点区有机酸的液相色谱图。

图中：1根箱，2底物-纤维膜介质，3控制器，4高分辨率相机，5紫外光源，6移动架，7调节阀，8荧光影像处理系统。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。

实施例：一种草地根际热点区有机酸原位识别与定量测定方法，包括：

步骤一：基于土壤根际热点区有机酸原位识别系统对草地根际热点区有机酸进行原位识别：

所述土壤根际热点区有机酸原位识别系统包括土壤根系培养装置、底物-纤维膜介质(2)、荧光反应暗室-谱成像装置和荧光影像处理系统(8)；所述土壤根系培养装置包括根箱(1)和玻璃挡板；所述荧光反应暗室-谱成像装置包括荧光反应暗室、控制器(3)、高分辨率相机(4)、紫外光源(5)、移动架(6)和调节阀(7)。

通过根箱进行土壤根系培养，草地根系培养形成后，通过抽插板取出底物-纤维膜介质移入荧光反应暗室，通过移动架水平移动和调节阀上下移动调整到适合位置放入底物-纤维膜介质，依靠控制器控制紫外光源激发和发射波长及照射时长，对底物-纤维膜介质进行紫外光照射，然后通过控制器控制高分辨率相机进行荧光成像并输出成像相片到计算机，通过荧光影像处理系统进行根际热点区有机酸的识别。具体步骤包括：

1)采用甲基7-羟基香豆素作为荧光标准物质，膜材质为聚酯纤维膜，将纤维膜浸泡于不同浓度梯度的荧光标准物质中1分钟，制得浓度为10μM的荧光标准物质-纤维膜介质；

2)配制浓度为10μM的4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖苷或4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖胺底物溶液，将纤维膜浸泡于底物溶液中1分钟，制得底物-纤维膜介质；

3)挖掘草地的土壤剖面，放置于土壤根系培养装置的根箱内，经过2个月原位培养后，挖开土壤剖面，打开土壤根系培养装置，将步骤2)制得的底物-纤维膜介质覆盖在根系分布的土壤剖面上，使底物-纤维膜介质与根际土壤紧密贴合，原位培养3个小时；

4)依次将步骤1)制得的荧光标准物质-纤维膜介质和步骤3)获得的经原位培养的底物-纤维膜介质放入荧光反应暗室-谱成像装置中，紫外光照射2分钟；

5)对步骤4)获得的图像利用Image-J软件进行灰度值定量化处理，通过将荧光标准物质-纤维膜介质获得的图像灰度值和经原位培养的底物-纤维膜介质获得的图像灰度值进行对比，定性表达二维根际热点区草地土壤有机酸的分布特征。

步骤二：根际热点区草地土壤样品采集与处理：

1)分区采样：移动根箱玻璃挡板，依据步骤一5)得到的二维根际热点区草地土壤有机酸的分布特征，对根际热点区的草地土壤进行样品采集；

2)样品处理：称取5.00g步骤二1)得到的草地土壤样品置于50mL离心管中，按照固液比1:2加入10mL土壤浸提液，即浓度为50mM的Na

3)加标样处理：准确称取有机酸标准品分别加入石英砂中，按照与步骤二2)样品处理相同的条件和步骤制备加标样。

步骤三：采用高效液相色谱检测有机酸含量：

1)配制草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的标准工作液；

准确称取有机酸标准品草酸9.000mg，甲酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸各7.500mg，乙酸、琥珀酸各15.000mg于100.0mL容量瓶中，再加入50.0mM的Na

2)将步骤三1)配制的标准工作液采用高效液相色谱仪进行分析得到草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的液相色谱图，根据色谱峰面积对标系列标准液中各有机酸的浓度，分别绘制各有机酸的标准曲线。

高效液相色谱分析条件

色谱柱：Acclaim

流动相：A相色谱纯级甲醇-B相50mM的Na

柱温：30℃；

流速：0.6mL/min；

进样量：5μL；

检测器：紫外检测器，检测波长210nm。

流动相配置

准确称取7.10g硫酸钠(分析纯)，溶于少量水后移入1L容量瓶中，用超纯水稀释定容至刻度，用甲磺酸(色谱纯)调节pH值为2.65，过0.22μm滤膜后超声排气制成B相流动相。

检测结果如图2所示，其中，从左到右依次为草酸cs、甲酸js、苹果酸pgs、乳酸rs、乙酸ys、柠檬酸nms和琥珀酸hbs。

配制含有7种有机酸组分的系列混合标准溶液，在优化的试验色谱条件下依次进行高效液相色谱仪进样，每个重复测定3次，得到液相色谱图，根据色谱图中各有机酸的响应色谱峰面积对标标准液中各有机酸的浓度，以浓度(mg/L)为横坐标，响应色谱峰面积为纵坐标，分别绘制草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的标准曲线，分别为图3-9所示。

配制含有7种有机酸组分的，在优化的试验色谱条件下对低浓度的2个系列混合标准溶液依次进样，重复6次，以3倍信噪比(S/N)的均值作为方法的检出限(LoD)，即草酸0.944mg/L，甲酸2.641mg/L，苹果酸2.854mg/L，乳酸5.467mg/L，乙酸4.189mg/L，柠檬酸5.528mg/L和琥珀酸7.173mg/L；以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)建立标准曲线，在各自线性范围内，7种有机酸的详细方程、线性相关系数以及定量检测限(LoQ)等结果如表1所示。

表1：7种有机酸的线性方程、线性相关系数、线性范围以及检出限结果

精密度和准确度

对分别添加高低2个不同浓度(具体浓度见表2)的7种有机酸混合标准溶液的加标样，每个重复测定6次，计算平均加标回收率(R)和精密度(RSD)。

表2：7种有机酸含量的同时测定方法的回收率和精密度试验结果

从表2中可以看出，各有机酸组分的回收率介于95.8％～108.6％之间，相对标准偏差为1.0％～4.7％，说明本发明建立的检测方法重复性好、准确度高。

3)将上述步骤二2)制备的草地土壤浸提液样品用上述高效液相色谱仪进行分析，得到如图10所示的液相色谱图，以液相色谱图中各有机酸对应的色谱峰面积通过标准曲线计算得到土壤浸提液中各有机酸的含量，然后利用公式计算出土壤中各有机酸的含量，计算公式如下：

ω＝ρ×V×D/m

式中：

ω——土壤中有机酸的质量浓度，单位为毫克每公斤(mg/kg)；

ρ——由标准曲线计算得到的土壤浸提液样品中有机酸的含量，单位为毫克每升(mg/L)；

V——提取剂总体积，单位为毫升(mL)；

D——稀释倍数；

m——土壤样品称样量，单位为克(g)。

从图10所示的草地根际热点区有机酸的液相色谱图，计算得到草地根际热点区土壤浸提液中草酸浓度为4109.15mg/L，甲酸浓度为108.47mg/L。根据上述公式计算出草地根际热点区土壤中草酸和甲酸的含量分别为8218.30mg/kg和216.94mg/kg。

显然，上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。