一种五汁饮活性成分筛选及含量测定方法

技术领域

本发明涉及中药活性成分筛选与检测，特别是一种五汁饮活性成分筛选及含量测定方法。

背景技术

五汁饮出自于清代吴鞠通的《温病条辨》，系中医药膳经典名方，由200g鲜梨汁、500g鲜藕汁、500g鲜荸荠汁、100g芦根汁、50克麦冬汁组成，五味共奏清热养阴，生津止渴之功。梨、藕、荸荠为水果，芦根、麦冬为药材，故五汁饮适合开发成对化学性肝损伤具有辅助保护作用的保健食品。

参考保健食品申报规定，选择《对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法(修订稿)》中的方案二：“大鼠急性酒精性肝损伤模型”评价五汁饮及其物质基础活性。五汁饮有5种原料，故质量控制标准中应有3个及以上含量测定指标，其中1个含量测定指标必须是活性成分或有效成分。五汁饮中的芦根、麦冬作为药材皆收载于《中国药典》2020版一部中，芦根项下无含量测定方法，麦冬项下以鲁斯可皂苷元为含量测定指标，采用紫外-可见分光光度法测定。对于鲁斯可皂苷元未见有解酒护肝活性的研究报道，且紫外-可见-紫外-可见分光光度法因其专属性不佳不适用于中药复方制剂分析，故目前无适用于五汁饮干浸膏粉的定量分析方法，也无法建立五汁饮保健食品的质量标准。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种五汁饮活性成分筛选方法，确定五汁饮中活性成分作为含量测定指标。

本发明还提供了一种五汁饮活性成分含量测定方法，定量分析方法专属性、准确性、重复性、稳定性、可行性良好，过程简单，可以为五汁饮保健食品、新药开发提供实验依据，具有很强的实用工业开发价值。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种五汁饮活性成分筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

S1.动物实验确定五汁饮中治疗急性酒精性肝损伤的活性成分为酚酸类物质；

S2.采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法从五汁饮中找出化学成分，计算各成分的相对峰面积；

S3.利用SwissTargetPrediction数据库预测出S2中的化学成分可作用的靶点和通路，根据靶点蛋白计算化学成分结合能大小，根据成分的结合能、相对峰面积％，确定活性成分3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B作为五汁饮含量测定指标。

本发明采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)法测定五汁饮干浸膏粉供试品中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B的3种成分含量。

在本发明的一个优选的实施例中，S1中通过大鼠实验确定五汁饮中治疗急性酒精性肝损伤的活性成分主要为3-O-对香豆酰奎宁酸。

在本发明的一个优选的实施例中，S3中靶点蛋白为JNK。

本发明还公开了一种五汁饮活性成分含量测定方法，包括以下步骤：

步骤一、供试品溶液制备：在五汁饮干浸膏中加入提取溶剂反应、过滤，即得供试品溶液；

步骤二、对照品溶液制备：用提取溶剂分别制备3-O-对香豆酰奎宁酸对照品溶液、DL-丁香树脂酚对照品溶液、甲基麦冬黄烷酮B对照品溶液以及提取溶剂溶液，过滤、即得；

步骤三、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，利用UPLC-MS/MS法测定峰面积，计算含量，即得；

其中UPLC-MS/MS法的色谱条件为：以甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱的条件为：0～10min，10％A；10～45min，10％～90％A；45～49min，90％A；49～50min，90～10％A；50～60min，10％A，流速0.2～0.4mL/min，柱温30～40℃。

本发明首次建立了经典药膳方五汁饮中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B的3种活性成分含量测定方法，其中3-O-对香豆酰奎宁酸具有治疗急性酒精性肝损伤功能的活性(经大鼠实验证明)，是五汁饮含量测定有效成分，该含量测定方法符合保健食品申报有关规定。

本发明在筛选试验中发现流动相(B)在加入0.1％、0.2％甲酸后，色谱柱所分离的色谱峰形更尖细，分离度皆>2.0，故该方法选择以0.1％甲酸水溶液作为流动相(B)进行分析测量。

在本发明的一个优选的实施例中，MS条件为：以三重四极杆质谱仪检测；电喷雾离子源(ESI)，各化合物采用多重离子检测(MRM)模式多重离子扫描，正离子模式：射入电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)为10，各成分的母离子(m/z)、子离子(m/z)、去蔟电压(DP)、碰撞电压(CE)如下表所示：

该条件下信号响应值最高，故本发明选择表1中UPLC-MS/MS的MRM条件来进行分析测量。

在本发明一个优选的实施例中，步骤一中提取溶剂为甲醇。当提取溶剂为甲醇时，3种成分提取率之和最高。

在本发明的一个优选的实施例中，步骤一中五汁饮干浸膏粉与提取溶剂的比例为2.0～3.0g：50ml；优选地，步骤一中五汁饮干浸膏粉与提取溶剂的比例为2.0g：50ml。步骤一中五汁饮干浸膏粉与提取溶剂的比例为2.0～3.0g：50ml时，RSD％符合定量分析相关规定。优选地，步骤一中五汁饮干浸膏粉与提取溶剂的比例为2.0g～3.0g：50ml时，3种成分的提取率较高。

在本发明的一个优选的实施例中，步骤三中对照品溶液与供试品溶液的进样体积为1～2μL。进样体积超过2μL时，3-O-对香豆酰奎宁酸等成分的色谱峰拖尾，因此步骤三中对照品溶液与供试品溶液的进样体积为1～2μL。

在本发明的一个优选的实施例中，步骤二中3-O-对香豆酰奎宁酸对照品溶液浓度为2～2.5μg/ml、DL-丁香树脂酚对照品溶液浓度为1～1.5μg/ml、甲基麦冬黄烷酮B对照品溶液浓度为2～2.7μg/ml。

在本发明的一个优选的实施例中，步骤一供试品溶液制备过程中利用超声进行提取。超声法所需时间更少、操作更简单。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：本发明采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)法测定五汁饮干浸膏粉供试品中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B的3种成分含量。本发明创新性地建立了一种UPLC-MS/MS法测定五汁饮干浸膏粉中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B的3种成分含量的方法；其中3-O-对香豆酰奎宁酸具有治疗急性酒精性肝损伤功能的活性(经大鼠实验证明)，是五汁饮含量测定有效成分，该含量测定方法符合保健食品申报有关规定。方法合理、可行，过程简单，可以为五汁饮保健食品、新药开发提供实验依据，具有很强的实用工业开发价值。

附图说明

图1为UPLC-Q-TOF-MS法分析五汁饮各供试液成分。

图2为五汁饮中来自芦根、麦冬的成分在酒精性肝损伤疾病信号通路上作用靶点。

图3为本发明实施例1获得的3个成分对照品的UPLC-MS/MS的MRM色谱图(338.0/191.0、417.3/180.9、328.1/207.0m/z通道)。

图4为本发明实施例1获得的芦根、麦冬、水果、五汁饮缺芦根、五汁饮缺麦冬、五汁饮缺水果、五汁饮全方干浸膏粉的UPLC-MS/MS的MRM色谱图(338.0/191.0、417.3/180.9、328.1/207.0m/z通道)。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定，本领域技术人员将会理解。在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用仪器或试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

对实施例使用的主要仪器设备与材料试药进行简述如下：

美国AB Sciex公司Exion LC AD型超高效液相色谱仪-TripleQuad 3500型三重四极杆质谱仪-X-500R型飞行时间四极杆质谱仪；

乙腈(质谱纯，18100306LM01)，甲醇(质谱纯，17111204LM01)购于OCEANPAK公司；乙腈(色谱纯，19100619G202)，甲醇(色谱纯，18110927G203)购于Tedia Company公司；水为超纯水(18.25M欧)；甲酸(88.0％，176131)购于Fisher Chemical公司；

3-O-对香豆酰奎宁酸(97.0％，M31HB182895)、DL-丁香树脂酚(95.0％，J19HB185430)、甲基麦冬黄烷酮B(98.0％，M29N11S132592)均购于上海源叶生物科技有限公司。

本研究所用芦根皆为鲜芦根(20210101)，与鲜雪梨(20210101)、鲜菜藕(20210101)、鲜荸荠(20210101)、麦冬(20210101)均由湖南省音爽生物科技有限公司提供，鲜芦根、麦冬经湖南省中医药大学药植鉴定教研室王智副教授鉴定为禾本科植物芦苇Phragmites communis Trin.的新鲜根茎、百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根。

课题组前期已对五汁饮进行了提取、过滤、浓缩、干燥、制剂、对急性酒精性肝损伤保护作用物质基础等方面研究，确定了五汁饮干浸膏粉、颗粒剂的最优制备工艺。发现了10.80kg五汁饮原料可以制备出490.3g干浸膏粉，五汁饮干浸膏粉中有43.54g来自芦根、202.8g来自麦冬，43.54g芦根提取物中有芦根多糖提取物25.02g，芦根提取物A(芦根酚酸提取物)0.0380g；202.8g麦冬提取物中有麦冬多糖168.6g，麦冬酚酸提取物0.0355g，3-O-对香豆酰奎宁酸6.102mg，经急性酒精性肝损伤的大鼠实验发现，芦根、麦冬多糖提取物对急性酒精性肝损伤保护作用较弱，而芦根、麦冬酚酸提取物、3-O-对香豆酰奎宁酸作用较强，特别是3-O-对香豆酰奎宁酸用量少护肝作用非常强(2.5mg/kg·d)，说明五汁饮对化学性肝损伤保护作用的物质基础非糖类成分，而可能来自于芦根、麦冬中酚酸类成分，3-O-对香豆酰奎宁酸为主要活性成分，故在建立五汁饮含量测定方法时，可必须选择3-O-对香豆酰奎宁酸等酚酸类成分作为含量测定指标。

前期研究中采用了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)从五汁饮全方、阴性方、单味药干浸膏粉中找出110种化学成分，发现110种成分主要为酚酸、黄酮、皂苷类成分，其中有14种来自芦根、9种仅来自麦冬，具体结果见下列各图1。利用SwissTargetPrediction数据库预测110种成分可作用于359个靶点，选择其中度值排名前20的作用靶点，通过KEGG数据库预测可以作用于36条通路。来自芦根(14种)、麦冬(9种)的成分可以从JNK、p38等靶点调控酒精性肝损伤疾病(ALCOHOLIC LIVER DISEASE)信号通路，如图2所示。选择JNK(6zr5)靶点蛋白计算来自芦根(14种)、麦冬(9种)的成分结合能大小，如表1所示，根据成分的结合能、相对峰面积％，再结合中药质量标志物中的特有性、可测性，传递与溯源、有效性和处方配伍等5个原则，课题组发现3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分适合作为五汁饮含量测定指标。因3种成分在五汁饮干浸膏中含量较低，不适用高效液相色谱法进行含量测定，故该3种成分适合选择超高效液相色谱-三重四极杆质谱法(UPLC-MS/MS)法来建立含量测定方法。

表1五汁饮中来自芦根、麦冬的成分与作用靶点结合能

实施例一

本实施例提供一种UPLC-MS/MS法测定五汁饮干浸膏粉中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B的3种成分含量的方法，包括以下步骤：

(1)以甲醇制备浓度为0.854、1.707、2.134、3.414、4.268μg/ml的3-O-对香豆酰奎宁酸，浓度为0.513、1.026、1.539、2.052、2.565μg/ml的DL-丁香树脂酚，浓度为1.548、3.097、4.645、6.194、7.742μg/ml的甲基麦冬黄烷酮B，同法同时制备溶剂空白对照液。

(2)将鲜雪梨、鲜菜藕、鲜荸荠榨汁得水果汁，鲜芦根、麦冬水煎、过滤、低温浓缩，得药汁，将药汁与果汁混合，低温浓缩，减压低温喷雾干燥或冷冻干燥得五汁饮全方干浸膏粉。同法制备芦根、麦冬、水果、五汁饮缺芦根阴性、五汁饮缺麦冬阴性、五汁饮缺水果阴性干浸膏粉(水果指鲜雪梨、鲜菜藕、鲜荸荠按配方量混合而得)，阴性意为缺失对应原料的干浸膏粉。

(3)取芦根、麦冬、水果、五汁饮缺芦根、五汁饮缺麦冬、五汁饮缺水果、五汁饮全方干浸膏粉各约2.0g，精密称定，加入50ml甲醇，称重，超声(功率250W，频率50kHz)1小时，用甲醇补足损失的重量，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

(4)精密吸取上述(1)各系列3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B对照品溶液各1μl，注入高效液相色谱-质谱仪，按UPLC-MS/MS法条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液1μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，采集UPLC-MS/MS的MRM色谱图，如图3、4所示，根据色谱峰峰面积从标准曲线上读出液质供试品中相当于3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B的浓度，计算，即得。

(5)在(4)中，UPLC-MS/MS的分析条件为：WATERS ACQUITY UPLC@BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相甲醇(A)-0.1％甲酸(B)，梯度洗脱(0～10min，10％A；10～45min，10％～90％A；45～49min，90％A；49～50min，90～10％A；50～60min，10％A)；体积流量0.3mL/min；柱温35℃。以三重四极杆质谱仪检测：电喷雾离子源(ESI)，各化合物采用多重离子检测(MRM)模式多重离子扫描，正离子模式：射入电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)为10，各待测成分的母离子(m/z)、子离子(m/z)、去蔟电压(DP)、碰撞电压(CE)见表2所示。

表2 3种活性成分UPLC-MS/MS的MRM条件。

(6)将各对照品溶液进样，以各成分浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，计算线性回归方程、线性范围，结果见表3。

表3 3种活性成分线性关系考察结果(进样体积1μL)

(7)将五汁饮干浸膏粉供试品溶液连续进样6次，计算各成分含量的RSD％，考察精密度，结果见表4。

(8)照(3)项下方法同时平行制备6份五汁饮干浸膏粉供试品溶液，进样测定，计算各成分含量的RSD％，考察重复性结果，结果见表4。

(9)将五汁饮干浸膏粉供试品溶液于制备后0.0、1.5、3.0、4.5、6.0、12、18、24、48h进样，计算各成分含量的RSD％，考察稳定性结果，结果见表4。

(10)精密称取已知各成分含量的五汁饮干浸膏粉1.0g，共6份，加入已知浓度的对照品溶液及甲醇溶液共40mL，照(3)项下方法制备加样回收供试品溶液，进样测定，计算各成分的加样回收率及RSD％，考察加样回收率，结果见表4。

表4 3种活性成分精密度、重复性、稳定性、(加样)回收率考察结果

(11)将(3)项下方法制备的芦根、麦冬、水果、五汁饮缺芦根、五汁饮缺麦冬、五汁饮缺水果、五汁饮全方干浸膏粉供试品进样测定，计算各成分含量，考察专属性结果，见表5。

表5UPLC-MS/MS测定五汁饮中3种活性成分含量结果

表5注：原料指制备干浸膏粉所需的鲜雪梨、鲜菜藕、鲜荸荠、鲜芦根、麦冬。

(12)供试品提取溶剂的考察

本研究考察了采用水、甲醇、乙醇作为提取溶剂对五汁饮干浸膏粉中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分的提取效果，结果表明当提取溶剂为甲醇时，3种成分提取率之和最高，故选择甲醇作为提取溶剂。

(13)供试品提取方式的考察

参考《中国药典》2020版一部对中药材中的成分进行含量测定的供试品制备方式通常采用超声、回流等提取方式，本研究考察了甲醇超声(250W，50K Hz，60min)及回流(80℃，120min)的方法对五汁饮干浸膏粉中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分的甲醇提取效果，结果表明超声法与回流法的提取率差别无统计学意义(P＜0.05)，因超声法所需时间更少、操作更简单，故选超声法。

(14)供试品提取料液比的优化

本研究考察了五汁饮干浸膏粉取样量为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g时，加入50ml甲醇对五汁饮干浸膏粉中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分的提取效果，结果表明当取样为0.5、1.0、1.5时，重复性考察结果的RSD％过大，而取样量为2.0时，重复性考察结果的RSD％符合定量分析相关规定，当取样量为2.5、3.0时，3种成分的提取率比取样量为2.0时的低，差别有显著性意义(P＜0.05)，故优选的料液比为：取样量2.0g，加50ml甲醇提取。

(15)固定相的考察

本研究考察了WATERS公司的ACQUITY UPLC@BEH C18型色谱柱(1.7um，2.1×100mmColumn)、广州菲罗门科学仪器有限公司的Luna-Omega 1.6um C18型色谱柱(100A，LCColumn 100×2.1mm)、大连依利特分析仪器有限公司的SinoChrom ODS2型色谱柱(1.8um，2.1*100mm)对3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分的分离效果，发现3种色谱柱所分离的色谱峰形尖细，分离度皆>2.0，测定结果差别无统计学意义，故该方法可以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂来进行分析检测。

(16)流动相加酸的考察

本研究中以甲醇为流动相(A)，以纯水为流动相(B)，考察了流动相(B)在不加甲酸、加入0.1％、0.2％甲酸条件下对3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分色谱峰的分离效果，发现流动相(B)在加入0.1％、0.2％甲酸后，色谱柱所分离的色谱峰形更尖细，分离度皆>2.0，故该方法选择以0.1％甲酸水溶液作为流动相(B)来进行分析检测。

(17)分析进样体积的考察

本研究中考察了进样体积为1、2、5、10μL时3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分色谱峰的分离效果，发现进样体积超过2μL时，3-O-对香豆酰奎宁酸等成分的色谱峰拖尾，进样体积超过5μL时，3-O-对香豆酰奎宁酸等成分的色谱峰开裂，故该方法选择以1μL的进样体积来进行分析检测。

(18)质谱MRM条件的优化

本研究对3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B等3种成分的UPLC-MS/MS的MRM质谱测定条件进行了优化，结果表明3-O-对香豆酰奎宁酸在母离子为338.0(m/z)、子离子为191.0(m/z)、去蔟电压为-20e V、碰撞电压为-20e V的条件下信号响应值最高，DL-丁香树脂酚在母离子为417.3(m/z)、子离子为180.9(m/z)、去蔟电压为-86eV、碰撞电压为-26e V的条件下信号响应值最高，甲基麦冬黄烷酮B在母离子为328.1(m/z)、子离子为207.0(m/z)、去蔟电压为-103e V、碰撞电压为-32.7e V的条件下信号响应值最高，故该方法选择以上UPLC-MS/MS的MRM条件来进行分析测量。

本发明提供一种UPLC-MS/MS法测定五汁饮干浸膏粉中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B的3种成分含量的分析方法。3-O-对香豆酰奎宁酸、甲基麦冬黄烷酮B在缺麦冬的阴性对照样品中含量占全方样品的0.018％、2.710％，DL-丁香树脂酚在缺芦根的阴性对照样品中含量占全方样品的0.171％，说明HPLC-MS/MS测定五汁饮干浸膏粉中3-O-对香豆酰奎宁酸、DL-丁香树脂酚、甲基麦冬黄烷酮B成分含量的分析方法专属性好。由表4结果可知，该分析方法精密度、重复性、48小时内稳定性、加样回收率皆符合定量分析相关规定。

本发明的分析方法科学、合理、稳定、可行，过程简单，其中3-O-对香豆酰奎宁酸具有治疗急性酒精性肝损伤功能的活性(经大鼠实验证明)，是五汁饮含量测定有效成分，该分析方法符合保健食品申报有关规定，可为五汁饮保健食品、新药开发提供实验依据，具有很强的实用工业开发价值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。