HPLC-MS/MS一站式高通量快速筛查化妆品中115种禁用原料的检测方法

技术领域

本发明属于化妆品分析技术领域，具体涉及化妆品中115种禁用原料的检测方法。

背景技术

现阶段，国家化妆品监督抽检工作规定祛痘类化妆品的检测项目包含激素、抗感染、地氯雷他定等15种组分和萘替芬等4种组分，四类共计115个禁用原料的检测，以确保消费者用妆安全。根据《化妆品技术规范》(2015年版)和国家2021年监督抽检工作的要求，该化妆品禁用原料的检测方法按照类别各自划分，导致同一样品的不同类别禁用原料筛查，需要多次称量样品和更换测试体系设备。日常国家监督抽检为保证检验效率，需要同时开启多台液质联用仪才能按时完成任务，对地处经济欠发达地区的省级和地市药检机构化妆品室日常检验检测工作造成了巨大的压力和困难。即现有的化妆品禁用原料的检测方法存在根据《化妆品技术规范》(2015年版)和国家2021年监督抽检工作的要求按照类别各自划分，导致同一样品的不同类别禁用原料筛查需要多次称量样品和更换测试体系设备，筛查效率低的问题。

特别地，同一个样品需要多次不同的前处理方法处理样品，工作重复，合并成高通量方法后，只需制备一次样品，开多台质谱联用仪检测时，因仪器型号之间的差异，会重新调整仪器参数，重新进行对照品定位，耗时耗力，加上对照品昂贵，一次检测成本会比较高。

为了能快速高效进行高通量禁用原料筛查，推进当前国家标准《化妆品安全技术规范》构建复合性快速筛查和检验检测标准体系，建立一站式高通量化妆品快速筛查体系已成为迫切需求。因此，本发明人进行了探索性研究工作，采用高效液相色谱串联质谱仪建立一站式高通量测定祛痘类化妆品中115种禁用原料，并期望高效实现禁用原料非法添加的快速筛查，进而提高本类产品检验检测禁用原料检出的靶向性，最终实现监管效能的最大化。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供了HPLC-MS/MS一站式高通量快速筛查(祛痘类)化妆品中115种禁用原料的检测方法。

本发明提供的HPLC-MS/MS一站式高通量快速筛查(祛痘类)化妆品中115种禁用原料的检测方法，采用高效液相质谱法进行检测，检测条件如下：

色谱条件如下：

色谱柱：采用C18硅烷键合硅胶为固定相；

流动相：A：0.2％甲酸水溶液，B：0.2％甲酸乙腈溶液；

柱温箱温度：35℃；流速：0.3mL·min

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：正离子、负离子多离子反应监测模式，监测离子对及相关参数设定见下述表2(115种禁用原料成分监测离子对及相关参数)；所述115种禁用原料为表1中的115种标准物质。

优选地，采用直接提取法处理样品。

更优选地，所述直接提取法采用乙腈和50％乙腈水溶液作为提取溶剂。

进一步优选地，样品溶液制备的方法为：对于乳液类、液态水基、膏霜类样品，精密取样品约0.2g，置于10mL具塞比色管中，加入3mL乙腈，在涡旋振荡器上震荡30s至试样分散均匀，然后加入50％乙腈水溶液至近刻度，超声提取20min静置至室温，用50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，以5000r/min离心10min，取上清液用0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为样品溶液。

优选地，本发明检测方法合并/同时检测化妆品中115种禁用原料。即，本发明检测方法可以在一次检测中检测出115种禁用原料。

优选地，所述色谱柱为：安捷伦ZOPBAX Eclipse plus C18(2.1×100mm)1.8-Micron。

优选地，所述检测方法中115种禁用原料的检出限、定量限及取样量为0.2g时最低检出浓度和定量浓度见下述表5(检出限、定量限、检出浓度、定量浓度)。

在一个具体实施方式中，所述检测方法，包括以下步骤：

(1)样品溶液制备

乳液类、液态水基、膏霜类样品，精密取样品约0.2g，置于10mL具塞比色管中，加入3mL乙腈，在涡旋振荡器上震荡30s至试样分散均匀，然后加入50％乙腈水溶液至近刻度，超声提取20min静置至室温，用50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，以5000r/min离心10min，取上清液用0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为待测样品溶液。(必要时可以稀释至适宜浓度进样)。

(2)标准溶液制备

标准贮备溶液(1mg/mL)：准确称取标准物质各10mg，用甲醇分别定容至10mL，于-18℃下冷冻保存。其中，依诺沙星和诺氟沙星在甲醇中溶解性较差，先加适量乙腈超声，再加入50％乙腈水溶液定容。

混合标准溶液：除雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、克林霉素、盐酸四环素、多西环素、米诺环素、土霉素、盐酸金霉素外，其他组分分别取各自标准贮备溶液1mL混合，用甲醇定容至100mL，制备成10μg/mL混合液①；分别取雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、克林霉素、盐酸四环素、多西环素、米诺环素、土霉素、盐酸金霉素标准贮备溶液1mL混合，用甲醇定容至25mL制备成40μg/mL混合液②。(括号内物质：可依据各自仪器实际情况选择适宜浓度)，于-18℃下冷冻保存。

筛查用混合标准溶液：分别取上述混合液①，临用时用50％乙腈水溶液稀释成浓度20ng/mL；取上述混合液②，临用时稀释成浓度200ng/mL。用于快速筛查。

定量检查用混合标准溶液：取与待测样品基质类型相同的空白样品0.2g至10mL比色管中，临用时分别加入混合液①适量，按照上述样品溶液制备方法处理，用50％乙腈水溶液稀释成2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL系列浓度的标准曲线；或者，临用时分别加入混合液②适量，按照上述样品溶液制备方法处理，用50％乙腈水溶液稀释成15ng/mL、30ng/mL、80ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、450ng/mL系列浓度标准曲线。(标准溶液范围可根据实际情况调整)。

(3)快速定性筛查

取待测样品溶液与筛查用混合标准溶液，在相同的分析条件下测定，样品中如呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被测成分的特征离子峰保留时间与筛查用混合标准溶液对应的保留时间一致，且选择的定性离子的相对丰度比与相当浓度标准品溶液的定性离子的相对丰度比的最大偏差不超过表3的规定，则可判定样品中存在对应的检测组分。

表3定性判定时离子相对丰度比的最大允许偏差

(4)定量测定

当样品中检出疑似阳性成分时，取相应的标准溶液储备液，按上述方法制成相应的近似空白基质曲线，按照上述方法处理样品，照上述分析方法进行试验，在相同的分析条件下进行确证并定量测定。

(5)计算

将样品峰面积代入上述标准曲线中计算含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明采用高效液相色谱串联质谱仪建立一站式高通量测定祛痘类化妆品中115种禁用原料，从检测技术方面对原方法进行了优化合并，高效实现禁用原料非法添加的快速筛查，解决了化妆品禁用原料的检测方法根据《化妆品技术规范》(2015年版)和国家2022年监督抽检工作的要求按照类别各自划分，导致同一样品的不同类别禁用原料的筛查，需要多次称量样品和更换测试体系设备，筛查效率低的问题。

现有标准对于祛痘类化妆品中禁用原料的检测，通常所用的传统化妆品化学反应快速筛查法操作繁琐，针对目标物具有较强的化学专属性，类别差别大，往往就失去效力，而国家法定标准检验除所用大量对照品需要从国外购买价格高外，检测方法通常按照类别各自划分，同一样品不同类别禁用原料筛查，需要多次称量样品和更换测试体系设备，很难实现一站式和高通量一次完成的高效能目的。本发明建立的一站式高通量化妆品快速筛查体系正是综合上述考虑，它能够切合监管要求，从方法上合并了四种检测方法，从物质上覆盖了现行国家抽样检验工作中常控制的115种禁用原料，优化了检验检测技术中的环节，并且提高了方法适用性和操作性，体现在一台仪器上使用标准物质调试好仪器参数及质谱参数，如能够保持仪器、色谱柱填料、色谱条件稳定、质谱参数的分析条件固定，后续在进行定性初筛工作时就仅需根据仪器响应的实际情况选取质控标准物质，来确保筛查准确性，它能够实现多成分禁用原料质谱离子参数库快速高通量筛选确认的目的。即本发明也实现了大幅降低成本的目的。

快速筛查方法的实现有两个关键点，一个是仪器型号的固定，因为不同型号品牌之间的仪器死体积不同，会有一定的影响，另一个是色谱柱的填料和封板技术的不同。

本发明采用高效液相色谱质谱联用法，能够一次同时筛查115种禁用原料，进而提高检验靶向性，最终实现监管效能的最大化。

从技术上优化合并了各个检测方法的色谱条件，提高了方法的色谱条件的适用性，使115种禁用原料都能得到较好的响应与峰型，增强了合并方法的可操作性，并进行了耐用性试验，在样品处理时要注意样品的分散，有些样品基质若是加入乙腈容易成团，则先加入少量水充分分散后再加入乙腈稀释定容至刻度。

本发明方法合并后不仅提高了检测效率，检测同一批样品的时候，制备一次样品就可以可以高通量一次性筛查115种禁用原料，而不是需要制备多次，再分别进行筛查，大大提高监督工作的效率，高靶向性的完成筛查工作，若在一台仪器上测试好参数，建好模型，使仪器型号和基本参数固定，就可以使用质控标准溶液来定性测试保证仪器稳定性即可，可以降低标准品使用成本，可以实现通过一次建模，然后反复使用的目的。可以实现对监督检验方法的整合，为社会提供法定报告。

监管部门要实现对每年注册备案的上百万种化妆品产品有效的管控，只有禁用原料的准确确认才能对非法添加者依法惩处，但复杂体系中化学成分的辨识如大海捞针，很难有的放矢，本发明的方法很好的解决和高效实现禁用原料非法添加的快速筛查。

本发明可以修正国家标准不足，能够起到完善标准，促进国家标准提升的目的作用。

本发明涉及项目为：2018SF-300社发基金项目、陕西省药品监督管理局2020年科学监管与监管科学研究项目课题。

附图说明

图1是用三种提取方法处理相同阴性样加标回收TIC图。

图2是不同提取溶剂对115种禁用原料的回收率的影响。

图3是115种禁用原料标准物质提取离子(定量)质谱图。

图4是115种禁用原料标准物质总离子流(TIC)图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详述，但本发明的实施方式不限于此。本发明的实施例仅用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制。

本检测方法为药典规定的标准曲线法，以下实验过程和试验方法未详细说明的，均采用标准操作流程，例如溶液配制、系统适应性试验的操作方法。

仪器：高效液相色谱仪串联质谱仪1290infinity LC-Utiov6465；梅特勒AE240电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；离心机Neofuge15；超声波清洗机KQ-500DE；涡旋混合仪VORTEX Kylin-Bell。

试药：乙腈(Honeywell)；甲酸(Sigma)；高纯水。标准物质信息见表1。

表1标准物质信息

色谱条件如下：

色谱柱：安捷伦ZOPBAX Eclipse plus C18(2.1×100mm)1.8-Micron；

流动相：A：0.2％甲酸水溶液；B：0.2％甲酸乙腈溶液；

柱温箱温度：35℃；流速：0.3mL·min

质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：正离子、负离子多离子反应监测模式，监测离子对及相关参数设定见下表2。

表2 115种禁用原料成分监测离子对及相关参数

/>

/>

/>

/>

/>

实施例1：

(1)样品溶液制备

乳液类，液态水基、膏霜类样品处理：精密取样品约0.2g，置于10mL具塞比色管中，加入3mL乙腈，在涡旋振荡器上震荡30s至试样分散均匀，然后加入50％乙腈水溶液至近刻度，超声提取20min静置至室温，用50％乙腈水溶液定容至刻度，摇匀，以5000r/min离心10min，取上清液用0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为待测样品溶液。(必要时可以稀释至适宜浓度进样)。

(2)标准溶液制备

标准贮备溶液(1mg/mL)：准确称取标准物质各10mg，用甲醇分别定容至10mL，于-18℃下冷冻保存。(其中依诺沙星和诺氟沙星在甲醇中溶解性较差，可先加适量乙腈超声，再加入50％乙腈水溶液定容。)

混合标准溶液：除雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、克林霉素、盐酸四环素、多西环素、米诺环素、土霉素、盐酸金霉素外，其他组分分别取各自标准贮备溶液1mL混合，用甲醇定容至100mL，制备成10μg/mL混合液①；分别取括号内组分物质1mL，用甲醇定容至25mL制备成40μg/mL混合液②。(括号内物质：可依据各自仪器实际情况选择适宜浓度)，于-18℃下冷冻保存。

筛查用混合标准溶液：分别取上述混合液①，临用时用50％乙腈水溶液稀释成浓度20ng/mL；取上述混合液②，临用时稀释成浓度200ng/mL。用于快速筛查。

定量检查用混合标准溶液：取与待测样品基质类型相同的空白样品0.2g至10mL比色管中，临用时分别加入混合液①适量，按照上述样品溶液制备方法处理，用50％乙腈水溶液稀释成2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL系列浓度的标准曲线；或者，临用时分别加入混合液②适量，按照上述样品溶液制备方法处理，用50％乙腈水溶液稀释成15ng/mL、30ng/mL、80ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、450ng/mL系列浓度标准曲线。(标准溶液范围可根据实际情况调整)。

(3)标准物质

将上述对照品溶液注入高效液相色谱质谱联用仪中，根据质谱测定参数等分析条件，对各组分进行定位。测定的谱图如图3、图4所示。图3是115种禁用原料标准物质提取离子(定量)质谱图，图4是115种禁用原料标准物质总离子流(TIC)图。

(4)检测

精密进样3μl，注入高效液相色谱仪，得到样品品色谱峰面积；

快速定性筛查：取待测样品溶液与筛查用混合标准溶液，在相同的分析条件下测定，样品中如呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被测成分的特征离子峰保留时间与筛查用混合标准溶液对应的保留时间一致，且选择的定性离子的相对丰度比与相当浓度标准品溶液的定性离子的相对丰度比的最大偏差不超过表3的规定，则可判定样品中存在对应的检测组分。

表3定性判定时离子相对丰度比的最大允许偏差

定量检查：当样品中检出疑似阳性成分时，取相应的标准溶液储备液，按上述方法制成相应的近似空白基质曲线，按照上述方法处理样品，照上述分析方法进行试验，在相同的分析条件下进行确证并定量测定。

实施例2：方法学考察

对祛痘类化妆品进行115种禁用原料的检测方法进行了专属性、重复性、准确性、检出限和定量限等方法学考察。具体考察方法为：

(1)前处理条件的选择

提取方法的选择：由于化妆品基质较为复杂，考察了三种提取方法对目标化合物加标回收率的影响，分别是用直接提取法、液液萃取法与QuEChERS法来净化样品。经过试验，直接提取方法的回收率高于液液萃取法；QuEChERS法除抗感染类药物以外的其他类禁用原料，净化后的回收率均优于上述两种方法的回收率，而对抗感类药物目标物吸附过强，导致回收率过低且有部分组分未检出。故此，本方法最终采用直接提取法进行样品处理。图1是用三种提取方法处理相同阴性样加标回收TIC图。

(2)提取溶剂的选择

分别考察了乙腈、50％乙腈水溶液、0.2％甲酸乙腈溶液、0.5％甲酸乙腈溶液作为提取溶剂对回收率的影响。结果表明，上述不同提取溶剂均对抗感染类禁用原料的回收率影响较大，其他类禁用原料影响较小，采用适量乙腈分散，再加入50％乙腈水溶液提取的禁用原料的回收率更好。因此，本方法选择乙腈和50％乙腈水溶液作为提取溶剂。图2是不同提取溶剂对115种禁用原料的回收率的影响。

(3)色谱柱的选择

分别考察了相同填料的进口色谱柱，安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 RapidResolution HD(2.1×100mm)1.8-Micron和国产色谱柱菲罗门superlu 1.8μC18(2)2.1×100mm的耐用性，相同的检测条件下，几乎没有区别，耐用性较好。故此，只要色谱柱填料相同，国产色谱柱也可替代进口色谱柱，提高了方法的普适性。

(4)线性范围与加样回收实验

本实验选取基质为乳剂的空白阴性样进行加标回收率实验，记录定量离子对色谱峰面积并绘制峰面积与浓度的标准曲线，其线性相关系数r≥0.99，按上述方法制备混合标准系列浓度曲线，及进行三个浓度的加标回收实验，浓度约为定量检查用混合标准溶液的4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL相对应的质量浓度，结果见表4。

表4线性范围与加样回收实验结果

/>

/>

/>

(5)检出限及定量限

取对照品溶液，用流动相稀释到适宜质量浓度，以信噪比10:1时的进样量为定量限，以信噪比3:1时的进样量为检测限。

结果：在上述色谱条件下，当进样体积为3μL时，本方法中115种禁用原料的检出限、定量限及取样量为0.2g时最低检出浓度和定量浓度见下表5。

表5检出限、定量限、检出浓度、定量浓度

/>

/>

(6)重复性

取同一浓度的加标空白样品，质量浓度为4ng·mL

表6重复性实验结果

/>

/>

115种禁用原料中105种在线性范围2～60μg·L

本发明提出的固定仪器品牌、色谱条件和色谱柱填料，本方法就能很好的重现，解决了化妆品中115种禁用原料的检测过程过于复杂的问题，可为化妆品的禁用原料的检测提供更方便、更快捷的检测支持。

本发明可以修正国家标准不足，能够起到完善标准，促进国家标准提升的作用。

基于以上发明内容的描述，本领域技术人员能够全面地应用本发明，所有相同原理或类似的改动均应视为包括在本发明的范围之内。