一种烟叶中多种脂溶性成分同时分析的方法

技术领域

本发明属于烟草化学成分技术领域，具体涉及一种烟叶中多种脂溶性成分同时分析的方法。

背景技术

烟草中含有许多的脂溶性成分，如β-胡萝卜素、脂溶性维生素、甾醇、类西柏烷、赖百当类、糖酯、甘油酯等，其与烟草的品质及功能息息相关，烟草中重要脂溶性成分的准确测定对烟草品质评价具有重要的意义。

烟草中的脂溶性成分普遍存在分子量大、挥发性差、易氧化分解等特性，常用的检测方法有液相色谱、液相色谱-质谱联用、超临界流体色谱法等。然而，液相色谱法或液相色谱-质谱联用法对脂溶性成分的同分异构体的分离较为困难，需使用大量的丙酮、二氯甲烷、氯仿等危害较大的有机溶剂，且分析时间较长。超临界流体色谱法是以超临界流体CO2为流动相主体，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析。理论上，超临界流体色谱不仅可分析气相色谱不适应的高沸点、低挥发、热不稳定的样品，还能够对结构类似物、脂溶性化合物以及热不稳定化合物等多种物质提供合适的保留和分离。相较液相色谱，超临界流体色谱在分析脂溶性成分时不仅可以简化前处理过程，还可以减少有机溶剂的使用。目前，超临界流体色谱法已被广泛应用于食品中类胡萝卜素、甘油三酯、类固醇、脂溶性维生素等检测，但通常只检测某一类化合物，检测效率较低，且对于烟草中的西柏烷类化合物暂未见有相关分析报道。因此，利用超临界流体色谱技术同时分析烟草中的多种脂溶性成分，有助于进一步明确烟草品质关键物质成分，为烟草品质改善提升及综合利用提供重要支撑依据。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种烟叶中多种脂溶性成分同时分析的方法，用于解决现有技术中有机溶剂使用量大，分析成本较高，前处理过程繁琐，检测效率不高的缺陷，本发明可以实现烟叶中13种脂溶性成分的同时分析。

为实现上述目的及相关目的，本发明提供一种烟叶中多种脂溶性成分同时分析的方法，包括以下步骤：

1)将待测烟叶干燥、研磨后，加入萃取剂和内标，获得待测样品溶液；

2)采用超临界流体色谱系统对样品中的进行分析，采用多波长进行检测，通过内标法进行分析。

优选地，11)步骤1)中，所述待测烟叶为烤后烟叶或鲜烟叶；

优选地，12)步骤1)中，所述萃取剂选自氯仿、丙酮、二氯甲烷、异丙醇、二氯甲烷/乙醇(1：1，V:V)和二氯甲烷/乙醇(2：1,V:V)中的一种或者多种；

优选地，13)步骤1)中，所述内标选自β-apo-8’-胡萝卜醛；

优选地，14)步骤1)中，所述待测烟叶与萃取剂的料液比为(1g:5mL)-(1g:30mL)；

优选地，特征12)中，所述萃取剂选自二氯甲烷/乙醇(体积比V:V为1:1至5:1)，优选地，所述萃取剂选自二氯甲烷/乙醇(2：1,V:V)。

优选地，特征13)中，所述内标的浓度为5-60μg/mL。

优选地，特征14)中，所述待测烟叶与萃取剂的料液比为1g:20mL。

优选地，步骤1)中，加入所述萃取剂量和内标后，还包括涡旋、震荡。

优选地，A1)所述震荡的时间为5-40min；优选地，所述震荡的时间为10min；

优选地，A2)所述震荡后还包括将萃取的上清液用滤膜过滤。

优选地，特征A2)中，所述滤膜孔径为0.2-0.4μm。

优选地，步骤2)中，所述脂溶性成分选自α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、玉米黄质、新黄质、维生素E、α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、麦角甾醇、莨菪亭、茄尼醇中的一种或多种。

优选地，步骤2)中，所述超临界流体色谱系统包括以下技术特征中的至少一项：

21)色谱柱固定相为1-氨基蒽、高密度二醇、二乙胺、2-氨甲基吡啶、C18；优选地，为C18；

22)流动A相为CO

22)B相为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和甲醇/乙腈中的一种或者多种；优选地，为甲醇/乙腈；

23)色谱条件为：

柱温：30-55℃；

检测波长：180-240、250-310、300-360和430 -470中的一种或者多种；210、280、330和430nm中的一种或者多种；本发明测定时，同一时间段，同时采集多个波长。

进样量：0.5-3μL；

流速：0.5-2mL/min；动态背压：1800-2200psi；

梯度洗脱条件：0-3.5min，0-3％B；9-12min，5-10％B；15-18min，15-20％B；19-23min，20-30％B；23.5-27min，0-3％B。

优选地，所述内标法是指，将13种脂溶性成分中至少一种的标准品，加入溶剂和内标溶液后，配成的一系列不同浓度的标准品待测液采用超临界流体色谱系统分析，获得13种目标物中至少一种的标准品/内标的色谱峰面积比与相应浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到标准工作曲线的回归方程；再将样品待测液采用超临界流体色谱系统分析，获得13种脂溶性成分中至少一种与内标的色谱峰面积比，代入标准工作曲线的回归方程中，计算得到样品待测液中相应目标物的含量。

如上所述，本发明提供的一种烟叶中多种脂溶性成分同时分析的方法，具有以下有益效果：

本发明提供的一种烟叶中多种脂溶性成分同时分析的方法，针对烟叶脂溶性成分普遍存在的分子量大、挥发性差、易氧化分解等特性，采用超临界流体色谱分析技术进行检测，可实现烟草中13种脂溶性成分的同时定量分析，溶剂使用量少、成本低、检测效率高，可为烟叶的品质评价提供一种环境友好、更加高效便捷的高通量分析方法。

附图说明

图1为脂溶性成分标准品在430nm下的色谱图。

图2为脂溶性成分标准品在280nm下的色谱图。

图3为脂溶性成分标准品在210nm下的色谱图。

图4为实际样品在430nm下的色谱图。

图5为实际样品在280nm下的色谱图。

图6为实际样品在210nm下的色谱图。

图7为实际样品在330nm下的色谱图。

图8不同动态背压下，实际样品在210nm下的色谱图。

图9不同B相下，实际样品在210nm下的色谱图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

以下实施例中使用的试剂及实验用具均为常规使用的试剂及实验用具，均可从市场上购买获得。具体使用试剂和仪器如下：

1、试剂

α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、玉米黄质、新黄质、维生素E、α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、麦角甾醇、莨菪亭、茄尼醇、β-apo-8’-胡萝卜醛的标准品等购自百灵威公司。二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇为色谱纯，购于TEDIA公司。

2、仪器

沃特世ACQUITY UPC2系统，配有PDA检测器；电子天平(精度：0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q纯水仪(美国Millpore公司)；多管涡旋仪(美国安胜)。

实施例1

1标准溶液配制

标准储备液：精确称取各种标准物质50mg，用二氯甲烷-乙醇(2:1，V/V)溶液溶解并定容至10mL，分别配制成5mg/mL的标准储备液，充氮气后密封于零下80℃冷藏待用。

混合储备液：取目标物的标准储备液各0.5mL于10mL棕色容量瓶，用二氯甲烷-乙醇(2:1，V/V)溶液定容至10mL，配制成250μg/mL的混合储备液，充氮气后密封于零下80℃冷藏待用。

内标溶液：称取10mgβ-apo-8’-胡萝卜醛，用二氯甲烷-乙醇(2:1，V/V)溶液溶解并定容至10mL，配制成1mg/mL的内标溶液，密封待用。

标准工作溶液：分别移取一定体积的混合储备液于10mL棕色容量瓶，加入100μL内标溶液，用二氯甲烷-乙醇(2:1，V/V)溶液定容至10mL，按实际样品的目标物含量范围配制标准工作溶液，充氮气后密封于零下80℃冷藏待用。

2分析条件

色谱柱：Waters Acquity UPC

3实验结果

取配好的标准工作溶液进超临界流体色谱系统进行分析，得到的结果如图1至图3所示，可以看出，在不同的波长下，13种脂溶性成分都能得到很好的分离检出，特别是对叶绿素a和叶绿素b，叶黄素和玉米黄质，茄尼醇和西柏三烯二醇等结构性质相近，极易相互干扰的化合物，本方法都能实现有效分离。

以各标准品与内标的浓度比为横坐标，峰面积比(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归计算，得到回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表1，能够对样品中的13种脂溶性成分进行有效定量。

表1 13种脂溶性成分线性关系

实施例2

1样品前处理

鲜烟叶样品冷冻干燥后研磨，置于零下80℃超低温冰箱中保存待测。烤后烟叶直接取烟叶粉末进行检测。分析时准确称取0.5g烟叶样品，加入100μL内标溶液和9.9mL二氯甲烷-乙醇(2:1，V/V)萃取溶液，用涡旋振荡器震荡10min后，用0.2μm的PTFE滤膜过滤后，采用与实施例1相同的分析条件进行分析。

2实验结果

取制备好的烟叶萃取液进超临界流体色谱系统进行分析，得到的结果如图4至图6所示，可以看出，除麦角甾醇外(麦角甾醇则属于菌类甾醇，霉变烟叶中含有麦角甾醇)，其余12种脂溶性成分均有检出，其中，莨菪亭在280nm下响应较弱，需要采用330nm对其进行分析才可检出(图7)。

实施例3

1样品前处理

鲜烟叶样品冷冻干燥后研磨，置于零下80℃超低温冰箱中保存待测。烤后烟叶直接取烟叶粉末进行检测。分析时准确称取0.5g烟叶样品，加入100μL内标溶液和9.9mL二氯甲烷-乙醇(2:1，V/V)萃取溶液，用涡旋振荡器震荡10min后，用0.2μm的PTFE滤膜过滤后直接上样进行分析。

2分析条件

色谱柱：Waters Acquity UPC

流动相：A相为CO

梯度洗脱条件：0-3.5min，3％B；9-12min，10％B；15-18min，20％B；19-23min，30％B；23.5-27min，3％B；

流速：1.0mL/min；

进样量：2μL；

柱温：45℃；

动态背压：1800、1900、2000、2100、2200psi；

检测波长：210nm、280nm、330nm、430nm；

强洗溶剂：甲醇；

弱洗溶剂：甲醇/异丙醇(1:1，体积比)。

3实验结果

超临界流体色谱中，动态背压是影响分离过程的重要因素之一。不同动态背压下，二氧化碳超临界流体对各分析物有不同的溶解能力。当背压升高时，超临界流体的密度会增大，溶剂化能力增强，柱压升高，分析物保留时间缩短。实验考察了1800、1900、2000、2100、2200psi等不同压力条件下鲜烟叶样品中目标分析物的分离效果。如图8所示，2000psi下，10-12min之间的茄尼醇、α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的分离度较好，其它压力条件下，茄尼醇会与α-西柏三烯二醇或者β-西柏三烯二醇与其随后的杂质发生色谱峰重叠。

实施例4

1样品前处理

鲜烟叶样品冷冻干燥后研磨，置于零下80℃超低温冰箱中保存待测。烤后烟叶直接取烟叶粉末进行检测。分析时准确称取0.5g烟叶样品，加入100μL内标溶液和9.9mL二氯甲烷-乙醇(2:1，V/V)萃取溶液，用涡旋振荡器震荡10min后，用0.2μm的PTFE滤膜过滤后直接上样进行分析。

2分析条件

色谱柱：Waters Acquity UPC

3实验结果

改性剂(B相)会影响超临界流体二氧化碳的溶解能力，同时影响分析物与固定相之间的相互作用。因此，改变改性剂(B相)对于目标物的保留性和选择性有着重要的作用。实验考察了乙醇、乙腈、乙醇/乙腈(1:1)、甲醇/乙腈(1:1)、添加0.2％甲酸的甲醇/乙腈(1:1)等不同助溶剂对实际样品中目标分析物的分离效果影响。如图9所示，乙醇、乙腈、乙醇/乙腈(1:1)对茄尼醇与西柏三烯二醇的分离效果较差，而甲醇/乙腈(1:1)的分离效果较好。

本发明建立了一种烟叶中多种脂溶性成分同时分析的方法，可实现α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、玉米黄质、新黄质、维生素E、α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、麦角甾醇、莨菪亭、茄尼醇等13种脂溶性成分的同时分析。方法有机溶剂使用量少、成本低、检测效率高，可为烟叶的品质评价提供一种环境友好、更加高效便捷的高通量分析方法。

所以，本发明有效克服了现有技术中的缺点而具产业利用价值。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。