一种基于KASP技术鉴定棉花品种中棉所63的方法

技术领域

本发明属于棉花品种鉴定领域，具体为一种基于KASP技术鉴定棉花品种中棉所63的方法。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物和战略物资，从种源上保证棉花品种的真实性对我国棉产业发展至关重要。好的种源能够保证棉农增收，促进当地经济发展，但是在市场上往往存在种子“套牌”现象，导致一些假冒伪劣棉种流入市场，造成产量损失与品质下降，坑害棉农的利益，所以棉花品种的真伪鉴定在生产、加工和销售过程中及其重要。

在众多棉花品种中，中棉所63是中国农业科学院棉花研究所历经多年培育的强优势杂交棉品种，2010～2015年连续六年入选全国主导品种，是年限最长的杂交棉主导品种和长江流域棉区主导品种。在长江流域多次实现亩产籽棉超500kg，亩产皮棉超200kg，是以高产、稳产著称的杂交棉品种。因此，针对中棉所63开展品种鉴定，对保障棉花种业市场稳定、防止种子套牌具有积极意义。

但是现有的种子鉴别包括人工鉴别、田间种植鉴别、电泳检测、生理和化学鉴定等方法，这些方法虽能有效鉴别棉花品种，但都存在着一些缺点，如人工鉴别往往存在着经验性，鉴别精度差，而田间种植则需要消耗大量的时间人力物力，成本较高，电泳检测操作繁琐等。

发明内容

要解决的技术问题：如何通过精度高、操作简便、节省成本的方法进行棉花品种中棉所63的鉴别。

技术方案：本发明提供了一种基于KASP技术鉴定棉花品种中棉所63的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一，收集单核苷酸多态性位点(SNP)信息：从公共数据库中下载陆地棉基因组序列，借助Blsat+进行基因组序列的本地化比对，找到基因组中存在的SNP信息，随机从不同染色体上挑选SNP并整理其基本信息，包括所在染色体、染色体物理位置和碱基变异，根据这些信息，提取SNP位点上下游50bp的序列；步骤二，KASP引物设计：对上述每条序列在SNP位置处添加碱基变异位点，根据KASP引物设计原则，利用primer3软件基于上述每条序列碱基变异位点分别设计三条引物序列，包括两条正向PCR引物序列和一条通用反向引物序列；其中，正向引物3’端为变异的碱基，在正向引物的5’端分别添加标签序列；步骤三，棉花品种DNA准备：选取包括TM-1在内的来自我国不同育种年代的棉花品种21份，具体包括陆地棉遗传标准系TM-1，其它品种具体包括八农212、吐71-113、库车96515、喀什736、库车T94-4、新陆早10号、莎陆1号、新陆中5号、新陆早36、博乐34、新陆早21、新陆早28、新陆中34、军棉1号、吐83-161、石河子913、科遗7号、红鸡脚叶白绒、新陆早31和新陆早7号；将包括中棉所63在内共22份棉花品种种植于营养钵中，待长出真叶后，剪取供试材料幼嫩叶片组织，采用CTAB法提取基因组DNA，将提取好的DNA稀释成最终浓度为40ng/μL，得到待检测模板；步骤四，KASP反应体系及扩增程序：KASP反应在384孔荧光定量板上进行，每孔的混合反应体系共计5.0μL；反应的混合体系如下：DNA模板2.2μL、kasp试剂2.5μL、引物0.056μL、灭菌超纯水0.244μL；KASP扩增程序包括四步：一是在94℃环境温度下扩增15min；二是在95℃环境温度下扩增20s；三是在61-55℃环境温度下扩增25s；四是在95℃下扩增10s；五是在57℃下扩增1min；最后冷却至4℃后保存；步骤五，结果和数据读取：利用罗氏LightCycler480荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；待反应完成后，同一位点不同等位变异通过不同颜色或者不同形状展示，相同等位变异类型的材料以相同颜色或者相同形状的图形通过二维聚类图展示，同时导出表格形式。

技术效果：本发明对P2-6、P5-4、P6-3、P7-3、P12-2、P13-2中碱基变异位点信息整理，针对变异位点设计特异性引物，获得的6对引物组可有效区分等位变异位点，可用于中棉所63品种鉴定。采用所述引物组对包括中棉所63在内的22份棉花品种进行差异位点分型，结果能够明显区分中棉所63和其它品种基因组位点差异的检测，为中棉所63品种鉴定和保护提供了新思路。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的SNP变异基本信息示意图；

图2为本发明的6个SNP位点序列信息示意图；

图3为本发明的SNP位点的引物信息示意图；

图4为本发明的KASP基因分型结果P2.6示意图；

图5为本发明的KASP基因分型结果P5.4示意图；

图6为本发明的KASP基因分型结果P6.3示意图；

图7为本发明的KASP基因分型结果P7.3示意图；

图8为本发明的KASP基因分型结果P12.2示意图；

图9为本发明的KASP基因分型结果P13.2示意图；

图10为本发明的不同品种在6个变异位点的KASP基因分型结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本具体实施方式提供的基于KASP技术鉴定棉花品种中棉所63的方法，包括：

一，收集单核苷酸多态性位点(SNP)信息：从公共数据库中下载陆地棉基因组序列，借助Blsat+进行基因组序列的本地化比对，找到基因组中存在的SNP信息，随机从不同染色体上挑选SNP并整理其基本信息，包括所在染色体、染色体物理位置、碱基变异。根据这些信息，提取SNP位点上下游50bp的序列。考虑到引物设计时，需要注意特异性、避免引物发夹结构、GC含量维持在40-60％的原则，因此筛选了6个SNP，其具体信息如图1所示；

二，KASP引物设计：由于引物是针对碱基变异位点设计，所以对上述每条序列在SNP位置处添加碱基变异位点，分别整理成如图2所示，为方便起见，将表1中的每个SNP引物名称对应于相应SNP的序列，并采用相同命名，其中[/]即为碱基变异位点。根据KASP引物设计原则，利用primer3软件基于上述每条序列碱基变异位点分别设计三条引物序列，包括两条正向PCR引物序列和一条通用反向引物序列。其中正向引物3’端为变异的碱基，在正向引物的5’端分别添加标签序列，在本发明中，第一条正向引物(F1)5’端添加FAM标签的核苷酸序列:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，在第二条正向引物5’端添加HEX标签的核苷酸序列:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。同时，对每条序列的下游设计通用的反向引物(C1)，其引物信息如图3所示，本发明对所述引物组的各引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物来源即可。在本发明实施例中，引物组委托北京六合华大基因科技有限公司合成。引物合成后将其稀释成100μM，引物体系包括两条标签引物各12μL，通用反向引物30μL，ddH

三，棉花品种DNA准备：选取包括TM-1在内的来自我国不同育种年代的棉花品种21份，具体包括陆地棉遗传标准系TM-1，其它品种具体包括八农212、吐71-113、库车96515、喀什736、库车T94-4、新陆早10号、莎陆1号、新陆中5号、新陆早36、博乐34、新陆早21、新陆早28、新陆中34、军棉1号、吐83-161、石河子913、科遗7号、红鸡脚叶白绒、新陆早31、新陆早7号。以这些棉花品种为对照来鉴别中棉所63品种，可提高品种鉴定的准确度。以上这些棉花品种均为公开的棉花品种，可通过市售或其他手段容易获得。将以上22份棉花品种种植于营养钵中，待长出真叶后，剪取供试材料幼嫩叶片组织，采用CTAB法提取基因组DNA。将提取好的DNA稀释成最终浓度为40ng/μL，得到待检测模板；

四，KASP反应体系及扩增程序：KASP反应在384孔荧光定量板上进行，每孔的混合反应体系共计5.0μL。根据罗氏LightCycler480荧光定量仪(Roche)要求订购HiGeno2Xprobe MixAkasp试剂。反应的混合体系如下：DNA模板2.2μL、kasp试剂2.5μL、引物0.056μL、灭菌超纯水0.244μL。KASP扩增程序：(1)94℃，15min；(2)95℃，20s；61-55℃，25s(10个循环，每个循环下降0.6℃)；(3)95℃，10s；57℃，1min，40个循环；(4)4℃保存；

五，结果和数据读取：利用罗氏LightCycler480荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；待反应完成后，同一位点不同等位变异通过不同颜色或者不同形状展示，相同等位变异类型的材料以相同颜色或者相同形状的图形通过二维聚类图展示，同时导出表格形式。

KASP检测结果如图4-10所示，不同形状代表不同的碱基变异，相同形状的点表示携带相同碱基变异的材料。不同品种在目标位点上均能产生明显的分型。

所有位点组合鉴别中棉所63：KASP基因分型结果显示，中棉所63在6个位点携带的碱基分别为C(P2-6)C(P5-4)Heterozygote(P6-3)Heterozygote(P7-6)Heterozygote(P12-2)Heterozygote(P13-2)，结果显示中棉所63在4个位点上存在杂合类型(Heterozygote)，这与中棉所63品种本身是杂交棉特性相一致。同时，在选择的6个SNP位点上，其它21个品种则无与中棉所63完全一样的碱基变异，表明这些位点能够鉴定品种中棉所63。

两个位点组合鉴别中棉所63：进一步分析发现，在P11-1位点上，与中棉113携带相同碱基变异A的只有品种吐71-113和新路早21，而这两份品种在其它5位点P2-6、P5-4、P6-3、P7-3、P12-2、P13-2上携带的碱基变异均与中棉所63不同，其中，中棉所63为C(P5-4)Heterozygote(P6-3)Heterozygote(P7-6)Heterozygote(P12-2)Heterozygote(P13-2)，而吐71-113为T(P5-4)G(P6-3)T(P7-6)A(P12-2)C(P13-2)，新路早21为T(P5-4)T(P6-3)T(P7-6)A(P12-2)C(P13-2)，结果一方面清晰表明中棉所63在基因组上最大的特征为杂合位点多，从基因组水平上证实中棉所63为杂交棉品种；另一方面表明，通过P2-6位点与P5-4、P6-3、P7-3、P12-2、P13-2位点中的任意组合都能够鉴别品种中棉所63。

三个位点组合鉴别中棉所63：中棉所63与品种博乐34、军棉1号均在位点P12-2上为杂合类型(Heterozygote)，因此通过该位点可以将中棉所63、博乐34、军棉1号与其它棉花品种区分；进一步中棉所63与军棉1号在P5-4位点均携带CC碱基，而博乐34携带TT碱基，因此该位点可进一步将中棉所63、军棉1号与其它品种相区分；深入分析位点位点P6-3和位点P13-2，发现中棉所63均为杂合类型，而军棉1号在位点P6-3携带TT碱基变异、位点P13-2携带AA碱基变异，因此这两个位点均可将中棉所63与军棉1号区分。综上所述，三个位点组合P12-2/P5-4/P6-3与P12-2/P5-4/P13-2均能将中棉所63与其它品种区分。此外，在三个位点组合P7-3/P12-2/P13-2上，中棉所63携带碱基变异均为杂合类型，因此也可容易区分中棉所63与其它品种。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。