一种柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

随着生物技术的快速发展，生物药物有望在疾病的临床治疗中得到很好的应用。目前，生物药物包括多肽、重组蛋白、抗体、治疗性基因等。随着COVID-19的爆发，基因治疗受到了极大的关注。基因治疗是一种将外源治疗性基因递送至靶细胞的策略，并为彻底治愈疾病提供了可能性。治疗性基因主要包括DNA、信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)。DNA和mRNA可用于恢复内源性蛋白质水平，从而治疗由基因缺失引发的疾病，此外它们还能产生免疫原性抗原，从而应用于新型疫苗的开发。在基因抑制疗法中，siRNA可以产生基因沉默作用，从而抑制靶蛋白的产生，最终治疗由基因过度表达引发的疾病。

吸入治疗可以实现肺部病灶的高局部浓度和较低的全身药物暴露量。可吸入疫苗不仅能诱导高效的体液免疫，还能诱导独特的粘膜免疫。因此将治疗性基因通过吸入方式直接递送至肺部病灶具有很大的潜力。然而DNA、mRNA、siRNA不稳定，极易被核酸酶降解。因此基因药物的肺部递送需要开发特定的载体，在保护裸基因的同时获得适宜的吸入特性。目前，非病毒载体受到了广泛的关注，其免疫原性较低，易于设计和合成。然而，非病毒载体存在组织靶向性差等问题。肺部递送可以有效解决肺部靶向的难题，但吸入的药物和载体需要穿透呼吸道粘液层并避免被肺泡巨噬细胞摄取。随着纳米技术的快速发展，纳米载体已成为非病毒载体的研究热点，其中阳离子脂质体具有高基因负载能力和高体外转染效率，被广泛应用于基因药物的递送。但是阳离子脂质体的高表面正电性导致了严重的细胞毒性，并且其在肺部微环境中不稳定，从而使阳离子脂质体不利于基因的肺部递送。

鉴于此，目前需要开发安全性更高的基因药物递送系统，并解决基因药物肺部递送中的各种难题，最终将DNA、mRNA、siRNA应用于肺部疾病的治疗。

发明内容

本发明提供一种柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒及其制备方法和应用，以解决基因药物肺部递送不稳定及阳离子脂质体毒性和克服肺部递送屏障的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒，由刚性外壳和阳离子脂质体内核组成；所述阳离子脂质体内核载DNA、mRNA或siRNA。

上述技术方案中，进一步地，所述阳离子脂质体与刚性外壳的质量比为5:1-1:5。

上述技术方案中，进一步地，所述刚性外壳的成壳材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、胆固醇、甘油酯中的一种或几种。

上述技术方案中，进一步地，所述刚性外壳的厚度为1-30nm；优选地，刚性外壳的厚度为5-25nm。

上述技术方案中，进一步地，所述制备方法包括以下步骤：

(1)制备阳离子脂质体；

(2)阳离子脂质体与DNA、mRNA、siRNA，孵育，得到载DNA、mRNA、siRNA阳离子脂质体；

(3)将刚性外壳的成壳材料溶于有机溶剂作为有机相，将载DNA、mRNA、siRNA阳离子脂质体的混悬液作为水相，有机相和水相以微流控技术，制备得到柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒。

上述技术方案中，进一步地，所述步骤(3)中微流控的总流速为0.5-25mL/min，水相和有机相的流速比为1:1-8:1。

上述技术方案中，进一步地，所述步骤(3)中有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或多种。

上述技术方案中，进一步地，所述步骤(1)中，阳离子脂质体的脂质材料包括阳离子脂质和中性辅助脂质，阳离子脂质选自(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、二油酰丙基氯化三甲铵(DOTMA)、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷(DODMA)、3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)中的一种或多种；所述中性辅助脂质选自二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)中的一种或多种。

上述技术方案中，进一步地，所述步骤(1)中以微流控混合技术制备，微流控的总流速的范围为0.5-25mL/min，水相流速与有机相流速的比例范围为1:1-6:1。

本发明还提供了前述柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒在制备基因药物肺部递送载体中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过在阳离子脂质体外面包裹刚性壳材料形成核-壳结构纳米粒，壳层掩盖了阳离子脂质体表面的高正电荷，提高了阳离子脂质体的生物安全性，并且具有高转染效率。

本发明的柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒提高了阳离子脂质体在肺部粘液和肺部微环境中的稳定性，通过调控壳层厚度，提高阳离子脂质体的肺部粘液渗透性，适合用于肺部的基因药物递送。

附图说明

图1为实施例1、2、3中，核-壳结构纳米粒的透射电子显微镜图像。

图2为实施例2中，核-壳结构纳米粒的扫描透射电子显微镜明场和暗场图像。

图3为实施例1、2、3中，载siRNA的阳离子脂质体和载siRNA的核-壳结构纳米粒的杨氏模量(n＝5)。

图4为实施例1、2、3中，载siRNA的阳离子脂质体和载siRNA的核-壳结构纳米粒的粘液稳定性(n＝3)。

图5为实施例1、2、3中，载siRNA的阳离子脂质体和载siRNA的核-壳结构纳米粒的粘液渗透性(n＝3)。

图6为实施例1、2、3中，载siRNA的阳离子脂质体和载siRNA的核-壳结构混合纳米粒在大鼠支气管肺泡灌洗液中的稳定性(n＝3)。

图7为实施例1、2、3中，载siRNA的Lipofectamine 2000、载siRNA的阳离子脂质体、载siRNA核-壳结构混合纳米粒在A549细胞中的基因沉默(n＝3)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，但不限于本文所描述的实施方式。提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1

本实施例提供了一种具有柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒(简称为HNPs)，具体方法如下：

(1)阳离子脂质体以现有常规方法均可制备得到，本实施例中采用微流控技术制备；将DOTAP和DOPE以1:3的重量比充分溶解于乙醇，配制成脂质溶液作为有机相。室温条件下，在人字形微流控芯片中，固定总流速为6mL/min、水相和有机相的流速比为5:1，使用生理盐水快速稀释有机相，使脂质在析出的同时自组装形成空白阳离子脂质体(简称为CL)。

(2)将空白阳离子脂质体与siRNA以6:1的氮/磷比(DOTAP中的质子化氮与siRNA中磷酸基团的摩尔比)充分混合，室温孵育30min，得到载siRNA的脂质体(简称为Lpx)。

(3)将PLGA充分溶解于丙酮作为有机相。将载siRNA的脂质体混悬液作为水相。在所有脂质(包括DOTAP和DOPE)与PLGA的重量比为1:1的条件下，在人字形微流控芯片中，通入水相和有机相，固定总流速为6.25mL/min、水相和有机相的流速比为4:1，使用水相快速稀释有机相，使带负电PLGA在析出的同时吸附于带正电Lpx的表面以形成PLGA外壳，从而制备核-壳结构纳米粒。将制得的核-壳结构纳米粒的混悬液用透析袋(Mw 8000-14,000Da)在1000倍体积的去离子水中透析1h，除去丙酮，得到HNP1。

实施例2

按照实施例1相同的方法，区别在于，所有脂质(包括DOTAP和DOPE)与PLGA的重量比为1:2，制得核-壳结构纳米粒，简称为HNP2。

实施例3

按照实施例1相同的方法，区别在于，所有脂质(包括DOTAP和DOPE)PLGA的重量比为1:3，制得核-壳结构纳米粒，简称为HNP3。

实施例4

按照实施例1相同的方法，区别在于，步骤(3)中固定水相和有机相的流速比为9:1，制备中无法实现完全包覆，两相混合后得到脂质体和PLGA的沉淀，没有得到核-壳结构纳米粒。

实施例5

按照实施例1相同的方法，区别在于，步骤(3)中成壳材料选择PCL。将PCL充分溶解于丙酮作为有机相。将载siRNA的脂质体混悬液作为水相。在所有脂质(包括DOTAP和DOPE)与PCL的重量比为1:1的条件下，在人字形微流控芯片中，通入水相和有机相，固定总流速为6.7mL/min、水相和有机相的流速比为3:1，使用水相快速稀释有机相，使带负电PCL在析出的同时吸附于带正电Lpx的表面以形成PCL外壳，从而制备核-壳结构纳米粒。将制得的核-壳结构纳米粒的混悬液用透析袋(Mw 8000-14,000Da)在1000倍体积的去离子水中透析1h，除去丙酮，制得核-壳结构纳米粒，简称为HNP4。

实施例6

按照实施例5相同的方法，区别在于，所有脂质(包括DOTAP和DOPE)与PCL的重量比为1:2，制得核-壳结构纳米粒，简称为HNP5。

实施例7

按照实施例5相同的方法，区别在于，所有脂质(包括DOTAP和DOPE)与PCL的重量比为1:3，制得核-壳结构纳米粒，简称为HNP6。

实施例8

按照实施例1相同的方法，区别在于，步骤(3)中成壳材料选择胆固醇。将胆固醇充分溶解于乙醇作为有机相。将载siRNA的脂质体混悬液作为水相。在所有脂质(包括DOTAP和DOPE)与胆固醇的重量比为1:1的条件下，在人字形微流控芯片中，通入水相和有机相，固定总流速为5.85mL/min、水相和有机相的流速比为6:1，使用水相快速稀释有机相，使胆固醇在析出的同时包裹于Lpx的表面以形成胆固醇外壳，从而制备核-壳结构纳米粒。将制得的核-壳结构纳米粒的混悬液用透析袋(Mw 8000-14,000Da)在1000倍体积的去离子水中透析1h，除去乙醇，制得核-壳结构纳米粒Chol-NP。

实施例9

按照实施例1相同的方法，区别在于，步骤(3)中成壳材料选择甘油酯。将单辛酸甘油酯充分溶解于乙醇作为有机相。将载siRNA的脂质体混悬液作为水相。在所有脂质(包括DOTAP和DOPE)与单辛酸甘油酯的重量比为1:1的条件下，在人字形微流控芯片中，通入水相和有机相，固定总流速为5.85mL/min、水相和有机相的流速比为6:1，使用水相快速稀释有机相，使单辛酸甘油酯在析出的同时包裹于Lpx的表面以形成单辛酸甘油酯外壳，从而制备核-壳结构纳米粒。将制得的核-壳结构纳米粒的混悬液用透析袋(Mw 8000-14,000Da)在1000倍体积的去离子水中透析1h，除去乙醇，制得核-壳结构纳米粒Mono-NP。

效果验证实验

实验例1：柔韧性可调控的核-壳结构纳米粒的表征

对所制备的纳米粒进行表征，包括使用透射电子显微镜和扫描透射电子显微镜观察纳米粒的形貌、使用原子力显微镜测量纳米粒的刚性。

1.透射电子显微镜(TEM)观察HNPs的形貌：

将合适浓度的HNP1、HNP2、HNP3混悬液(10μL)滴到含碳的铜网上，加入3％醋酸双氧铀，并在室温下干燥。使用透射电子显微镜(TEM)在100kV的加速电压下观察三种HNPs的形态。如图1所示，HNP1、HNP2、HNP3均呈现核-壳结构，并且观察到HNP3的外壳厚度显著增加，HNP1、HNP2、HNP3的外壳平均厚度分别为5.48nm、7.92nm、22.90nm。

2.扫描透射电子显微镜(STEM)观察HNP2的形貌：

将合适浓度的HNP2混悬液(10μL)滴到含碳的铜网上，加入3％醋酸双氧铀，并在室温下干燥。在铜网上选择一个粒径较大的HNP2，并使用扫描透射电子显微镜(STEM)在300kV的加速电压下观察HNP2的结构。如图2所示，HNP2呈现核-壳结构。

3.原子力显微镜确证HNPs柔韧性的可调控：

通过原子力显微镜测量Lpx、HNP1、HNP2、HNP3的杨氏模量，以此表征它们的刚性。将Lpx、HNP1、HNP2、HNP3的混悬液(20μL)分别滴到云母片上，并在室温下风干。以1Hz的扫描速率对样品进行成像，并分析每个纳米颗粒的杨氏模量。如图3所示，HNP1、HNP2和HNP3的杨氏模量分别是Lpx的2.26、2.70和3.05倍，表明PLGA外壳增加了Lpx的刚性，并且PLGA外壳越厚，HNPs的刚性越强。

实验例2：粘液稳定性研究

Lpx、HNP1、HNP2、HNP3与粘蛋白共孵育后粒径的变化用于评估粘液稳定性。具体如下：将粘蛋白2型(来自猪胃)粉末分散在水中(0.08％ W/V)并搅拌过夜。将分散液离心，随后收集含粘蛋白的上清液。将300μL Lpx、HNP1、HNP2、HNP3分别与1mL饱和粘蛋白溶液孵育1、3和6h，然后使用动态光散射法测量它们的粒径。如图4所示，在与粘液接触后，Lpx的粒径显著增加。相反，在与粘液孵育的6h内，三种HNPs的粒径没有观察到显著变化，表明HNPs在黏液中具有良好的稳定性。

实验例3：粘液渗透性研究

使用基于Transwell的人工粘液渗透模型来研究Lpx、HNP1、HNP2、HNP3的粘液渗透性。具体过程如下：用酶标仪测量Cy3 siRNA的荧光强度，激发波长(Ex)为550nm，发射波长(Em)为570nm。绘制Cy3 siRNA含量与荧光强度之间相关性的标准曲线(R

实验例4：支气管肺泡灌洗液(BALF)稳定性研究

通过颈椎脱臼处死Sprague-Dawley(SD)大鼠，通过手术分离大鼠颈部气管，用PBS缓冲液灌注大鼠肺部，获得BALF。将300μL CL、Lpx、HNP1、HNP2、HNP3分别与1mL BALF，并将物于37℃孵育1、2和3h。通过动态光散射法检测粒径和多分散指数(PDI)。如图6A所示，CL和Lpx在与BALF接触后粒径立即增大。在2h时，动态光散射法不能检测到CL和Lpx，这表明CL和Lpx在BALF中不稳定。如图6B所示，在与BALF后的2h内，HNP1、HNP2、HNP3的粒径均没有显著变化，这表明HNPs在BALF中具有良好的稳定性。

实验例5：体外基因沉默研究

将A549细胞以每孔3.5×10

如图7所示，阳性对照是载有GL3 siRNA的Lipo2000和Lpx，而阴性对照是载有乱序siRNA的Lipo2000。与空白对照和阴性对照组相比，Lipo2000、Lpx、HNP1、HNP2、HNP3都能够有效地产生基因沉默。在三种HNPs中，HNP1产生的基因沉默最为显著，这表明HNP1可以高效转染A549细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其它实施例的排除，而可用于各种其它组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。