超分辨光片荧光显微成像系统和方法

技术领域

本申请大体上涉及超分辨显微成像的技术领域，尤其涉及二维或三维超分辨光片荧光显微成像系统和方法。

背景技术

近年来，生命科学研究对高时空分辨三维成像技术的需求与日俱增。实现对微观生命活动高分辨率、高速、低损伤、长时程的三维成像，对于探索生命活动机理、了解生理学和病理学信息等具有重要的实践意义和广泛的应用前景。

光学荧光显微成像技术作为一类重要观测手段，为生命科学研究的发展提供了有力支撑。光学荧光显微成像技术中的光片荧光显微成像(Light-Sheet FluorescenceMicroscopy,LSFM)近年来在三维成像领域备受青睐，与传统的三维成像技术(例如激光扫描共聚焦显微镜、多光子荧光显微成像技术)不同，其利用薄的光片进行面激发，在垂直光片的方向上进行探测；这种面激发成像比传统的点扫描成像速度更快，通过配合高速扫描振镜、压电位移台等高精度器件，可实现快速的三维体成像。

但是，光片荧光显微成像本身成像分辨率受限且很难与超分辨显微成像技术相兼容。这主要是因为(1)在光片荧光显微成像系统中，激发物镜与探测物镜互相垂直的物理布置方式要求探测物镜具有较长的工作距离来实现成像，这就限制了探测物镜的数值孔径(Numerical Aperture,NA)的选择范围，导致必须选用NA较低的探测物镜作为光片荧光显微成像系统的探测物镜，从而影响了最终荧光图像的二维分辨率，甚至低于传统共聚焦显微成像获得的图像的二维分辨率，例如光片荧光显微镜的横向分辨率为350-500纳米，而共聚焦显微镜的横向分辨率可达200纳米；(2)传统光片荧光显微镜的成像视野与三维成像的轴向分辨率相互制约，为了实现较大范围的均匀光片照明，需要利用NA较小的物镜来产生光片，但这将导致所产生的光片较厚，最终获得的荧光图像中的背景信号非期望地增强，从而降低后续三维成像的轴向分辨率。此外，如果在传统光片荧光显微成像技术中直接采用结构光照明成像技术(Structured Illumination Microscopy，SIM)，仅可以提升最终二维荧光图像中的单一方向的横向分辨率，而若要实现各向同性横向分辨率提升(即二维分辨率提升)，需要改变结构光照明条纹的方向，而这对于激发物镜与探测物镜彼此垂直的传统光片荧光显微系统而言很难实现。

发明内容

本申请旨在提出一种新颖的超分辨光片荧光显微成像系统，从而能够克服上述列出的传统光片显微成像系统中的不足，实现超分辨显微成像，既可以高效提升所获取的荧光图像的二维分辨率、也可以高效提升所获取的荧光图像的三维分辨率。

根据本申请的一个方面，提供了一种超分辨光片荧光显微成像方法，包括：

利用可逆光开关荧光蛋白对待测生物样本进行处理；

令光片作为激活光面入射待测生物样本，以在其可逆光开关荧光蛋白中产生激活部分；

令经调制的条纹结构光作为激发光朝向所述激活部分所在的面入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上，以使得在所述光片所入射的平面上所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分发出荧光，其中，所述激活光与所述激发光具有不同的波长；

采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的二维荧光图像。

可选地，在考虑将使用线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，针对利用激活光片入射的可逆光开关荧光蛋白的每个待激活部分，分别先令激活光片入射且再令所述经调制的条纹结构光入射N·M次，N和M都是大于或等于3的整数，并且每次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向在所述光片所处的平面中观察彼此相差180/M度并且条纹相位相差2π/N。

可选地，在每次经调制的条纹结构光作为激发光入射所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上后，与该次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向相同但相位相差π的条纹结构光作为激发光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上。

可选地，在考虑将使用非线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，N和M至少是5。

可选地，所述光片通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格的抖动而形成。

可选地，以近红外波长的单贝塞尔光束产生光片作为激活光而以在所述可逆光开关荧光蛋白中引起双光子效应的方式入射生物样本。

可选地，在作为激活光的光片已经入射所述生物样本后并且在作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上之前，采用由具有激发光波长的光形成的用于减薄的光片在所述激活部分的两侧有部分重叠地照射，以减薄所述激活部分的厚度。

可选地，作为激活光的光片与生物样本之间的相对位置至少在与所述光片所处的平面垂直的方向上发生改变，从而通过作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上、激发荧光并采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的三维荧光图像堆栈。

可选地，光片与生物样本之间的相对位置发生改变是通过使得光片本身移动或者通过使得生物样本移动来实现的。

根据本申请的另一个方面，提供了一种超分辨光片荧光显微成像系统，包括：

光源模块；

激光选通和分光模块；

第一光片生成模块；

光片扫描模块；

激活物镜；

结构光生成与偏振调制模块；

探测物镜；

荧光检测模块；以及

样本置放移动模块，

所述第一光片生成模块、所述光片扫描模块和所述激活物镜组成第一光片激活光路，所述结构光生成与偏振调制模块、所述荧光检测模块和所述探测物镜组成结构光激发与探测光路，所述激光选通和分光模块配置成由所述光源模块发出的激光束选择性进入所述第一光片激活光路或所述结构光激发与探测光路；

所述第一光片激活光路配置成产生光片作为激活光入射经可逆光开关荧光蛋白处理的待测生物样本，以在可逆光开关荧光蛋白中产生激活部分；

所述结构光激发与探测光路配置成产生经调制的条纹结构光作为激发光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上，以使得在所述光片所入射的平面上所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分发出荧光，其中，所述激活光与所述激发光具有不同的波长；

所述结构光激发与探测光路还配置成采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的二维荧光图像。

可选地，所述第一光片生成模块包括第一振镜，所述光片通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格经由所述第一振镜的抖动而形成。

可选地，系统还包括：

能够独立于所述光源模块发出激光束的第二光片生成模块；

所述第二光片生成模块、所述第一光片生成模块的第一振镜、所述光片扫描模块和所述激活物镜组成第二光片激活光路，

所述第二光片生成模块包括：

独立于光源模块的能够产生近红外波长激光的激光器；

位于所述激光器下游的一对透镜；以及

一锥透镜与一透镜组成的子模块或环形掩模板，所述子模块或环形掩模板位于所述一对透镜下游，所述子模块或环形掩模板配置成在所述激光器发出近红外波长激光后，其先经所述一对透镜准直扩束再经由所述子模块或环形掩模板产生环形光束，并且该环形光束经过所述激活物镜后形成单贝塞尔光束，同时该单贝塞尔光束经由所述第一光片生成模块的第一振镜的抖动而产生光片作为激活光以在所述可逆光开关荧光蛋白中引起双光子效应的方式入射生物样本。

可选地，在作为激活光的光片已经入射所述生物样本后并且在作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上之前，采用由具有激发光波长的光形成的用于减薄的光片在所述激活部分的两侧有部分重叠地照射，以减薄所述激活部分的厚度。

可选地，作为激活光的光片与生物样本之间的相对位置至少沿着探测物镜的光轴发生改变，从而通过作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上、激发荧光并采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的三维荧光图像堆栈。

可选地，所述光片扫描模块配置成仅使得作为激活光的光片移位并使得探测物镜同步沿着其光轴移动或者仅使得所述样本置放移动模块移动，从而至少沿着探测物镜的光轴改变光片与生物样本之间的相对位置。

采用本申请的上述技术手段，能够获取有助于实现超分辨显微成像的二维荧光图像或三维荧光图像堆栈。在激发与探测二维荧光图像的过程中，采用了结构光条纹多方向多相位的激发方式，导致最终获得的二维荧光图像在超分辨重建后获得的超分辨图像中的各向同性横向分辨率得到显著提升。同时，利用减薄激活部分的厚度的方法，三维荧光图像堆栈的z轴分辨率也可以得到显著提升。此外，采用本申请的技术手段，选用近红外波长的激活光片对生物组织的穿透深度大幅提升并减少了对生物组织的损伤，有助于对生物组织的二维或三维观测。

附图说明

从下文的详细说明并结合下面的附图将能更全面地理解本申请的原理及各个方面。需要指出的是，各附图的比例出于清楚说明的目的有可能不一样，但这并不会影响对本申请的理解。在附图中：

图1示意性示出了根据本申请的一个实施例的超分辨光片显微成像系统的框架图；

图2示意性示出了与图1对应的根据本申请的一个实施例的超分辨光片显微成像系统的光路图；

图3示意性示出了根据本申请的超分辨光片显微成像系统的光源模块的一个示例的光路图；

图4示意性示出了根据本申请的一个实施例的第二光片生成模块的光路图；

图5示意性示出了根据本申请的一个实施例的对生物样本进行超分辨光片荧光显微成像的原理图，其中所获得的荧光图像将使用线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建；

图6A、6B、6C示意性示出了传统宽场照明与根据本申请的实施例的超分辨光片荧光显微成像方法的作为激发光的条纹结构光的频域拓展对比图；

图7示意性示出了根据本申请的另一个实施例的对生物样本进行超分辨光片荧光显微成像的原理图，其中所获得的荧光图像将使用非线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建；

图8A、8B、8C示意性示出了传统宽场照明与根据本申请的实施例的超分辨光片荧光显微成像方法的作为激发光的条纹结构光的频域拓展对比图；

图9示意性示出了根据本申请的一个实施例的利用用于减薄的光片来使得可逆光开关荧光蛋白的已激活部分减薄的方法原理图。

具体实施方式

在本申请的各附图中，结构相同或功能相似的特征由相同的附图标记表示。

图1示意性示出了根据本申请的一个实施例的超分辨光片显微成像系统的框架图。超分辨光片显微成像系统大致包括光源模块100、激光选通与分光模块200、第一光片生成模块300、能够独立于所述光源模块(100)发出激光束的第二光片生成模块110、光片扫描模块400、激活物镜500、结构光生成与偏振调制模块600、探测物镜700、荧光检测模块800、以及样本置放移动模块900。

图2示意性示出了与图1对应的根据本申请的一个实施例的超分辨光片显微成像系统的光路图，在该光路中，简化示出了样本置放移动模块900以及在其上置放的生物样本1000。

光源模块100配置成可以发出不同波长的准直激光束。例如，图3示意性示出了根据本申请的一个实施例的光源模块100的光路图。光源模块100可以包括多个激光器，例如示出包括三个激光器Laser1、Laser2、Laser3。这些可以分别发出不同波长的激光束例如405nm(纳米)、445nm、488nm波长的激光束。在一替代的实施例中，光源模块100可以包括更多激光器，从而它们可以发出更多波长的激光束例如405nm、445nm、488nm、561nm、590nm等波长的激光束。

在所示的示例中，为各激光器Laser1、Laser2、Laser3分别配备一组透镜L18、L19和L20、L21和L22、L23，以便从激光器Laser1、Laser2、Laser3出射的激光束经由对应的透镜组扩束准直为等直径的平行光，反射镜M5和二向色镜DM5、DM6将来自不同激光器Laser1、Laser2、Laser3的三路等直径的平行光进行合束成为一束激光作为光源模块100的激光束输出。

如图所示，根据本申请的激光选通和分光模块200主要包括声光可调谐滤波器AOTF(Acousto-Optic Tunable Filter)、半波片HWP(Half Wave Plate)、以及偏振分束棱镜PBS(Polarizing Beam Splitter)，它们在光源模块100输出的激光束的光路上依次布置，从而光源模块100输出的激光束能够以合适的角度和方向入射到声光可调谐滤波器AOTF中。声光可调谐滤波器AOTF配置成可以选择性地使得特定波长的光通过并且可以控制所输出的光功率。因此，在本申请的实施例中，由于激光束中含有不同波长的激光，所以激光束经过声光可调谐滤波器AOTF后可以确保根据需要特定波长的激光可以被输出。这样，特定波长的激光在经过半波片HWP调节后经偏振分束棱镜PBS分束，而分别进入由第一光片生成模块300、光片扫描模块400和激活物镜500组成的第一光片激活光路以及由结构光生成与偏振调制模块600、探测物镜700、荧光检测模块800组成的结构光激发与探测光路中。

需要指出的是，在本申请说明书中描述的超分辨光片显微成像系统的诸如声光可调谐滤波器AOTF等光学元器件的控制可以经由计算机以本领域技术人员熟悉的任何合适的方式来实现，在此将不做冗述。

如图所示，光片生成模块300主要包括透镜L119、柱透镜CL1、CL2、偏振分束棱镜PBS、空间光调制器SLM、半波片HWP、环形掩模板mask1。在介绍本申请的光路图中，有关透镜例如L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L21、L22、L23、L119等以及反射镜例如M1、M2、M3虽然也作为本申请的光学系统的必要组成部件，本领域技术人员在观察光路图时以光学系统中这些透镜和反射镜的常规配置和作用理解，因此对于它们的说明将在本文中省略。例如，当本文如下所涉及的透镜在参照附图理解为起到中继功能时，本领域技术人员应当清楚透镜的数量可以根据需要相应增减，对于这些起到中继功能的透镜的说明解释将省略。

透镜L119和两个柱透镜CL1、CL2配置成将来自激光选通和分光模块200的平行光分别在相互垂直的两个方向上进行拉伸，使柱透镜CL2出射为矩形平行光。因此，可以认为透镜L119和两个柱透镜CL1、CL2组成了一个将圆形光束改变为矩形平行光的子系统。当然，本领域技术人员应当清楚能够对平行光在二维方向上进行拉伸的其它合适的扩束光学系统均可以在本申请的技术方案中采用作为扩束子系统。

在第一光片激活光路中，光片生成模块300中的空间光调制器SLM可以是二值化空间光调制器。例如，空间光调制器SLM可以包括由多个液晶像素点组成的液晶板，每个像素点可以处于on或off这两种状态，从而在计算机的控制下空间光调制器SLM上的各像素点通过程序控制改变状态，通过设计算法生成不同的衍射图样(即空间光调制器SLM上可以由计算机控制的液晶像素点通过改变on或off状态而构成的图样)，从而光在入射空间光调制器SLM并经过透镜L3以及环形掩模板mask1后产生环形光束。在一个替代的实施例中，图样的产生也可以利用诸如数字微镜器件(DMD)的其它合适的光学器件来产生。

该环形掩模板mask1刻有同心且不同内外径的环形孔。环形掩模板mask1布置成经三组中继透镜L4、L5、L6、L7、L8、L9后与激活物镜500的后瞳共轭，并且环形掩模板mask1的不同内外径的环形孔对应生成激活物镜500的后瞳处不同数值孔径的环形光束。由此，在激活物镜500的焦面处产生不同的晶格光束或单贝塞尔光束。环形掩模板mask1置于光束焦点位置处，并且环形掩模板mask1的环形孔中心位于光轴上。

如图所示，光片生成模块300还包括第一振镜Galvo1、透镜L4、L5。第一振镜Galvo1与环形掩模板mask1以共轭的关系布置，并且透镜L4、L5在第一振镜Galvo1与环形掩模板mask1之间以组成4F系统的方式布置。本领域技术人员在阅读本说明书中涉及任何与相关光学术语例如“振镜(或激光振镜)”、“共轭”、“4F”等的内容或者它们的工作原理可以参阅本领域公知的任何技术资料包括技术字典、手册和教科书等。

如图所示，光片扫描模块400包括第二振镜Galvo2、以及透镜L6、L7、L8、L9。第一振镜G1与第二振镜G2也以共轭关系的方式布置。透镜L6、L7在第一振镜G1与第二振镜G2之间也以组成4F系统的方式布置。此外，第二振镜G2与激活物镜500的后瞳也以共轭关系的方式布置。透镜L8、L9在第二振镜G2与激活物镜500的后瞳之间也以组成4F系统的方式布置。

本申请的技术方案通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格抖动来产生光片。例如，光片生成模块300的第一振镜Galvo1配置成绕一轴线根据需要转动和/或光片扫描模块400的第二振镜Galvo2也配置成绕一轴线根据需要转动。例如第一振镜Galvo1在计算机控制的电机(未示出)驱动下绕轴线转动相应的角度。例如，当仅第一振镜Galvo1绕一轴线正反向旋转时，通过使得第一振镜Galvo1抖动(即绕一轴线在正反两个方向上旋转)，使得单贝塞尔光束或多光束干涉晶格沿着x轴运动而产生与xy平面平行的光片或称“虚拟光片”。与传统仅采用柱透镜产生光片的方法相比，本申请利用单贝塞尔光束或多光束干涉晶格抖动产生的光片更薄，使三维荧光图像堆栈的z轴分辨率更高。

在一个替代的实施例中，光片也可利用柱透镜对光进行一维作用的光学特性来产生。

光片可以经由物镜(在本申请的技术方案中，经由激活物镜500)面入射到样本置放移动模块900上放置的生物样本上。如果需要的话，第二振镜Galvo2可以转动以使得光片能够沿着探测物镜700的光轴移动，与此同时探测物镜700相应地同步沿着其光轴即z轴移动，以确保实时对焦。在一个替代的实施例中，也可以保持光片不动而仅使得样本置放移动模块900平移，从而光片尽管不动但是样品与光片之间的相对位置至少沿着探测物镜700的光轴发生改变。

如图所示，第二光片生成模块110主要包括独立于光源模块100的能够产生近红外波长激光的激光器L

激光器L

图4示意性示出了根据本申请的另一个实施例的第二光片生成模块110的光路图。该第二光片生成模块110与如图2所示第二光片生成模块的不同之处在于锥透镜Axicon和透镜L118由环形掩模板Am替代，从而近红外波长的准直激光束经过该环形掩模板Am后，可以直接产生平行的环形光束。该平行的环形光束在经过光片生成模块300的透镜L4、L5和第一振镜Galvo1以及光片扫描模块400后，从激活物镜500即可出射贝塞尔光束。

因此，可以认为第二光片生成模块110、光片生成模块300的第一振镜Gavol1、光片扫描模块400、激活物镜500组成了第二光片激活光路，其与第一光片激活光路虽然在组成光学器件方面有部分重叠，但是二者光路仅仅能够以择一的方式工作，即产生激活光片。

如图所示，结构光生成与偏振调制模块600主要包括空间光调制器SLM、半波片HWP、偏振分束棱镜PBS、掩模板mask2以及位于掩模板mask2下游的半波片HWP2。本领域技术人员应当清楚，空间光调制器SLM也可以由诸如数字微镜器件(DMD)的其它合适的光学器件来替代。

根据本申请的技术方案，光片生成模块300的空间光调制器SLM和/或结构光生成与偏振调制模块600的空间光调制器SLM可以配置成根据需要控制第一光片激活光路和/或结构光激发与探测光路通断，即通过控制对应的空间光调制器SLM加载相应的图案以控制激光束是否可以从空间光调制器SLM出射经掩模板mask1和mask2后至光路下游。

此外，在所示的示例中，结构光生成与偏振调制模块600中的空间光调制器SLM可以是二值化空间光调制器，结构光生成与偏振调制模块600中的半波片HWP可以是消色差半波片。空间光调制器SLM、半波片HWP、和偏振分束棱镜PBS可以组成相位光栅。平行光在经过偏振分束棱镜PBS反射后，线偏光方向经半波片HWP旋转π/8后入射到空间光调制器SLM上。例如，空间光调制器SLM可以包括由多个液晶像素点组成的液晶板，每个像素点可以处于on或off这两种状态，从而在计算机的控制下空间光调制器SLM上的各像素点通过程序控制改变状态可以将入射光的偏振方向左旋或右旋π/4，然后再次经过半波片HWP被再次旋转π/8，从空间光调制器SLM反射的两种线偏光的偏振状态分别与空间光调制器PBS的出射偏振方向成±45°夹角，最终经由空间光调制器PBS反射后，对应空间光调制器SLM上on和off状态的像素点被调制为具有大小为π的相位差。由于上述的理由，空间光调制器SLM、半波片HWP、和偏振分束棱镜PBS构成了相位光栅，通过设计算法生成不同的衍射图样(即空间光调制器SLM上可以由计算机控制的液晶像素点通过改变on或off状态而构成的图样)就可以在生物样本处产生所需的不同方向且不同相位的正弦或余弦结构光条纹。

此外，掩模板mask2布置在光束焦点位置处，该掩模板mask2配置成仅仅保留正负一级的光分量而滤除其它级的光分量。与掩模板mask1不同，该掩模板mask2例如可以配置成围绕着与光轴同心的中心分布有多个通孔，例如6个通孔或10个通孔。这些通孔在周向上均匀间隔分布，并且沿着径向两两分组对正。当激光束在结构光激发与探测光路中经过上述相位光栅后，产生能够经过这些通孔组中的一组通孔的两束激光束。这两束激光束在经过半波片HWP2后从探测物镜700出射形成两束光斑，以朝向已经被激活光片所激活的部分所在的面入射并且彼此发生干涉以产生条纹结构光。

位于掩模板mask2下游的半波片HWP2例如可以分成多块(例如6块或10块等)区域，这些区域彼此呈现对称分布的方式，单个区域的液晶分子的快轴方向一致，但是各区域的主光轴不同。这种分区域设计的半波片HWP2可以使得在不同区域入射的线偏光的偏振方向发生不同改变，从而在整个半波片HWP2上具有相同的λ/2延迟量。这些区域分别与掩模板mask2的各分组的通孔对应，从而使得经过任何一组的通孔的两束光的偏振方向在经过半波片HWP2、二向色镜DM2、透镜L14和L15、以及探测物镜700后垂直于经探测物镜700照射的两束光斑的连线方向，在生物样本1000的表面实现效率最高条纹调制。本领域技术人员应当清楚，其它可以产生经过调制的条纹结构光的光学模块也可以在本申请的技术方案中用作为结构光生成与偏振调制模块600。

如图所示，荧光检测模块800主要包括二向色镜DM2、相机Camera以及反射镜M3。根据本申请的技术方案，结构光生成与偏振调制模块600输出的调制后的结构光条纹经探测物镜700照射到生物样本表面后，激发出荧光后再由同一探测物镜700收集，经由透镜L15、反射镜M3、透镜L14、二向色镜DM2及透镜L13后进入相机Camera，获得含有结构光条纹信息的荧光图像，利用结构光超分辨重建算法对所采集到的图像进行重建，即可得到超分辨图像。

在获得含有结构光条纹信息的二维荧光图像的基础上经由结构光二维超分辨重建算法可以重建获得二维超分辨图像；并在获取三维荧光图像堆栈后，通过重建算法可以重建获得超分辨图像堆栈。本领域技术人员应当清楚，超分辨重建算法能够以任何显微图像处理技术领域中熟知的重建方法来实现，例如可以采用商业软件Matlab来实现图像重建而利用商业交互式显微图像分析软件如Imaris、Amira在计算机上实现图像显示分析，因此不在本文所讨论范畴内。本申请的超分辨光片荧光显微成像系统的主要目的之一是获得可以用于实现超分辨重建的荧光图像(二维荧光图像或三维荧光图像堆栈)。

本申请提出在待观测的生物样本中引入可逆光开关荧光蛋白RSFPs(ReversiblyPhotoswitchable Fluorescent Proteins)，从而实现超分辨光片荧光显微成像。可逆光开关荧光蛋白在生物样本中的引入可以采用本领域熟知任何合适的方式例如转染来实现。可逆光开关荧光蛋白RSFPs是一种仅在激活后才能够激发产生荧光的荧光蛋白。可逆光开关荧光蛋白RSFPs例如可以在第一波长(或称激活波长)的激活光照射下激活，处于激活状态。然后，再经过与第一波长不同的第二波长(或称激发波长)的激发光照射，激发产生荧光，处于亮态。在发出荧光之后，紧接着可逆光开关荧光蛋白RSFPs会再次转变为非激活状态，即暗态。在暗态下，即使可逆光开关荧光蛋白RSFPs受到非激活波长的光照，也不会激发荧光产生。当再次利用激活波长的激活光照射后，这种可逆光开关荧光蛋白RSFPs可以再次处于激活状态，等待激发波长的激发光照射后，激发荧光产生而再次处于亮态。

取决于可逆光开关荧光蛋白RSFPs的物理或化学特性的不同，不同种类的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的激活波长或激发波长可能有所不同。在本申请描述的实施例中，所选用的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的激活光的激发波长示意性选为405nm，并且激发光的激发波长示意性选为488nm。

图5示意性示出了根据本申请的一个实施例的对生物样本进行超分辨光片荧光显微成像的原理图，该方法能够以利用如上介绍的超分辨光片荧光显微成像系统来实现。

如图所示，已经经过可逆光开关荧光蛋白RSFPs处理的生物样本1000置于样本置放移动模块900的载物台上。根据本申请的技术方案，样本置放移动模块900可以配置成在三维方向上根据需要平移。在图4中为了展示清楚的原因，设定三维笛卡尔坐标系，其中x轴垂直于纸面或者屏幕方向，y轴与激活物镜500的光轴方向平行，z轴与探测物镜700的光轴方向平行。

首先，在激活物镜500出射激活波长的单贝塞尔光束或多光束干涉晶格后，经由第一振镜Galvo1抖动，形成激活光片。该激活光片主要位于与xy平面平行的平面中并入射到生物样本1000中，从而使得由该激活光片照射的生物样本1000的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的部分进行激活。因此，可以认为激活光片在生物样本1000上的入射是一种面入射。

例如，激活物镜500出射激活波长的单贝塞尔光束或多光束干涉晶格可以通过这样的方式来实现，即如图2所示的超分辨光片显微成像系统的激光选通和分光模块200的声光可调谐滤波器AOTF被控制成仅使得405nm的准直激光束通过，并且控制空间光调制器SLM使得仅允许光片激活光路导通。这样，正如之前所描述的，激活波长的准直激光束在经过光片激活光路后自激活物镜500以单贝塞尔光束或多光束干涉晶格的方式出射，随着光片生成模块300的操作(第一振镜Galvo1的抖动)，产生激活光片。

在产生激活光片照射生物样本1000以对可逆光开关荧光蛋白RSFPs激活后，由探测物镜700出射激发波长的经过调制的条纹结构光照射生物样本1000的已经被激活的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的部分，从而使得该部分激发产生荧光，该荧光然后通过探测物镜700经由荧光检测模块800被收集成像，此过程可以称为对可逆光开关荧光蛋白RSFPs的荧光检测。

以形成有6个通孔的掩模板mask2为例，根据光学原理，这6个通孔可以组成三组通孔对，每组夹角为180°/3＝60°，每对通孔沿着径向彼此对正。

在每次可逆光开关荧光蛋白RSFPs已被激活光片激活后且在用激发光进行照射时，通过控制空间光调制器SLM所出射的用于形成条纹结构光的两束激光束经过掩模板mask2的三组通孔对中的不同组通孔对，可以针对可逆光开关荧光蛋白RSFPs被激活的同一平面(例如平行于xy)分别获得三个含有不同条纹方向的荧光图像(例如，对应于如图5下方所示的三个条纹方向的荧光图像)。针对通常的条纹结构光激发而言，如果条纹信息未含高频信息的话，仅利用线性超分辨重建算法来对荧光图像进行处理。在这种情况下，对于每个条纹方向而言，分别利用空间光调制器SLM控制产生三个条纹相位不同的条纹结构光作为激发光进行照射，并获得三幅荧光图像(每幅荧光图像所携带的条纹信息的相位不同)。因此，总共可以获得九幅带有条纹信息的荧光图像。条纹相位之间的相位差是相同的，都是2π/3；不同条纹方向之间的差也是相同的，都是180°/3＝60°。这些荧光图像所带有的条纹信息经过后期二维超分辨图像处理能够显著提升最终图像的各向同性横向分辨率。

图6A、6B、6C示意性示出了传统宽场照明与本申请的实施例的超分辨光片荧光显微成像方法的激发结构光条纹对比的频谱图。在图6A中，示意性示出了传统宽场照明的荧光图像信息的频谱图，其中宽场意味着如图2所示的掩模mask2由一带有中心圆孔的掩模板所替代，该掩模板的中心圆孔位于光轴上。图6B示意性示出了在一个方向上含有三个相位信息的荧光图像的频谱图，图6C示意性示出了在三个方向上含有三个相位信息的荧光图像的频谱图，其中这三个方向分别对应于掩模板mask2的三组通孔对。从图6C与图6A的对比看，由于频域信息的叠加部分增大，所以显然采用本申请的超分辨光片荧光显微成像方法在提升生物样本1000的最终超分辨图像的分辨率方面更加有优势。

需要清楚的是，由于针对可逆光开关荧光蛋白RSFPs被激活的同一平面需要获得与三个条纹方向和三个条纹相位分别对应的荧光图像，也就是说，需要将可逆光开关荧光蛋白RSFPs激活-激发九次，所以当可逆光开关荧光蛋白RSFPs的激活的平面已经被激发结构光条纹激发产生荧光后，该平面中产生荧光的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的部分将会处于暗态，但是未被激发结构光条纹照射的部分仍处于激活状态。因此，为了确保针对该同一平面在已经获得与某一方向某一相位对应的荧光图像后能够继续获得清晰的荧光图像，在激发结构光条纹照射该平面后，需要利用与该激发结构光条纹方向相同但相位相差π的激发结构光条纹再次照射该平面以确保整个平面均处于暗态，从而为该平面经受下一次激活以及激发做准备，避免残余激活状态的可逆光开关荧光蛋白RSFPs条纹影响其它方向的荧光图像质量。

虽然在采用线性超分辨重建算法对与三个条纹方向和三个条纹的荧光图像进行重建已经足以获得令人满意的超分辨重建图像，但是如果采用更多方向和相位的荧光图像利用线性超分辨重建算法也可以获得超分辨重建图像结果。

因此，对于利用线性超分辨重建算法进行后期荧光图像重建而言，针对可逆光开关荧光蛋白RSFPs的每个待激活并待激发的部分，可以令作为激发光的经调整的条纹结构光入射N·M次，其中N和M都是大于或等于3的整数，每次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向在激活光片所处的平面中观察彼此相差180/M度并且条纹相位相差2π/N。在这种情况下，掩模板mask2也相应配置为具有2M个通孔，并且这些通孔组成了M组通孔对，每对通孔径向对称，各组之间相差360°/2M度。

受制于线性结构光成像原理，参照图5、图6C所示的超分辨光片荧光显微成像是线性二维超分辨荧光显微成像。然而，以本领域技术人员都清楚的原理，如果能够使得作为激发光的条纹结构光在荧光蛋白中引起饱和效应，荧光发射强度与激发光强度呈非线性正相关，导致所获取的携带信息的条纹更窄并因而导致更高频的条纹信息被涵盖在所获取的荧光图像中，则针对这种含有高频信息的荧光图像可以进一步采用非线性超分辨重建算法获得分辨率更佳的超分辨图像。

图7示意性示出了根据本申请的另一个实施例的对生物样本进行超分辨光片荧光显微成像的原理图，该方法例如能够利用如上介绍的超分辨光片荧光显微成像系统来实现。以下仅介绍该方法与如图5所示不同的内容，其它相同的内容可以参照关于上述方法实施例的描述。

在如图7所示的实施例中，作为激发光的条纹结构光在荧光蛋白中引起饱和效应导致所获取的携带信息的条纹更窄并因而导致更高频的条纹信息被涵盖在所获取的荧光图像中。因此，在所获取的荧光图像中可以带有更高频的条纹信息。对于激发光能够激发出高频荧光信息的能量要求取决于可逆光开关荧光蛋白RSFPs的物理或化学特性的不同而不同，因此在本文中不做示例描述，本领域技术人员基于可逆光开关荧光蛋白RSFPs的特性应当可以清楚使得激发光达到何种强度的能量就可以激发出高频荧光信息。

此外，在如图7所示的实施例中，针对可逆光开关荧光蛋白RSFPs被激活的同一平面(与xy平行)需要获得至少二十五幅荧光图像(例如，某一相位的五个条纹方向的荧光图像在图7下方示出)，每幅荧光图像带有针对一个条纹方向以及一个条纹相位的条纹信息。因此，在掩模板mask2中形成有10个通孔，它们组成五组通孔对，每对通孔沿着径向彼此对正。图8A、8B、8C示意性示出了传统宽场照明与本申请的实施例的超分辨光片荧光显微成像方法的激发结构光条纹对比的频谱图。在图8A中，示意性示出了传统宽场照明的频谱图。图8B示意性示出了在一个方向上含有五个相位信息的荧光图像的频谱图。图8C示意性示出了在五个方向上含有五个相位信息的荧光图像的频谱图，其中这五个方向分别对应于掩模板mask2的五组通孔对。从图8C与图8A的对比看，由于频谱的扩展，所以显然采用本申请的超分辨光片荧光显微成像方法在提升生物样本1000的最终超分辨图像的分辨率方面更加有优势，并且从图8C与图6C的对比看，在频域因为收集到了更多的高频信息，体现了更多的荧光图像细节，所以图8C所示的频谱图所代表的荧光图像再经过非线性超分辨重建算法处理后，所产生的超分辨图像必然分辨率更加优于线性结构光成像。

因此，对于利用非线性超分辨重建算法进行后期荧光图像重建而言，针对可逆光开关荧光蛋白RSFPs的每个待激活并待激发的部分，可以由作为激发光的经调整的条纹结构光入射N·M次，其中N和M是大于或等于5的整数，每次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向在激活光片所处的平面中观察彼此相差180/M度并且条纹相位相差2π/N。

第二光片生成模块110的激光器L

以图2为例，首先通过声光可调谐滤波器AOTF和光片生成模块300的空间光调制器SLM的设定使得第一光片激活光路中不产生激活光。然后，在第二光片激活光路中，当由激光器Lnr产生的780nm波长的准直激光束经过锥透镜Axicon并经过透镜L118后，可以产生平行的环形光束。该平行的环形光束在经过光片生成模块300的第一振镜Galvo1以及光片扫描模块400后，因锥透镜Axicon的后焦面与激活物镜500的焦面的共轭设计，所以从激活物镜500可出射贝塞尔光束。该贝塞尔光束在经由第一振镜Galvo1的抖动后形成激活光片。通过激光器L

以上的实施例主要涉及二维超分辨光片荧光显微成像(例如在与xy平面平行的平面中的二维超分辨光片荧光显微成像)，在激活光片随着z轴方向间隔移动时，通过不断地在每个z轴位置的激活光片所激活的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的部分处重复采用上述线性或非线性二维超分辨光片荧光显微成像方法，可以获得体现生物样品三维特征的荧光图像堆栈。在荧光图像堆栈中，每个z轴位置的二维图像均可经超分辨重建算法实现超分辨效果。需要指出的是，对于采用本申请的超分辨光片荧光显微成像系统进行成像时，生物样本与激活光片之间的相对位置沿着探测物镜700的光轴或者沿着z轴改变可以通过如下两种方式来实现，(1)使得第二振镜Galvo2转动从而使得激活光片沿着探测物镜700的光轴移动，与此同时探测物镜700同步沿着光轴移动以确保对焦；以及(2)使得激活光片保持不动，但是利用样本置放移动模块900来移动生物样本1000。

为了提高三维荧光图像堆栈的z轴分辨率(沿着探测物镜700的光轴的分辨率)，需要将每次由激活光片照射的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的被激活部分尽量减薄。

图9示意性示出了根据本申请的一个实施例的将激活光片照射的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的被激活部分减薄的方法。

如图所示，首先利用激活光片(如实线框架2000所示)照射生物样本1000的可逆光开关荧光蛋白RSFPs以产生激活部分。然后，利用激发波长的激光束形成用于减薄的光片(如虚线框架2100所示)分别在生物样本1000的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的已激活部分的厚度方向上的两侧进行照射，并且每次照射的区域均与激活部分有所重叠，因此该重叠的部分经由激发波长的光照射后将从亮态转变为暗态，而可逆光开关荧光蛋白RSFPs的已激活但未与用于减薄的光片重叠的部分仍为激活状态，并且厚度明显减薄，如图所示。因此，随后利用关于结构光激发与探测光路介绍的内容，可以对已经减薄的处于激活状态的可逆光开关荧光蛋白RSFPs的激活部分再次利用作为激发光的条纹结构光激发荧光并相应获取带有条纹信息的荧光图像。

在图9的实施例中，激活光片的产生可以参照有关图2、5、7描述的内容，包括利用激活波长的单贝塞尔光束或多光束干涉晶格抖动或者利用具有在可逆光开关荧光蛋白RSFPs中可以引起双光子效应波长的单贝塞尔光束抖动产生激活光片面入射生物样本。

以如图2所示的超分辨光片荧光显微成像系统为例，在产生用于减薄的光片时，激光选通和分光模块200的声光可调谐滤波器AOTF被控制成仅使得488nm(激发波长)的准直激光束通过，并且结构光激发与探测光路中的空间光调制器SLM(或者在一替代的实施例中，用于替代的空间光调制器SLM的数字微镜器件)被设定成使得结构光激发与探测光路不导通。这样，通过第一光片生成光路分别产生如图9的虚线框架2100所示的用于减薄的光片以部分重叠的方式照射可逆光开关荧光蛋白RSFPs的已被激活光片照射的部分的两侧，以使得重叠的部分被提前激发产生荧光并转而改变至非激活状态即暗态，从而减薄可逆光开关荧光蛋白RSFPs的被激活光片激活的部分的(沿着z轴、即沿着探测物镜700的光轴的)厚度，随后利用结构光激发与探测光路产生的激发结构光条纹照射可逆光开关荧光蛋白RSFPs的已被减薄的激活部分(如图9中阴影部分区域所示)，进而获得激发荧光图像。利用所获得的荧光图像堆栈经由重建算法获得体现生物样品三维特征的超分辨图像，在z轴方向上因可逆光开关荧光蛋白RSFPs的激活部分被进一步减薄而可以实现超分辨效果。本领域技术人员应当清楚，有关结构光激发与探测光路中产生激发结构光条纹以及获取荧光图像的内容可以参照前述实施例的描述来实现。

在一个替代的实施例中，用于减薄的光片也可利用控制空间光调制器SLM所产生的特定样式的图案来生成，以本领域技术人员任何熟知的方式为准。本领域技术人员应当清楚，空间光调制器SLM也可以由诸如数字微镜器件(DMD)的其它合适的光学器件来替代。

本领域技术人员应当清楚，用于减薄的光片沿着探测物镜700的光轴或者沿着z轴的位置改变可以通过如下两种方式来实现，(1)使得第二振镜Galvo2转动以使得光片沿着探测物镜700的光轴移动，同时探测物镜700也沿着其光轴同步移动以确保对焦；以及(2)使得用于减薄的光片保持不动，但是利用样本置放移动模块900来移动生物样本1000。

尽管这里详细描述了本申请的特定实施方式，但它们仅仅是为了解释的目的而给出，而不应认为它们对本申请的范围构成限制。此外，本领域技术人员应当清楚，本说明书所描述的各实施例可以彼此相互组合使用。在不脱离本申请精神和范围的前提下，各种替换、变更和改造可被构想出来。