猪精液冷冻保存添加剂及冷冻保存剂

技术领域

本发明属于猪精液冷冻保存技术领域，尤其涉及一种猪精液冷冻保存剂及应用方法。

背景技术

蛋白质组学在宏观角度认识精子蛋白质的组成、分布和基于表型分析挖掘精子冷冻耐受能力的关键因素。精子生物功能的发挥和调控主要通过蛋白质的翻译后修饰实现。精子从睾丸射出之后，蛋白质的合成能力基本丧失，蛋白质组学将阐明不同个体公猪精液对冷冻耐受性的差异。

猪冷冻精液技术是指从公猪体内采集到的原精经过特殊处理之后，保存在-196℃的液氮中，抑制精子的生理代谢活动，从而达到长期储存的目的。在非洲猪瘟肆虐情况下，冷冻精液有着便于储存、运输、扩大优质种畜使用范围等优点。

但精子在降温过程中会受到冷冻损害，导致精子的品质不高，受胎率低等效果。现有的技术中对于提高猪精液冷冻保存后精子质量往往采用控制冷藏、冷冻条件、添加抗冷冻保存剂或二者相结合的方式。在抗冷冻保存剂的研究中，除了常规的甘油、氨基酸、糖类、缓冲剂等，多是对猪精子具有额外保护作用的添加剂的研究，但大多数能产生较佳有益效果的添加剂，往往产量较小或价格昂贵，或者需要一定的制取过程。在应用于猪精液保存上性价比并不高，实用性欠缺。

故提供一种容易获取、价格低廉、能产生优异保护作用的猪精液冷冻添加剂，以减少精子在冷冻过程中受到的理化损伤、提高冷冻后精子活性是非常有必要的。

发明内容

针对现有技术中对猪精子具有额外保护作用的添加剂应用于猪精液保存上性价比不高的技术问题，本发明提供一种猪精液冷冻保存剂及应用方法。

本发明提供的技术方案如下：一种猪精液冷冻保存剂，包括α-淀粉酶，所述α-淀粉酶的含量为10-1000μg/L。

进一步地，所述猪精液冷冻保存剂包括冷藏液和冷冻液；所述冷藏液包括：灭菌蒸馏水、乳糖、卵黄、脯氨酸、α-淀粉酶；所述冷冻液包括：冷藏液(不含α-淀粉酶)、甘油、Equex.STM抗冻剂、脯氨酸、α-淀粉酶。

进一步地，所述冷藏液中除α-淀粉酶各组分质量比为：160:17-18:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。

进一步地，所述冷冻液中除α-淀粉酶各组分质量比为：92.5:5-7:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。

优选的，α-淀粉酶添加量为1000μg/ml。

进一步地，所述冷藏液的制备过程如下：按比例称取相应质量的乳糖加入灭菌蒸馏水中，加入卵黄，充分混匀后，以2800转/min离心30min；取上清液，在其中加入脯氨酸，再添加α-淀粉酶。

本发明还提供上述猪精液冷冻保存剂的应用方法，包括如下步骤：

S1、将完成采集、预处理后的公猪精液加入离心瓶中，对猪精液进行离心处理，离心后去除上清液；

S2、在去除上清液后的猪精子中加入冷藏液，使精子重新悬浮后放入4℃冰箱中，静置3～4h；

S3、在冷藏静置后的精液中加入冷冻液，使之达到有效目标精子浓度后充分混匀；在4℃环境中，通过灌装机将精液吸入细管中，后将装有精液的细管批量均匀平铺在冷冻架中，放在液氮液面上预冷；随后放入液氮中冷冻。

进一步地，步骤S1中还包括：记录离心瓶质量为M

步骤S2中加入冷藏液的体积V

步骤S3中加入冷冻液的体积V

进一步地，步骤S1中公猪精液采集、预处理过程包括：

S11、采集精液：猪精液的采集选取射精中段的精液75～125mL；

S12、原精液检测：原精呈为灰白色或乳白色，使用显微镜检测采集鲜精液的活力密度，选取精子活力≥90％，精子密度≥2亿/mL的猪精液；

S13、精液预稀释：对采集后公猪精液加入1～2倍体积BTS稀释剂，在等温32～35℃下，缓慢加入原精中，轻轻摇匀；稀释完毕后，用棉花包裹放置于17℃的恒温箱中。

进一步地，猪精液冷冻保存剂的应用方法还包括步骤S4精液解冻：将冷冻后的细管在50℃解冻16s，剪去细管两端，将精液移入在30℃预热的离心管中孵育1min。

本发明的优势在于：本发明的冷冻保存剂整体组分简洁、成本低廉，整体性价比较高；由于α-淀粉酶的在冷冻保存剂中的加入，能对猪冷冻精液的保存质量有显著提高；有效的提高猪冷冻精液活力、顶体完整性、DNA完整性、线粒体活性多项理化性质。

附图说明

图1为本发明的实验公猪精液活力分类示意图；

图2为各实验组和对照组解冻后精子活性对比图；

图3为各实验组和对照组解冻后精子孵育活力对比图；

图4为各实验组和对照组解冻后精子顶体完整性显微荧光图；

图5为各实验组和对照组解冻后精子顶体完整性对比图；

图6为各实验组和对照组解冻后精子DNA完整性显微荧光图；

图7为各实验组和对照组解冻后精子DNA完整性对比图；

图8为各实验组和对照组解冻后精子线粒体活性显微荧光图；

图9为各实验组和对照组解冻后精子线粒体活性对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明经过GO富集分析发现α-淀粉酶在冷冻精液抗性中高表达，并据此展开研究，设计出一种组分简洁、成本低廉、并能对猪冷冻精液的保存质量有显著提高的冷冻保存剂。

本发明的实验设计先对猪精液采用常规方式冷冻处理，再解冻后测量猪精液活力，相同种实验公猪在采集鲜精时，精液活力无显著差异，但在解冻后存在显著差异。以此选出精液活力高和精液活力低的共12头公猪作为蛋白组分析实验对象，其中大白公猪活力高(YT)的3头，活力低(YS)的3头；长白公猪活力高(LT)的3头，活力低(LS)的3头；以此来代表人工饲养公猪的平均精液质量水平；分类结果如图1所示。

通过对各头实验猪精液的蛋白质组学分析，GO富集分析中显示猪精液中α-淀粉酶在耐冷冻猪精子中的表达量高于不耐冷冻的猪精子。由此本发明设计出含α-淀粉酶成分的冷冻保存剂，并继续设计实验其对猪精液活性提升的具体效果。由于α-淀粉酶容易获得，价格相对低廉，易保存；也能保证以此为主要成分的冷冻保存剂整体性价比较高。

本发明采用的含α-淀粉酶的冷冻保存剂，包括：冷藏液和冷冻液。

冷藏液包括：灭菌蒸馏水、乳糖、卵黄、脯氨酸、α-淀粉酶。除α-淀粉酶外各组分质量比为160:17-18:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。糖用于维持渗透压、提供能量；脯氨酸用于稳定细胞结构、清除活性氧(ROS)；卵黄作为缓冲物质，能使精子适应渗透压变化较大的稀释液。冷藏液用于猪精液在冷冻前的冷藏处理阶段，用以防止猪精液降温过快产生的冷休克死亡。

冷藏液的制备过程如下：按比例称取相应质量的乳糖加入灭菌蒸馏水中，加入卵黄，充分混匀后，以2800转/min离心30min；取上清液，在其中加入脯氨酸，再根据需要添加α-淀粉酶。

冷冻液包括：冷藏液(不含α-淀粉酶)、甘油、Equex.STM抗冻剂、脯氨酸、α-淀粉酶。除α-淀粉酶外各组分质量比为92.5:5-7:29-39:0.225-0.235；α-淀粉酶添加量为10～1000μg/ml。甘油为渗透性保护剂，Equex.STM抗冻剂为非渗透性保护剂，两者共同作用以保护猪精液的细胞膜。

对实验公猪采集鲜精及预处理过程如下：

S1、采集精液

猪精液的采集主要采用手握法，在采集过程中，采集人员应确保自身和操作环境的卫生消毒。从种公猪的射精中收集新鲜精液时，要选取射精中段的精液，通常约为75～125mL。前后两段的射精应予以舍弃，因为这些部分的精液可能含有较高的细菌或杂质。

S2、原精液检测

原精外观为灰白色或乳白色，在现场使用显微镜检测采集鲜精液的活力密度，选取精子活力≥90％，精子密度≥2亿/mL。

S3、精液预稀释

对采集后的原精进行等温稀释。公猪精液按1～2倍体积加入BTS稀释剂，在等温(32～35℃)下，缓慢加入原精中，轻轻摇匀；稀释完毕后，用棉花包裹放置于17℃的恒温箱中。该步骤用于补充精子需要的相关营养，减少精子成团，缓冲运输中的震荡，有效维持精子活力。

本发明的冷冻保存剂使用步骤如下：

S4、精液离心

将预处理后的猪精液加入离心瓶中，对猪精液进行离心处理。记录离心瓶质量为M

由于精液中的胶状物或原生质滴等易引起精子凝集成团，降低精子活力；因此需要通过离心来调整精子密度，去除杂质等。

在离心机17℃下，以800转/min速度离心15min，高压灭菌针头抽取弃上清，弃上清后称取离心瓶和精子总重为M

S5、精液冷藏

在离心后的猪精子中加入冷藏I液，使精子重新悬浮后放入4℃冰箱中，静置3～4h(精子在0～5℃时，呈现休眠状态，降温过快极易产生冷休克死亡)。

加入冷藏液的体积V

S6、精液灌装冷冻

在冷藏静置后的精液中加入冷冻液，使之达到有效目标精子数并充分混匀；在4℃环境中，通过灌装机将精液吸入0.5mL细管中，后将装有精液的细管批量均匀平铺在冷冻架中，放在距液氮液面3cm上预冷8min；随后放入液氮中冷冻。

加入冷冻液的体积V

S7、精液解冻

在精液细管冷冻24h后，每个实验组别中至少取两支细管解冻进行检测，细管在50℃解冻16s，剪去细管两端，将精液移入在30℃预热的离心管中孵育1min。

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。

另选7头实验公猪，按照上述公猪采集鲜精及预处理、冷冻保存剂使用步骤分别采集7头实验公猪的精液进行冷冻，解冻后验证效果实验。

具体的，将全部7头实验公猪采集后的精液混合后，再平均分为5组，其中4组实验组，1组为对照组。

实验组：冷藏液和冷冻液中α-淀粉酶的浓度分别为10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL、10000μg/mL，每个组别同一浓度设置3个样本，对测量结果取平均值。

对照组：冷藏液和冷冻液中均不含α-淀粉酶，设置3个样本，对测量结果取平均值。

实施例1

精子活性检测：

将各组别精液按上述方法解冻完成后，滴在载玻片上，每次随机8个视野进行检测，取8次视野的平均值。测试结果如图2所示。可以看出添加有α-淀粉酶的冷冻保存剂相比于未添加α-淀粉酶的冷冻保存剂对于公猪的精子活性提升效果明显。即使添加最低10μg/mL的α-淀粉酶的冷冻保存剂的组也相比于未添加α-淀粉酶的冷冻保存剂的组，对公猪的精子活性提升效果也达10％；仅从精子活性提升效果看，1000μg/mL最佳。

实施例2

精子孵育活力检测：

将各组别解冻后的精液孵育在30℃水浴锅中，每隔30分钟检测一次活力，持续60分钟。测试结果如图3所示，可以发现精子孵育活力随着孵育时间的延长而降低，而实验组活力均高于对照组。在实验组中，添加了1000ug/ml的α-淀粉酶的精子活力在前50min均高于其他实验组。

实施例3

精子顶体完整性检测：

①、取解冻后的精液在800g离心5min，去除上清液后加入1.5mL 4％甲醛固定30min，固定结束后，800g离心2min，弃上清。用PBS吹打后，以800转/min速度离心2min，并重新悬浮在1mL PBS中，得精子细胞PBS悬液。

②、精子细胞PBS悬液取20uL均匀涂抹在载玻片表面，自然风干。取20μL FITC-PNA工作液(10μg/mL)，均匀滴加在样品上，37℃避光孵育30min。再滴加30uL Hoechst 33342染液(10μg/mL)，室温染色5-10min(整个过程避光操作)。染色结束后用双蒸水缓慢冲洗玻片，洗去多余染料，自然风干，迅速在荧光显微镜下拍照。选择3个以上清晰视野，每个视野保证精子数达到200个以上观察记录。如图4、5所示，为各组别顶体完整性荧光效果图，可以发现除了α-淀粉酶添加浓度最高的10000μg/mL的组别，对于公猪的精子顶替完整性有反作用，其余添加有α-淀粉酶的冷冻保存剂均对于公猪的精子顶替完整性均有一定提升效果。

实施例4

DNA完整性检测：

按照实施例2第①步制取精子细胞PBS悬液，取精子细胞PBS悬液300μL，加入4.5μLAcridine Orange Stain(15μg/ml)，室温避光染色15～20min，滴加于载玻片上并加盖玻片，在荧光显微镜下拍照检测。如图6、7所示，添加有α-淀粉酶的冷冻保存剂的组别相比于未添加α-淀粉酶的冷冻保存剂的组别对于公猪的DNA完整性提升效果明显。

实施例5

线粒体活性检测：

取解冻后的精液50μL置于于0.5mL细胞培养液中，加入0.5mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，置于培养箱中37℃孵育20分钟；孵育结束后，用JC-1染色缓冲液清洗两次(加入1mL JC-1染色缓冲液以600转/min在4℃离心3-4min，弃上清)，加入300μL JC-1染色缓冲液重悬细胞；取10μL重悬细胞液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下拍照检测。如图8、9所示，添加有α-淀粉酶的冷冻保存剂的组别相比于未添加α-淀粉酶的冷冻保存剂的组别对于公猪的线粒体活性提升效果明显；且随着α-淀粉酶浓度的增加而增加。

综上，冷冻保存剂中α-淀粉酶的添加对于猪冷冻精液活力、顶体完整性、DNA完整性、线粒体活性均有较为显著的提高，提升效果与α-淀粉酶的浓度有密切关系，尤其α-淀粉酶浓度过高时，对于猪精子的顶体完整性呈现明显的反作用；发挥α-淀粉酶较佳效用的浓度范围较宽，在10～1000μg/ml。优选α-淀粉酶的添加浓度为1000μg/mL。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。