一种快速测定环境水样中灭草松和2,4-滴的方法

技术领域

本发明属于特定物质检测技术领域，具体涉及一种快速测定环境水样中灭草松和2,4-滴的方法。

背景技术

灭草松和2,4-滴(2,4-二氯苯氧乙酸)都酸性除草剂，pKa分别是2.7和3.3，在世界范围内广泛用于农业生产。由于两种物质都有极性的基团，具有一定的水溶性。在20℃时，灭草松和2,4-滴的溶解度约为0.50g/L和0.62g/L。灌溉时，它们容易穿透土壤进入地下水或地表水等水体，造成水体污染。研究表明，灭草松和2,4-滴对人类和动物造成癌症风险、神经系统疾病、以及生殖风险等严重伤害。

世界卫生组织和美国环境保护局规定，饮用水中2,4-滴的最大污染物水平分别为70.0和30.0μg/L。我国《地下水质量标准》(GBT14848-2017)中2,4-滴Ⅰ类水、Ⅱ类、和Ⅲ类水的限值分别是0.1μg/L、6.0μg/L和30.0μg/L；《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2022)中规定灭草松和2,4-滴的限值分别为300μg/L和30μg/L。

由于灭草松和2,4-滴的高毒性和广泛使用，建立检测饮用水、地下水、地表水中这两种酸性除草剂的分析方法十分重要。测定水体中灭草松和2,4-滴的主要方法是气相色谱法和高效液相色谱法。气相色谱需要在分析前衍生化极性的灭草松和2,4-滴。衍生化过程增加了总的分析时间，并使用强毒性衍生化试剂，繁琐操作步骤也造成重现性变差。而高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)不需要衍生化，更适合灭草松和2,4-滴的分析。

由于水样中灭草松和2,4-滴含量低，必须使用样品前处理技术才能检测低浓度的水样。常见的前处理方法有液液萃取(LLE)，固相萃取(SPE)。还有新发展出的小型微型技术，例如盐析辅助液液萃取(SALLE),溶剂去乳化分散液液微萃取(SD-DLLME)，分散微固相萃取(D-μ-SPE)，吸管尖端固相萃取(PT-SPE)，分子印迹技术(MIP)等。这些前处理技术都是多步骤的离线方法，涉及多步的人工操作，存在精密度差，回收率不好的问题。其中有些方法还使用大量有毒有机试剂，危害实验人员健康。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速测定环境水样中灭草松和2,4-滴的方法，采用大体积进样-高效液相色谱法进行检测，色谱条件如下：

色谱柱：Kinetex C18色谱柱；

流动相：流动相A是质量分数为0.4～0.6％的磷酸水溶液，流动相B是甲醇；

采用梯度洗脱，洗脱程序如下：

0～5min，流动相A为65％，流动相B为35％；

5～15min，流动相A从65％线性变化至10％，流动相B从35％线性变化至90％；

15～23min，流动相A为10％，流动相B为90％；

其中流动相比例均为百分比体积。

进一步的，采样时，水样中加入5～10mg/L的硫代硫酸钠以消除氯的影响。

更进一步的，测定前，水样经0.22μm聚四氟乙烯针式过滤器过滤。

更进一步的，Kinetex C18色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。

更进一步的，所述色谱柱以核壳为填料。

更进一步的，流动相流速为1mL/min。

更进一步的，水样的进样量为2000μL。

更进一步的，色谱的检测波长为230nm。

更进一步的，所述色谱柱的柱温为38～40℃。

更进一步的，所述水样的pH范围为2～9。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了一种大体积进样-高效液相色谱法(LVI-HPLC)直接测定水样中灭草松和2,4-滴的方法。2000μL过滤水样在流动相的作用下进入高效液相色谱系统，在低洗脱强度下，灭草松和2,4-滴被聚焦在色谱柱柱头，形成狭窄的谱带，实现了目标物200倍的在线浓缩；保留的杂质也被聚焦在柱头，不保留的杂质随流动相流出。在梯度洗脱过程中，保留的杂质和目标化合物被分离，并且目标化合物被紫外检测器检测。整个样品分析过程，没有常规的复杂的多步骤的手工前处理过程，实现了在线富集和检测。该方法分析时间短(小于30分钟)；线性范围宽，浓度在0.2～100μg/L之间；精密度高，相对标准偏差在0.2～1.6％之间；准确度好，加标回收率在99.8～102.5％之间；检出限低，灭草松和2,4-滴分别是0.03和0.04μg/L。各个单项指标处于国内和国际先进水平。综合考虑所有指标，达到了极佳的平衡，具备了独特的优势。本发明所用试剂无毒，对人体危害小。本方法适合于饮用水、地表水和地下水中灭草松和2,4-滴的检测，在水体的日常监管和突发水环境事件应急监测领域有着重要的应用价值。

附图说明

图1为灭草松和2,4-滴的色谱图，其中，样品浓度：a和b,50ng/mL；c,10μg/mL.溶剂：a和b,纯水；c,甲醇；进样量:a,10μL；b,2000μL；c,10μL。

图2为水样pH值对峰面积的影响，其中，样品浓度：50ng/mL；溶剂：纯水；进样量:2000μL。

图3为离子强度对峰面积的影响，其中，样品浓度：50ng/mL；进样量：2000μL。

图4为有机溶剂含量对峰面积的影响，其中，样品浓度：50ng/mL；进样量：2000μL。

图5为针式过滤器的筛选，其中，a,0.1ng/mL标准溶液的色谱图；b,过PTFE针式过滤器纯水的色谱图；c,过GHP针式过滤器纯水的色谱图；d，过GF针式过滤器纯水的色谱图。

图6为地表水水样的加标色谱图，其中，a，地表水；b，50ng/mL标准溶液；c，50ng/mL加标地表水。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例涉及的试剂、材料：

灭草松(100μg/mL，甲醇溶剂，坛墨质检)、2,4-滴(100μg/mL，甲醇溶剂，阿尔塔科技有限公司)，磷酸(85％，色谱纯，Merck)，甲醇(色谱纯，Merck)，纯水(18.2MΩ·cm，Milli-Q超纯水)、硫代硫酸钠(优级纯，科密欧化学试剂有限公司)。聚四氟乙烯针式过滤器(PTFE，0.22μm，Waters)，聚丙烯针式过滤器(GHP，0.22μm，Waters)，玻璃纤维针式过滤器(GF，0.22μm，Waters)，针式过滤器使用前用10mL甲醇冲洗，去除杂质。

实施例1：采用LVI-HPLC检测灭草松和2,4-滴的方法

1、样品采集和预处理

将水样采集后置于棕色玻璃瓶中，加入5mg/L的硫代硫酸钠以消除氯的影响，4℃避光保存，3天内测定。测定前水样经0.22μm聚四氟乙烯针式过滤器过滤。

2、色谱条件

仪器：Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪，由2个LC-20AT色谱泵、DGU-20A脱气机、SIL-20A自动进样器(配备2000μL定量环)、CTO-20AC柱温箱、SPD-M20A检测器组成。

色谱柱：Kinetex C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：流动相A是0.5％的磷酸水溶液，流动相B是甲醇；

梯度程序如下表1所示，其中流动相比例均为百分比体积，5-15min流动相体积线性变化。

表1梯度程序

流动相流速：1mL/min；

进样量：2000μL；

检测波长：230nm；

柱温：40℃。

实施例2：色谱柱的筛选

本实施例比较了核壳型色谱柱Kinetex C18(250×4.6mm,5μm)和两种传统全多孔色谱柱Gemini 5u C18(250×4.6mm,5μm)、Kromasil 100-5C18(250×4.6mm,5μm)对灭草松和2,4-滴的分离效果，实验证明核壳型色谱柱Kinetex C18的分离度更好峰高更高。原因是由于核壳型色谱柱的核壳填料具有窄的粒径分布和扩散路径，因此柱效比全多孔填料更高。

一般情况下，由于截止波长低、黏度小、洗脱能力强等特点，优先选择乙腈作为流动相中的强洗脱溶剂。但是由于甲醇为类质子溶剂，对分离碱性或电负性强的化合物会有更高的选择性。实验证明分离灭草松和2,4-滴时，甲醇的分离效果远远好于乙腈的分离效果。

灭草松和2,4-滴是酸性除草剂。在反相梯度分离时，通常会给弱溶剂水中加入酸性物质来抑制其离子化，得到对称的色谱峰，改善分离。磷酸具有低吸收度的优点，常用于液相色谱的分析。本发明比较了水中三个磷酸浓度水平0.1％、0.2％、0.5％(v:v)对分离的影响，当磷酸浓度是0.5％时，保留时间和峰面积的重现性最好。

实施例3：LVI-HPLC和传统分析方法的比较

采用实施例1的方法测定水样中的灭草松和2,4-滴，图1a和1b分别是10μL和2000μL的50ng/mL的灭草松和2,4-滴水溶液的色谱图。灭草松和2,4-滴的色谱峰尖锐、对称、分离度高。进样量2000μL是10μL的200倍，峰面积和峰高也是200倍，实现了样品大体积进样在线200倍富集。

在典型的色谱分析方法中，可以采用传统的液液萃取或固相萃取等离线前处理的方式，经过萃取、浓缩、氮吹转换溶剂、复溶制样等多个复杂手工步骤，处理大体积水样得到1mL的萃取液，进液相色谱分析。假设在完全理想情况下，各前处理步骤都没有目标物质的损失和污染，处理200mL 50ng/mL的水样可以得到1mL浓度为10μg/mL的萃取液，进10μL到液相色谱分析得到和图1c完全一样的色谱图。对比图1b和图1c，灭草松和2,4-滴的绝对量都是100ng，峰面积相同，峰高相同。

可见，与离线手工前处理相比，大体积进样有极大的优势，实现在线的富集、分离和检测，分析时间短，预期精密度和准确度也会更高。

实施例4：水样pH对LVI-HPLC的影响

水样的pH值直接影响了灭草松和2,4-滴在水样中的存在形态，进一步影响了萃取效率。灭草松和2,4-滴的pKa分别是3.3和2.7。当水样的pH小于pKa时，酚主要以分子形式存在，反之离子态。在液液萃取和固相萃取等前处理方法中，需要准确调节水样的pH值到特定准确数值，使灭草松和2，4-滴要以分子形式存在以获得最大的萃取效率。

本实施例考察了水样pH对LVI-HPLC的影响，结果如图2所示。当pH在2～9范围内，色谱峰面积保持一致，相对标准偏差分别为0.8％和0.5％。保留时间保持恒定，相对标准偏差分别是0.08％和0.03％。实验结果和其它研究明显不同，在酸性、中性和弱碱性条件下，都有非常好的检测效果。

原因是在pH 2～9范围内，水样中两种物质以分子形态或离子形态单独存在，或以两种形态同时存在。进样后，在低的洗脱强度下，离子形态和分子形态的灭草松和2,4-滴中的疏水基团和固定相上的C18基团发生疏水相互作用，使其聚焦在色谱柱的柱头；水样中的酸性或碱性溶剂被流动相带走，同时在酸性流动相的持续作用下，离子形态也质子化成分子形态。在后续的梯度洗脱过程中，灭草松和2,4-滴全部以分子形态参与色谱过程，因此水样的pH不会影响目标物的保留时间和峰面积。

此方法具有独特的优势，可以直接测定pH在2～9宽pH范围的水样。无需调节水样pH值，减少实验步骤并避免带入杂质，提高分析准确度。

实施例5：水样离子强度的影响

在离线的液液萃取和固相萃取方法中，通常给水样中加盐，利用盐析效应降低有机物在水溶液中的溶解度，提高样品的回收率。另一方面实际水样自身也含有不同浓度的盐。

因此，为了研究不同离子强度的影响，在不同的氯化钠含量(0～5％，m/v)条件下，做了离子强度对测定结果的影响。结果如图3所示，目标峰面积几乎不变。当氯化钠含量在0～5％之间，峰面积的相对标准偏差分别是0.3％和0.5％。保留时间保持恒定，相对标准偏差分别是0.02％和0.03％。

一方面，水样中高达5％的氯化钠不能降低ng/mL浓度级别的目标物在水样中的溶解能力，另一方面进样后目标物聚焦在柱头，而盐不保留被流动相带走，消除了离子强度对目标物的影响。结果表明该方法很好的抵抗离子强度的能力。

实施例6：水样中有机溶剂含量的影响

实际水样可能含有有少量的有机物，因此本实施例研究了水样中有机溶剂(甲醇)对结果的影响，结果如图4所示。有机溶剂浓度在0～2％(v/v)范围内，灭草松和2,4-滴色谱峰的峰面积保持不变，5次结果的相对标准偏差是0.3％和0.4％。同时，保留时间的相对标准偏差是0.04％和0.04％。可见，本发明方法也有很强的抵抗有机溶剂的能力。

实施例7：过滤材料的筛选

实际水样中的颗粒物，会堵塞色谱柱和降低色谱柱的寿命。过滤是去除水中颗粒物最常用的方法之一。必须非常小心地筛选到合适的针式过滤器，要求针式过滤器不能溶出物质干扰分析。在本实施例中，聚丙烯、玻璃纤维、聚四氟乙烯针式过滤器被仔细测试，并和0.1ng/mL低浓度的标准溶液做比较，结果如图5所示。图5a是0.1ng/mL标准溶液的色谱图。聚丙烯(图5c)、玻璃纤维针式过滤器(图5d)在灭草松处有明显的干扰，聚四氟乙烯针式过滤器(图5b)在灭草松和2,4-滴处都没有干扰。因此，选择聚四氟乙烯针式过滤器进一步研究。

实施例8：LVI-HPLC方法性能

将适量的100μg/mL标准溶液用纯水稀释，定容在100mL的容量瓶中，得到工作溶液。工作溶液在使用前配制。在优化的条件(实施例1的方法)下，用线性范围、线性相关系数、检出限来评估LVI-HPLC的性能。灭草松和2,4-滴在0.2～100ng/mL之间呈线性，线性相关系数分别是0.9998和0.9999。标线最高点100ng/mL的标准溶液不会产生进样残留，不会影响下一次进样分析。检出限，用三倍信噪比的方法计算，分别是0.03ng/mL和0.04ng/mL。

实施例9：实际样品分析

用LVI-HPLC分析饮用水、地下水、地表水等实际水样，结果均未检出。为了证实大体积进样-高效液相色谱法能有效用于实际水样中灭草松和2,4-滴分析，进一步对3种水样在2个浓度水平开展加标回收率的测定，平行分析5次，结果列在表2中。LVI-HPLC测定实际水样中灭草松和2,4-滴的加标回收率分别是99.8～102.5％、100.1～102.3％，精密度分别是0.3～0.9％、0.2～1.6％。地表水和加标浓度为50ng/mL的地表水色谱图如图6所示。结果证明，LVI-HPLC适合饮用水、地下水、地表水等实际水样中灭草松和2,4-滴的分析。

表2实际水样的加标回收率

注：ND表示未检出

实施例10：LVI-HPLC方法与现有技术的比较

表3比较了LVI-HPLC和其他分析方法。LVI-HPLC由于没有采用复杂的多步手工前处理，因此具有最好的精密度和回收率。在专利CN201810503720中2,4-滴的检出限更低，并且超高效色谱分析时间更短，但是由于前处理采用了手工固相萃取前处理方法耗时长，因此分析样品的总时间、精密度和回收率明显不如本发明。

表3LVI-HPLC和其他现有技术分析方法的效果比较

表3中编号[1]-[11]的现有技术索引如下：

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尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。