甜樱桃果实硬度的AFLP分子标记、检测引物及其应用

技术领域

本发明涉及果实硬度的分子标记，尤其涉及甜樱桃果实硬度的AFLP分子标记、检测引物及其应用，属于甜樱桃果实硬度的分子标记、检测引物及其应用领域。

背景技术

甜樱桃(Prunus avium L.)是蔷薇科李属樱桃亚属植物，是目前北方落叶果树中栽培效益较好且上市最早的鲜果，具有较高的营养价值和保健功效，深受消费者喜爱。果实硬度是甜樱桃最主要的品质属性之一，甜樱桃果实成熟后容易软化，品质下降明显，成为制约甜樱桃果实贮藏寿命和货架期的重要因素，严重限制了甜樱桃产业的发展。目前，与甜樱桃果实硬度相关的基因研究较少，控制甜樱桃果实硬度的关键机制仍不清楚。因此，开展控制甜樱桃果实硬度相关基因或分子标记的挖掘及机理解析工作，对提高甜樱桃果实综合品质，增强市场竞争力以及选育和培育硬质型的甜樱桃新品种具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供甜樱桃果实硬度AFLP分子标记；

本发明的目的之二是提供用于甜樱桃果实硬度的AFLP分子标记检测引物；

本发明的目的之三将所述的甜樱桃果实硬度的分子标记或其检测引物应用于检测甜樱桃果实的硬度或选育和培育硬质型甜樱桃新品种。

本发明的一方面是提供了核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段作为甜樱桃果实硬度的AFLP分子标记。

本发明为了确定Pav_sc0000480.1_g920.1.mk是否为控制甜樱桃果实硬度的候选基因，考虑到Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因在硬质型的甜樱桃F1单株中不表达，分别分析了软肉型、硬肉型和硬质型甜樱桃的F1单株中Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因的编码区和启动子区的序列信息差异，结果发现硬质型的甜樱桃的F1单株中Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因的编码区的第二个外显子区域内存在1个5.2kb片段插入(该5.2kb片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示)，编码区其他区域和启动子区域内没有存在序列差异。将5.2kb的插入片段导入NCBI上进行BLAST分析，发现其为一个转座子插入片段。Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因在硬质型甜樱桃的F1单株中不表达可能由于5.2kb转座子插入导致基因失活所致，由此断定Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因是控制甜樱桃果实硬度的候选基因，依据甜樱桃基因组的基因信息注释，Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因是丝氨酸羧肽酶类蛋白家族的一个成员，将其命名为PavSCPL基因，其CDS的核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示。

本发明进一步根据PavSCPL基因(5.2kb TE插入)的DNA多态性，设计了与甜樱桃果实硬度表型相关的扩增片段长度多态性(AFLP)标记PavSCPL-1-F/R(SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4)、PavSCPL-2-life-F/R(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)和PavSCPL-3-right-F/R(SEQID No.7和SEQ ID No.8)，用于检测部分自然群体和杂交群体中果实硬度性状与基因型的共分离情况；利用AFLP标记PavSCPL-1-F/R检测发现，硬质型甜樱桃果实只扩增出1条大片段条带，暗示硬质型中PavSCPL基因型为5.2kb的转座子的纯合插入；硬肉型果实扩增出2条带(一条大片段和一条小片段)，暗示硬肉型中PavSCPL基因型为杂合插入；软肉型甜樱桃果实中仅扩增出1条短片段，暗示软肉型中PavSCPL不存在5.2kb的转座子插入。进一步利用AFLP标记PavSCPL-2-life-F/R和PavSCPL-3-right-F/R检测，发现类似的鉴定结果，即硬肉型和硬质型均可扩增出5.2kb的转座子插入片段，而软肉型中无法扩增出5.2kb的转座子插入片段。因此，采用本发明提供的PavSCPL基因相关的AFLP标记检测结果的准确率达100％，PavSCPL基因及等位基因鉴定的甜樱桃果实硬度性状结果与硬度表型结果一致，表明PavSCPL基因的基因型与果实硬度表型共分离。

本发明的另一方面提供了应用核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段检测甜樱桃果实硬度或选育、培育硬质型甜樱桃品种中的应用，包括：(1)以核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段为靶标基因设计AFLP标记引物；(2)以待检测甜樱桃样品的DNA为模板DNA，以AFLP标记引物为扩增引物建立PCR扩增体系进行PCR扩增；(3)如果扩增产物中扩增出SEQ ID No.1所示的转座子插入片段，则待检测的甜樱桃的果实为硬肉型或硬质型；如果扩增产物中没有扩增出SEQ ID No.1所示的转座子插入片段，，则待检测的甜樱桃的果实为软肉型。

本发明的一种优选的具体实施方案，所述的PCR反应扩增体系如下：KOD One TMPCR Master Mix 12.5μL，正向引物0.75μL，反向引物0.75μL，ddH

本发明的一种优选的具体实施方案，所述的PCR扩增的程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1或3min，32个扩增循环；72℃延伸10min。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，本发明以核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的转座子插入片段为靶标基因设计得到了3对AFLP标记引物，即：PavSCPL-1-F/R、PavSCPL-2-life-F/R和PavSCPL-3-right-F/R；其中，AFLP标记引物PavSCPL-1-F/R的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，AFLP标记引物PavSCPL-2-life-F/R的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo.5和SEQ IDNo.6所示，AFLP标记引物PavSCPL-3-right-F/R的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

本发明进一步提供了一种检测甜樱桃果实硬度的PCR检测试剂盒，包括：KOD OneTM PCR Master Mix 12.5μL，正向引物、反向引物和ddH

本发明以‘雷尼’ב萨米脱’F 1杂交群体为材料，利用BSA-seq初步定位了目标基因区段，在此基础上进行了精细定位，确定控制甜樱桃果实硬度的关键基因位于6号染色体上473Kb区间内，结合基因表达分析和基因克隆鉴别到控制甜樱桃果实硬度基因PavSCPL，且在硬质型甜樱桃PavSCPL基因的编码区存在5.2Kb的转座子插入的等位基因，该5.2Kb的转座子插入的等位基因导致PavSCPL基因失活；本发明进一步根据PavSCPL基因的多样性，开发了果实硬度的AFLP分子标记，采用上述AFLP标记检测结果甜樱桃果实硬度的准确率达100％，PavSCPL基因及等位基因鉴定的甜樱桃果实硬度性状结果与硬度表型结果一致，在辅助甜樱桃硬肉性状的遗传改良，为耐贮性型甜樱桃种质的选育等方面具有应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

本发明中所述的术语“软肉型”是指甜樱桃果实硬度为0-3.5Kg/cm

术语“AFLP”指扩增片段长度多态性(Amplified restriction fragmentpolymorphism)。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

附图说明

图1为父、母本和杂交群体果实硬度统计及遗传规律分析；A.父本和母本的果实硬度统计；B-C.2018(B)年和2019(C)年杂交群体的果实硬度的频率统计分析。

图2为甜樱桃果实硬度的性状的BSA定位分析结果；其中，A和B分别采用△(SNP-index)和△(InDel-index)方法进行定位分析结果。

图3为甜樱桃6号染色体上控制甜樱桃果实硬度的性状区段的精细定位分析结果。

图4为基于转录组数据分析控制甜樱桃果实硬度的精细定位区间内基因的表达变化。

图5为控制甜樱桃果实硬度的候选基因的筛选及基因的编码区结果分析结果。

图6为5.2kb转座子插入的分子标记在部分自然群体和杂交群体中基因分型情况；A.AFLP标记PavSCPL-1-F/R检测的结果；B.PavSCPL-2-life-F/R标记引物检测的结果；C.PavSCPL-3-right-F/R检测引物检测的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1.生物材料

本试验基于课题组前期构建的以甜樱桃‘雷尼(Rainier)’为母本，‘萨米脱(Summit)’为父本的遗传群体，于2012年栽植于中国农业科学院郑州果树研究所新乡综合试验基地甜樱桃育种圃，其杂交群体F1单株共计204株，并于2018年和2019年连续两年对其F1子代果实进行硬度检测。

用于遗传定位分析的材料采自上述群体的新鲜叶片，将叶片保存于-80℃超低温用于后续DNA的提取。

2.引物信息

表1本发明中所使用的的引物信息

试验例1控制甜樱桃果实硬度的候选基因的克隆

1.试验方法

(1)F 1杂交群体的果实硬度测定。

采用TA-XT plus质构仪测定果实硬度，使用P/2探头，直径为2mm，具体参数为：测试模式为压缩，测前速度为1.00mm/sec，测中速度为1.00mm/sec，测后速度为2.00mm/sec，位移为3.000mm，触发力为5.0g。F 1杂交群体每个单株随机选取10个成熟期果实进行带皮检测，每个果实在赤道位点的3个不同面进行测定。

(2)BSA-测序分析。

根据F1杂交群体果实硬度的调查结果，从F1分离群体中随机选取两个极端性状：硬质型20个单株和软肉型20个单株，用于DNA的提取。以子代混池中各样本DNA总量500ng为标准，计算每个样本需吸取的DNA体积，分别等量混合两种硬度类型的单株DNA，组成硬质池(Hard-pool)和软肉池(Soft-pool)。将混好的BSA-seq样本送至天津诺禾致源生物技术有限公司进行重测序。

(3)精细定位分析。

根据BSA-seq分析确定的主要QTL区段内的15个SNP和InDels标记，在硬质池(Hard-pool)和软肉池(Soft-pool)之间进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证，筛选F1杂交群体的重组个体，进行精细定位。使用Primer Premier 5.0软件设计引物。PCR扩增使用2×Taq Master Mix(中国南京Vazyme生物技术有限公司)，体积为50μL，含有1μL 0.5-μM的正向和反向引物和50-100ng DNA，PCR产物通过PAGE分析或由上海生工生物技术有限公司进行测序分析。

(4)精细定位区间内基因表达量分析。

参照甜樱桃的参考基因组，在精细定位的候选区间共注释到72个基因。分别从硬质池(Hard-pool)和软肉池(Soft-pool)中随机选取3个单株，提取叶片的总RNA，并反转录成cDNA，以甜樱桃的Histone2基因为内参，对注释的72个基因进行表达量检测分析。

qPCR反应在ABI7500 PCR热循环仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,United States)上进行，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)试剂盒进行反应，以甜樱桃的Histone2基因为内参进行分析。并进行三次生物学重复，取平均值。

(5)候选基因序列的克隆。

分别提取两个池的总DNA扩增候选基因序列。参考甜樱桃的基因组数据库利用Primer Premier 5.0软件设计引物PavSCPL-F/PavSCPL-R和PavSCPL-Pro-F/PavSCPL-Pro-R，扩增候选基因的DNA序列和启动子序列信息。用ExTaq酶(TaKaRa，中国大连)分别扩增PavSCPL候选基因DNA序列和启动子区域。PCR产物进行测序分析，以确定DNA多态性。

2试验结果

2.1杂交群体单株果实硬度的调查和遗传规律分析。

本发明人团队从2018年开始对‘雷尼尔’ב萨米脱’的204株的F1杂交单株果实硬度性状进行了连续3年调查。选取果实成熟度(完全成熟)一致的果实，利用质构仪(TPA法)测定果实硬度，每株随机选取20个果实，每个果实在赤道位点的4个不同面测定。结果发现该杂交群体的果实硬度分布在0.5-12.5Kg/cm

以两年(2018年和2019年)F 1单株的果实硬度做次数分布图，进行Shapiro-Wilk检验，结果发现果实硬度呈正态分布，并以单峰形式存在，而且软肉型和硬质型性状的分离大致为1:1，(2018年，软肉型单株数量:硬质型单株数量＝52:46；2019年，软肉型单株数量:硬质型单株数量＝48:53，图1)，表明F1群体的果实硬度性状可能由单基因或主效基因控制。

2.2甜樱桃果实硬度性状的BSA定位分析。

根据F1单株的果实硬度表型，选取果实硬度的两个极端表型软肉型(果实硬度0-3.5Kg/cm

2.3甜樱桃果实硬度性状的精细定位分析。

为进一步缩小控制甜樱桃果实硬度的候选基因在染色体上的位置区间，本试验利用BSA-seq获得的SNP和InDel标记对F1群体进行了精细定位分析。

为了寻找F1群体中染色体重组的单株，本试验利用InDel-5.759971和SNP-11.506215两个标记对204个F1单株进行基因型分析，发现13个交换单株。依据BSA-seq结果，在InDel-5.759971和SNP-11.506215两个分子标记内部另外设计15个分子标记，对13个交换单株进行基因型分析，结合交换单株果实硬度的表型，确定控制甜樱桃果实硬度的候选区段被界定在甜樱桃基因组上的SNP-7.418778和SNP-7.891914两个分子标记间的473Kb区域内(图3)。

2.4结合转录组学筛选控制甜樱桃果实硬度的候选基因。

参考甜樱桃基因组的基因注释，在6号染色体的SNP-7.418778和SNP-7.891914分子标记间的473Kb区域内共识别到72个基因。为进一步挖掘调控甜樱桃果实硬度的候选基因，本试验研究了F1群体中软肉型(3个单株)和硬质型(3个单株)转录组差异。

通过差异基因表达水平分析，并根据差异表达基因的功能注释，重点分析的是6号染色体SNP-7.418778和SNP-7.891914分子标记间的473Kb区域上的72个基因表达量变化；研究结果发现候选区段内多数基因在软肉型和硬肉型的F1单株中表达量没有显著变化，仅5个基因(Pav_sc0000480.1_g920.1.mk，Pav_sc0000480.1_g990.1.mk，Pav_sc0000480.1_g1030.1.mk，Pav_sc0000480.1_g1040.1.mk和Pav_sc0000480.1_g1090.1.mk)的表达量在软肉型和硬质型的F1单株间存在显著差异，特别是Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因在硬质型的F1单株中不表达，在软肉型的F1单株中高表达(图4)，由此推测Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因最有可能是控制甜樱桃果实硬度的候选基因。

2.5控制甜樱桃果实硬度的候选基因的克隆

为了确定Pav_sc0000480.1_g920.1.mk是否为控制甜樱桃果实硬度的候选基因，考虑到Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因在硬质型的甜樱桃F1单株中不表达，分别分析了软肉型、硬肉型和硬质型甜樱桃的F1单株中Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因的编码区和启动子区的序列信息差异，结果发现硬质型的甜樱桃的F1单株中Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因的编码区的第二个外显子区域内存在1个5.2kb片段插入(该5.2kb片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示)，编码区其他区域和启动子区域内没有存在序列差异。将5.2kb的插入片段导入NCBI上进行BLAST分析，发现其为一个转座子插入片段(图5)。Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因在硬质型甜樱桃的F1单株中不表达可能由于5.2kb转座子插入导致基因失活所致，由此断定Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因是控制甜樱桃果实硬度的候选基因，依据甜樱桃基因组的基因信息注释，Pav_sc0000480.1_g920.1.mk基因是丝氨酸羧肽酶类蛋白家族的一个成员，将其命名为PavSCPL，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

试验例2甜樱桃果实硬度AFLP标记的开发和应用试验

根据PavSCPL基因(5.2kb TE插入)的DNA多态性，设计了与甜樱桃果实硬度表型相关的扩增片段长度多态性(AFLP)标记PavSCPL-1-F/R(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)、PavSCPL-2-life-F/R(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)和PavSCPL-3-right-F/R(SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8)，用于检测部分自然群体和杂交群体中果实硬度性状与基因型的共分离情况。

检测的材料包括甜樱桃栽培品种80份(果肉硬质型材料2份，果肉硬肉型材料7份，果肉软肉型材料71份)，甜樱桃野生种2份(软肉型)，以及申请人团队获得的果肉硬肉型甜樱桃优系6份，共计检测品种、品系或种质96份。

PCR反应体系如下：KOD One TM PCR Master Mix 12.5μL，正向引物0.75μL，反向引物0.75μL，ddH

利用AFLP标记PavSCPL-1-F/R检测发现，硬质型甜樱桃果实只扩增出1条大片段条带，暗示硬质型中PavSCPL基因型为5.2kb的转座子的纯合插入；硬肉型果实扩增出2条带(一条大片段和一条小片段)，暗示硬肉型中PavSCPL基因型为杂合插入；软肉型甜樱桃果实中仅扩增出1条短片段，暗示软肉型中PavSCPL不存在5.2kb的转座子插入(图6A)。进一步利用AFLP标记PavSCPL-2-life-F/R和PavSCPL-3-right-F/R检测，发现类似的鉴定结果，即硬肉型和硬质型均可扩增出5.2kb的转座子插入片段，而软肉型中无法扩增出5.2kb的转座子插入片段(图6B-C)。PavSCPL基因相关的AFLP标记检测结果的准确率达100％，PavSCPL基因及等位基因鉴定的甜樱桃果实硬度性状结果与硬度表型结果一致，表明PavSCPL基因的基因型与果实硬度表型共分离。