一种IMP检测蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种，特别涉及一种IMP检测蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

5’-肌苷酸(以下称为IMP)又名次黄嘌呤核苷酸，是转变为其他嘌呤核苷酸的底物，在生物体内具有重要的生物学功能，在生物合成、能量代谢等方面有不可替代的作用，也是一种重要的风味物质和药物中间体。IMP及其盐类能够产生鲜味，是肉品中重要的风味物质之一，它还能够与谷氨酸钠协同作用，使鲜味成倍增加，是一种常用的调味剂。

IMP浓度目前的检测方法只有高效液相色谱和质谱，每个样品的检测价格昂贵且检测效率十分低下，这严重影响了生产过程中IMP检测的效率。在自然界中，化学物质的浓度通常可以被不同的分子装置感知，例如变构酶、转录因子和核糖开关。使用这种设备开发的人工生物传感器可以对化学信号做出反应，并将它们转换成易于检测的信号，如荧光，生长表型等。

环状重排荧光蛋白(Circularly permuted fluorescent protein，cpFP)是通过保持原有荧光蛋白的构象，在截断氨基酸肽段之后再通过短肽重新连接，重排之后的蛋白质仍然具有原始蛋白类似的结构和活性。通过cpFP方式构建的新型荧光蛋白，因为将生色团由内部暴露到外部状态，因此此类蛋白变得对构象变化特别灵敏，有很小的改变就会带来其荧光值的改变。因此cpFP模型也被用来实现对各种离子和小分子的检测。

近年来报道了一种新的蛋白酶连接系统，称之为Spy化学，Spy化学反应是指SpyCatcher上的赖氨酸与SpyTag上的天冬氨酸之间自发的形成异肽键，他们之间的反应具有快速、高效和特异性，因此Spy化学不仅在蛋白标记蛋白结合、蛋白拓扑学和蛋白材料等方面得到了广泛的研究，同时在蛋白固定方面也有广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种IMP检测蛋白。

本发明的另一目的在于，提供上述IMP检测蛋白的制备方法。

本发明的再一目的在于，提供上述IMP检测蛋白的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种IMP检测蛋白，是以来源于棉囊阿舒氏酵母Ashbya gossypii的IMPDH的编码基因为基础，使用序列SQDG取代Bateman结构域，再将残基222从Cys突变为Ala得到dIMPDHΔBateman蛋白，之后在残基316～324区间内，插入PGC-cpYFP-MLR片段进行取代得到的。

所述的dIMPDHΔBateman蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的PGC-cpYFP-MLR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的IMP检测蛋白结合IMP后，接受485nm和420nm的激发波长后会在528nm产生激发荧光，在1～30mM浓度范围内，其R

优选的，所述的IMP检测蛋白，是将dIMPDHΔBateman蛋白321，322，323位置的残基替换为PGC-cpYFP-MLR得到的IMPCP1蛋白。

所述的IMPCP1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的IMPCP1蛋白，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的IMP检测蛋白的制备方法包括如下步骤：

将dIMPDHΔBateman蛋白的核苷酸序列残基316～324区间替换为PGC-cpYFP-MLR片段，将得到的序列整合到质粒上，转入工程菌，表达后得到IMP检测蛋白。

一种用于检测IMP的检测试剂，是将IMPCP1蛋白通过PT-SpyCatcher/SpyTag系统固定于环氧基修饰的磁珠上得到的。

所述的检测试剂的制备方法包括如下步骤：

(1)表达PT-SpyCatcher基因和SpyTag-GS-IMPCP1基因得到PT-SpyCatcher蛋白和SpyTag-GS-IMPCP1蛋白；

(2)在环氧基修饰的磁珠中加入PT-SpyCatcher蛋白和SpyTag-GS-IMPCP1蛋白，固定，得到用于检测IMP的检测试剂IMPTK。

所述的PT-SpyCatcher基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的SpyTag-GS-IMPCP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的固定为25℃、50rpm条件下反应12h。

一种用于检测IMP的试剂盒，包括上述IMP检测蛋白或用于检测IMP的检测试剂。

上述的IMP检测蛋白在制备IMP检测试剂中的应用。

上述的IMP检测蛋白和用于检测IMP的检测试剂在检测IMP中的应用。

所述的检测IMP为检测1～30mM浓度范围内的IMP。

所述的检测IMP为检测停滞棒杆菌的发酵上清液中的IMP。

所述的应用，具体步骤包括：

反应时吸取100μL检测试剂/蛋白与50μL pH7.5的50mM Tris Buffer混合在酶标板上，再加入50μL样品反应，放入酶标仪中读取F485(485nm激发，528nm发射)和F420(420nm激发，528nm发射)，将R

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明依据来源于棉囊阿舒氏酵母Ashbya gossypii的IMPDH对IMP的特异性识别和结合能力，用SQDG取代Bateman结构域(残基Tyr116–Tyr235)，再将IMPDHΔBateman蛋白残基222从Cys突变为Ala得到dIMPDHΔBateman，使其失去对IMP的催化活性但保留对IMP的结合能力。在残基320/324位置插入PGC-cpYFP-MLR，即PGC-cpYFP-MLR，构建了对IMP有响应的融合蛋白IMPCP1。再将IMPCP1蛋白通过PT-SpyCatcher/SpyTag系统固定于环氧基修饰的磁珠(Magarose-Epoxy)上得到IMPTK检测试剂，可以高效快速检测发酵液上清的IMP浓度，

(2)本发明制备得到的检测试剂操作便捷，不再需要昂贵且复杂的高效液相色谱和质谱，而且可以回收试剂的磁珠蛋白多次重复使用，荧光结果稳定性好且经济。可为实现为检测发酵罐IMP产量提供新的策略。

附图说明

图1为快速检测试剂盒检测流程示意图。

图2为实施例2中不同蛋白对IMP的响应值图

图3为实施例3中IMPCP1蛋白特异性测定图

图4为实施例3中IMPCP1蛋白检测限测定图。

图5为实施例3中IMPCP1蛋白反应动力学图。

图6为实施例5中重复五次使用IMPTK检测试剂结果图。

图7为实施例6中IMPTK检测试剂对在FMAC和CGXII培养基发酵液中的验证结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中使用的菌株停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC 6872购自ATCC，大肠BL21(DE3)感受态和基因序列合成均来自上海生工生物公司。

BHISG液体培养基的配方为：

每1000mL中，加入37g/L脑心浸液(Becton，Dickinson and Co.)，10g/L葡萄糖，9.1g/L L-山梨醇，余量为水。

FMAC培养基配方为:

每1000mL中，加入20g/L葡萄糖，3g/L尿素，2g/L NH

CGXII培养基配方为:

每1000mL中，42g/L 3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸(MOPS)，22g/L葡萄糖，20g/L硫酸铵，5g/L尿素，1g/L K

实施例1IMPCP1表达质粒的制备

(1)以来源于棉囊阿舒氏酵母Ashbya gossypii的IMPDH的编码基因(NCBI数据库登录号为AE016818.2)为基础，使用序列SQDG取代Bateman结构域(残基Tyr116–Tyr235)，得到IMPDHΔBateman蛋白，再将残基222从Cys突变为Ala得到dIMPDHΔBateman(SEQ IDNO.1)，使其失去对IMP的催化活性但保留对IMP的结合能力。

(2)在步骤(1)得到的dIMPDHΔBateman基础上，在残基316～324区间内，插入PGC-cpYFP-MLR片段(SEQ ID NO.2)进行取代，得到dIMPDHΔBateman-316/318～dIMPDHΔBateman-322/324共28个不同蛋白的编码基因。

(3)将步骤(2)得到的编码基因连接到pET28a质粒上，采用商用的基于重组酶的高效无缝克隆NEB Builder HiFi DNA Assembly Master Mix kit(New England BioLabs，Boston，MA)技术进行质粒组装，重组反应体系为：5μL2xNEB Builder HiFi DNA AssemblyMaster Mix，100pmol载体骨架，300pmol目的基因插入片段，补足ddH

实施例2蛋白的表达和最优蛋白的选择

(1)将实施例1合成的含有dIMPDHΔBateman基因的不同PGC-cpYFP-MLR片段插入位点的质粒按照常规的大肠杆菌热激转化法，导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂板培养。

(2)挑取单菌落接种于卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃250r/min振荡培养，培养至OD

(3)将所得蛋白液稀释到0.3μM，在酶标板内加入0，1，10mM的IMP，加入50μL的pH7.5的50mM Tris Buffer以及100μL的蛋白液混合于酶标板，立刻放入酶标仪读取F485(485nm激发，528nm发射)和F420(420nm激发，528nm发射)，R

实施例3IMPCP1蛋白性能表征

(1)参照实施例2步骤(3)的方法，验证实施例2获得的纯化IMPCP1蛋白对IMP，以及IMP类似物AMP(腺苷酸)，GMP(鸟苷酸)单独反应或两种核苷酸复配，三种核苷酸复配的溶液的响应效果(单独及复配溶液中每种核苷酸的浓度均为10mM)，其归一化的R

(2)配置0.01到100mM浓度的IMP来检测IMPCP1的响应上下限，检测方法参照步骤(1)，结果如图4所示，实验数据显示，在1～30mM IMP浓度范围内，R

(3)使用酶标仪检测IMPCP1的反应动力学，将IMPCP1蛋白在酶标仪中先连续检测100秒，对照组和实验组R

实施例4IMPTK检测试剂的制备

(1)将PT-SpyCatcher基因连接到pET28a质粒上得到pET28a-PT-SpyCatcher质粒，并将SpyTag-GS基因和IMPCP1的编码基因整合得到的SpyTag-GS-IMPCP1基因连接到pET28a质粒上得到pET28a-SpyTag-GS-IMPCP1质粒。

(2)按照常规的大肠杆菌热激转化法，将步骤(1)得到的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂板培养，挑取单菌落接种于卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃250r/min振荡培养，培养至OD

(3)将1g环氧基修饰的磁珠(Magarose-Epoxy，购置于北科纳米公司，货号：PMAG014)用pH7.5的50mM Tris Buffer清洗四遍，加入1.25mL的0.4mg/mL的PT-SpyCatcher蛋白，25℃50rpm条件下反应12h，用pH7.5的50mM Tris Buffer清洗两遍，加入1mL的0.3mg/mL的SpyTag-GS-IMPCP1蛋白，25℃50rpm条件下反应2h，用pH7.5的50mM Tris Buffer清洗两遍，每10mg固定了蛋白的磁珠加入1mL的pH7.5的50mM Tris Buffer并于4℃保存，得到Magarose-Epoxy-PT-SpyCatcher-SpyTag-GS-IMPCP1检测试剂，即用于快速检测IMP的IMPTK检测试剂。

实施例5IMPTK快速检测试剂的稳定性检验

从4℃冰箱取出IMPTK检测试剂，吸取100μL IMPTK试剂与50μL pH7.5的50mM TrisBuffer混合在酶标板上，再加入配置好的0，1，10mM的IMP，放入酶标仪中读取F485(485nm激发，528nm发射)和F420(420nm激发，528nm发射)，R

结果如图6所示，实验结果显示，五次重复使用同一份IMPTK快速检测试剂，R

实施例6IMPTK快速检测试剂的发酵液检测

(1)停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC 6872常用的发酵培养基是FMAC和CGXII，将配置好的FMAC和CGXII培养基以及pH7.5的50mM Tris Buffer以内参的方式加入0.1，1，10，20mM IMP，然后吸取100μL IMPTK试剂与50μL pH7.5的50mM Tris Buffer再取50μL样品三者混合在酶标板上，放入酶标仪中读取F485(485nm激发，528nm发射)和F420(420nm激发，528nm发射)，R

(2)用BHISG液体培养基接种停滞棒杆菌ATCC6872，30℃，250rpm/min条件培养16h，以终OD

上述实施例表明，本发明公开了一种基于对IMP特异性响应的融合表达IMPCP1蛋白并通过PT-SpyCatcher/SpyTag系统固定于环氧基修饰的磁珠上的IMPTK试剂建立方法、检测方法及其试剂盒。本发明检测试剂盒，检测样品和检测方法都十分便捷和高效，试剂反应时间仅需几秒钟，数据重现性良好，可回收再次利用磁铁再次回收使用，经济性好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。