一种异功颗粒UPLC特征图谱的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药分析技术领域，尤其涉及一种异功颗粒UPLC特征图谱的构建方法及其应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

异功颗粒是由人参、茯苓、白术、陈皮、甘草、生姜、大枣7味药材组成的中药复方颗粒，主要用于小儿消化不良属脾虚气滞者，疗效确切，但其化学成分复杂，现有的质量标准难以有效控制药品的内在质量。

专利CN 114216986B(授权公告日：2023.04.07)提出了一种异功散HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC标准指纹图谱和应用，其对15批异功散的HPLC特征图谱进行合成，生成共有8个特征峰构成的203nm波长条件下异功散的HPLC标准指纹图谱。该专利的特征峰较少，同时检测时间较长，达到60min，从而难以高效、全面地在异功颗粒的生产中有效控制其内在质量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种异功颗粒UPLC特征图谱的构建方法及其应用，采用本发明建立的特征图谱用于异功颗粒的质量检测，具有良好的精密度、稳定性和重复性，可全面、有效地评价异功颗粒的质量。

第一方面，本发明提供了一种异功颗粒UPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液，采用超高效液相色谱法测定，建立异功颗粒UPLC特征图谱；

所述超高效液相色谱法检测的条件包括：

流动相包括流动相A和流动相B，以乙腈为流动相A，以0.08～0.15wt％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为199～210nm；

所述梯度洗脱程序为：

0～8min，流动相A：19wt％，流动相B：81wt％；

8～16min，流动相A：19wt％→23wt％，流动相B：81wt％→77wt％；

16～34min，流动相A：23wt％→40wt％，流动相B：77wt％→60wt％；

所述混合对照品溶液的制备方法具体为：

精密称定异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rb

优选的，所述供试品溶液的制备方法为：将异功颗粒研细，加入甲醇，超声处理，冷却后，用甲醇补足损失重量，摇匀，采用滤膜过滤获得供试品溶液。采用超声处理有利于将异功颗粒均匀分散至甲醇中，然而超声处理过程中伴随温度升高，甲醇挥发，浓度升高，导致误差较高，因此冷却后补充甲醇，降低甲醇挥发的影响，减少测量误差。

进一步的，所述超声处理的时间为20～40min；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比优选为(0.5～1.5)：(20～30)。

优选的，所述色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)，色谱柱的柱温为33～37℃。

优选的，所述混合对照品溶液的溶剂为甲醇。甲醇溶解性更好，有利于各化合物的分散，提高检测器对化合物的检测效率，有利于提高检测的稳定性。

优选的，流动相的流速为0.2～0.4mL/min，进样量为2～4μL。

优选的，所述混合对照品溶液中，异甘草苷的浓度为40～60μg/mL，甘草素的浓度为60～80μg/mL，橙皮苷的浓度为40～60μg/mL，人参皂苷Re的浓度为220～240μg/mL，人参皂苷Rb

优选的，所述特征图谱的建立过程为：对不同批次的异功颗粒进行超高效液相色谱检测，将不同批次的异功颗粒的超高效液相色谱进行比对，获得含有甘草苷特征峰、异甘草苷特征峰、甘草素特征峰、橙皮苷特征峰、人参皂苷Rg

进一步的，所述甘草苷特征峰、异甘草苷特征峰、甘草素特征峰、橙皮苷特征峰、人参皂苷Rg

按照本发明上述构建方法获得的特征图谱包含19个特征峰，以甘草素(峰8)作为参照峰S峰(峰S)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.245(峰1)、0.267(峰2)、0.384(峰3)、0.550(峰4)、0.623(峰5)、0.729(峰6)、0.898(峰7)、1.000(峰S)、1.208(峰9)、1.235(峰10)、1.309(峰11)、1.509(峰12)、1.563(峰13)、1.755(峰14)、1.773(峰15)、1.980(峰16)、2.016(峰17)、2.081(峰18)、2.136(峰19)；其中，峰2为甘草苷，峰4为橙皮苷，峰7为异甘草苷，峰S为甘草素，峰9为人参皂苷Rg

第二方面，本发明提供了上述异功颗粒UPLC特征图谱的构建方法在异功颗粒质量控制中的应用，按照所述的构建方法获得异功颗粒UPLC特征图谱，对待测样品的特征图谱与所述异功颗粒UPLC特征图谱进行相似性评价，相对保留时间在规定值±10％以内的待测样品为合格产品。

第三方面，本发明提供了一种检测异功颗粒中6种化学成分的方法，包括如下步骤：

将供试品溶液采用超高效液相色谱法进行检测，得到6种化学成分的含量，所述6种化学成分包括异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rb

所述超高效液相色谱法检测的条件包括：

流动相包括流动相A和流动相B，以乙腈为流动相A，以0.08～0.15wt％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序为：

0～8min，流动相A：19wt％，流动相B：81wt％；

8～16min，流动相A：19wt％→23wt％，流动相B：81wt％→77wt％；

16～34min，流动相A：23wt％→40wt％，流动相B：77wt％→60wt％；

所述超高效液相色谱法采用的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)，色谱柱的柱温为33～37℃；流动相的流速为0.2～0.4mL/min，进样量为2～4μL；

当检测波长为199～210nm时，同时检测人参皂苷Re、人参皂苷Rb

与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明通过流动相的选择，能够使异功颗粒更多的化学成分得到较好分离，确立了异功颗粒UPLC图谱中的19个特征峰，比现有技术中的特征峰种类更多，能够更全面、特征性地反映异功颗粒的组成成分，有利于全面的质量控制；

(2)本发明提供的质量检测方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，同时缩短单个样品的检测时间至34min以内，能够高效、准确地进行异功颗粒的质量控制；

(3)本发明不仅能够以甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1异功颗粒供试品溶液(下)与混合对照品溶液(上)在检测波长为203nm处的超高效液相色谱对比图，图中，a、甘草苷，b、橙皮苷，c、异甘草苷，d、甘草素，e、人参皂苷Rg

图2是本发明实施例1异功颗粒供试品溶液(下)与混合对照品溶液(上)在检测波长为237nm处的超高效液相色谱对比图，图中，a、甘草苷，b、橙皮苷，c、异甘草苷，d、甘草素；

图3是本发明实施例1异功颗粒标准UPLC特征图谱；

图4是本发明对比例1的超高效液相图谱；图中，1、甘草苷，2、橙皮苷；

图5是本发明对比例2的超高效液相图谱；图中，1、甘草苷，2、橙皮苷；

图6是本发明对比例3的超高效液相图谱；

图7是本发明对比例4的超高效液相图谱；图中，1、甘草苷，2、橙皮苷；

图8是本发明对比例5的超高效液相图谱；图中，1、人参皂苷Rg

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。

实施例1

仪器：Waters H-class超高效液相色谱仪；十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器。

试药：甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)；流动相乙腈(A)-0.1％磷酸(B)，梯度洗脱顺序：0～8min，流动相A：19wt％，流动相B：81wt％；8～16min，流动相A：19wt％→23wt％，流动相B：81wt％→77wt％；16～34min，流动相A：23wt％→40wt％，流动相B：77wt％→60wt％；柱温35℃；进样量3μL；流速0.3mL/min。

供试品溶液制备：

取异功颗粒，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，超声30min，放冷，用甲醇补足损失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

混合对照品溶液制备：

精密称定甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

精密吸取供试品及混合对照品溶液各3μL，注入液相色谱仪，测定；检测波长为203nm时获得的图谱如图1所示。在检测波长203nm时，该波长处化学成分信息丰富，可以获得19个共有峰，且人参皂苷Re、人参皂苷Rb

检测波长为237nm时获得的图谱如图2所示，可以看出，异甘草苷、甘草素、橙皮苷在237nm波长有吸收峰，且分离度好，无杂质干扰，可选择237nm作为这几种成分的含量测定波长。

异功颗粒特征图谱的建立：

共有峰标定：将异功颗粒批号为23040301、23040302、23040401、23040402、23040601、23040602、23040701、23040702、23041001、23041002的10批样品按技术方案下的色谱条件测定，将203nm的测定图谱导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统》，生成特征图谱共有模式，如图3所示，设定化学成分信息较多的S1号样品为参照图谱，标定共有峰19个，以8号峰作为参照峰S，计算与其他共有峰与S峰的相对保留时间，如表1所示。

表1相对保留时间

相似度评价：采用《中药色谱特征图谱相似度评价系统》对以上10批异功颗粒进行相似度评价，S1-S10的相似度评价见表2。由相似度结果可知，10批异功颗粒与对照图谱的相似度均在0.9以上(见表2)，说明10批样品均有较好的相似度。

表2S1-S10的相似度评价

异功颗粒与各药材的相关性：

将异功颗粒缺味药阴性样品、人参、茯苓、白术、陈皮、甘草、生姜、大枣单味药样品、异功颗粒进行特征图谱检测，发现共有峰9、10、15、17、18、19来自人参；3、4、5、6、11、12、13、14来自陈皮；1、2、7、8、13、16来自甘草。经与混合对照品溶液比对，鉴定2号峰为甘草苷；4号峰为橙皮苷；7号峰为异甘草苷；8号峰为甘草素；9号峰为人参皂苷Rg

样品含量测定：

取10批异功颗粒，在检测波长为203nm的条件下，按上述方法测定人参皂苷Re、人参皂苷Rb

表3样品含量测定结果(单位：％)

方法学考察：

特征图谱精密度：

称取异功颗粒2g，按上述方法测定，连续进样6次，记录特征图谱，以甘草素(8号峰)的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间(见表4)。各共有峰的相对保留时间均小于3％，表明精密度良好。

表4相对保留时间

特征图谱重复性：

称取异功颗粒2g，按上述方法平行制备6份样品，记录特征图谱，以甘草素(8号峰)的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间(见下表5)。各共有峰的相对保留时间均小于3％，说明重复性良好。

表5相对保留时间

特征图谱稳定性：

称取异功颗粒2g，按上述方法制备，分别在样品制备后的0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，记录特征图谱，以甘草素(8号峰)的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间(见表6)。各共有峰的相对保留时间均小于3％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

表6相对保留时间

含量测定线性：

取异甘草苷对照品适量，加甲醇溶解，配制成60.32μg/mL的对照品溶液，再加甲醇稀释成浓度分别为30.16、15.08、7.54、3.77μg/mL的对照品稀释液。

取甘草素对照品适量，加甲醇溶解，配制成72.64μg/mL的对照品溶液，再加甲醇稀释成浓度分别为36.32、18.16、9.08、4.54μg/mL的对照品稀释液。

取橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解，配制成437.44μg/mL的对照品溶液，再加甲醇稀释成浓度分别为218.72、109.36、54.68、27.34μg/mL的对照品稀释液。

取人参皂苷Re对照品适量，加甲醇溶解，配制成429.76μg/mL的对照品溶液，再加甲醇稀释成浓度分别为214.88、107.44、53.72、26.86μg/mL的对照品稀释液。

取人参皂苷Rb

取人参皂苷Rb

取对照品溶液各3μL，照上述色谱方法测定，将各个对照品浓度和峰面积进行线性回归，得到回归方程，如表7所示。6种成分的线性相关系数r＞0.999，说明在测定范围内线性关系良好。

表7 6种成分的线性方程、相关系数和线性范围

含量测定精密度

取异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rb

表8 6种成分的峰面积和RSD

含量测定重复性

称取异功颗粒2g，按上述方法平行制备6份样品，测定6种成分的峰面积并计算含量(％)。6种成分含量的RSD小于3％，表明重复性良好。

表9 6种成分的含量及RSD

含量测定稳定性

称取异功颗粒2g，按上述方法制备，分别在样品制备后的0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定6种成分的峰面积，不同测定时间6种成分峰面积的RSD小于3％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

表10不同测定时间的6种成分的峰面积

含量测定准确度

称取异功颗粒6份，每份1g，分别加入与样品中异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rb

表11异甘草苷回收率结果表

表12甘草素回收率结果表

表13橙皮苷回收率结果表

表14人参皂苷Re回收率结果表

表15人参皂苷Rb

表16人参皂苷Rb

对比例1

仪器：Waters H-class超高效液相色谱仪；十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器。

试药：甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

色谱条件：色谱柱Horizon C18(100*2.1mm，1.6μm)；流动相乙腈(A)-0.03mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH到3)(B)，梯度洗脱顺序：0～15min，17％A；15～20min，17％～22％A；20～40min，22％～40％A；柱温35℃；流速0.3mL/min；检测波长203nm。甘草苷(峰1)和橙皮苷(峰2)峰形展宽，未分离且检测时间过长，不能实现快速检测特征图谱的目的。检测结果如图4所示。

对比例2

仪器：Waters H-class超高效液相色谱仪；十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器。

试药：甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)；流动相乙腈(A)-0.03mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH到3)(B)，梯度洗脱顺序：0～15min，17％A；15～20min，17％～22％A；20～40min，22％～40％A；柱温35℃；流速0.3mL/min；检测波长203nm。检测结果如图5所示，表明甘草苷(峰1)和橙皮苷(峰2)前延严重，且未完全分离。

对比例3

仪器：Waters H-class超高效液相色谱仪；十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器。

试药：甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)；流动相乙腈(A)-0.03mol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH到2)(B)，梯度洗脱顺序：0～15min，10％A；15～20min，10％～22％A；20～40min，22％～40％A；柱温35℃；进样量5μl；流速0.5mL/min；检测波长203nm。检测结果如图6所示，表明出峰时间靠后，所有成分聚在一起无法分离。

对比例4

仪器：Waters H-class超高效液相色谱仪；十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器。

试药：甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)；流动相乙腈(A)-0.1％磷酸(B)，梯度洗脱顺序：0～6min，18％A；6～10min，18％～23％A；10～20min，23％～40％A；柱温35℃；进样量5μl；流速0.6mL/min；检测波长203nm。检测结果如图7所示，表明甘草苷(峰1)与橙皮苷(峰2)有杂质干扰，未分离。

对比例5

仪器：Waters H-class超高效液相色谱仪；十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器。

试药：甘草苷、异甘草苷、甘草素、橙皮苷、人参皂苷Rg

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)；流动相乙腈(A)-0.1％磷酸(B)，梯度洗脱顺序：0～10min，16％A；10～18min，16％～23％A；18～36min，23％～40％A；柱温35℃；进样量3μl；流速0.3mL/min；检测波长203nm。检测结果如图8所示，表明人参皂苷Rg

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。