一种基于相位调制散斑的空间谱估计显微成像装置与方法

文献发布时间：2024-04-18 20:01:55

技术领域

本发明涉及超分辨荧光显微技术领域，特别是涉及一种基于相位调制散斑的空间谱估计显微成像装置与方法。

背景技术

空间谱估计宽场照明超分辨显微成像，通过对图像进行奇异值分解，划分信号与噪声子空间，利用成像系统的点扩散函数(PSF)在不同特征向量上的投影比值来实现超分辨率成像，成像横向分辨率高，抑制噪声能力强，成像速度快，广泛应用于生命科学的许多领域。然而，因宽场照明条件下成像分辨率依赖于荧光波动，而特殊荧光染料标记具有较强的化学毒性和光毒性，不利于活体细胞成像。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种基于相位调制散斑的空间谱估计显微成像装置与方法，可以解决宽场照明依赖于荧光波动，而特殊荧光染料标记具有较强的化学毒性和光毒性的问题。

本发明采用的技术方案在于：

一种基于相位调制散斑的空间谱估计显微成像装置，包括激光光源，沿激光光源的光线传播方向依次设有准直扩束镜、SLM、准直透镜、中继透镜、管镜、二向色镜、物镜、荧光样品、滤光片、集光透镜和相机。

激光光源出射光通过准直扩束镜后，入射至SLM表面，散射光经准直透镜和中继透镜，会聚于管镜与中继透镜的公共焦面形成强度非均匀分布的散斑光场。管镜和物镜组成无限远成像系统，管镜的后焦面与物镜前焦面为一组共轭面，SLM产生不同的散斑图案可以改变物镜前焦面的散斑强度分布，对荧光样品进行随时间变化的非均匀激发。荧光样品发出的荧光经物镜收集以及二向色镜和滤光片滤除杂散光后经集光透镜会聚于前焦面，相机感光平面与集光透镜前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。

照明光由SLM调制相位生成散斑照明。所述的SLM是基于光学相控阵技术，通过外加电场控制液晶层的折射率，当光束入射至液晶层光栅相位面上时，光束会发生偏转，通过不同电场的调制，液晶层可以实现不同的相位深度形貌，光束便可以实现不同角度的偏转。

一种基于相位调制散斑的空间谱估计显微成像方法，包括以下步骤：

S1、由激光器发射的光束沿光传输路径入射到SLM的反射表面上，经SLM调制后，在荧光样品上形成散斑照明；

S2、改变SLM的散斑图案实现照明光的相位调制，对荧光样品进行随时间变化的非均匀激发

S3、利用CCD相机采集由荧光样品在随时间变化的散斑照明下生成的原始图像序列；

S4、利用空间谱估计对原始图像序列进行重构，获得高分辨率图像。

进一步地，所述步骤S1具体包括：

激光光源出射光通过准直扩束镜后，入射至SLM表面，SLM表面产生的散斑图案使光束经准直透镜和中继透镜，会聚于管镜与中继透镜的公共焦面形成强度非均匀分布的散斑光场。管镜和物镜组成无限远成像系统，管镜的后焦面与物镜前焦面为一组共轭面，SLM产生不同的散斑图案可以改变物镜前焦面的散斑强度分布，对荧光样品进行随时间变化的非均匀激发。

进一步地，所述步骤S3具体包括：

荧光样品发出的荧光经物镜收集以及二向色镜和滤光片滤除杂散光后经集光透镜会聚于前焦面，相机感光平面与集光透镜前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。

原始图像光强分布公式为：

式(1)中，I(r

进一步地，所述步骤S4具体包括：

将所述的原始图像序列描述为数学矩阵的形式，低分辨图像序列组成矩阵I：

I＝[I

式(2)中，K表示采集的原始图像总帧数；求其协方差矩阵：

R＝I*I' (3)

对矩阵R进行特征值分解，基于信息论方法中的最小描述长度准则(MDL)，根据成像系统噪声模型，通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ

式(4)中，M代表荧光样品中荧光探针个数，λ代表特征分解得到的特征值。

利用两种子空间的正交特性进行谱峰搜索，提高图像分辨率。

本发明的有益效果是：

利用散斑结构照明主动控制荧光闪烁，无需特殊荧光标记，不依赖于荧光开关，照明强度低，可以有效避免因特殊荧光染料标记引起的化学毒性和依赖于漂白过程荧光波动所引起的光毒性，提高了基于空间谱估计的超分辨显微成像技术的适用性。

附图说明

图1是一种基于相位调制散斑的空间谱估计显微成像装置的结构示意图；

图2是仿真所用荧光样品的真实分布图；

图3是相机采集的相位调制产生散斑照明下的低分辨率图像；

图4是空间谱估计散斑照明超分辨显微，利用散斑照明对不具备闪烁特性的荧光样品成像的仿真结果；

图5所示空间谱估计散斑照明超分辨显微仿真结果中沿虚线方向的强度分布对比图。图1中：1、激光光源；2、准直扩束镜；3、SLM；4、准直透镜；5、中继透镜；6、管镜；7、二向色镜；8、物镜；9、荧光样品；10、滤光片；11、集光透镜；12、相机。

具体实施方式

图1是本实施例的成像装置结构示意图，包括激光光源1，沿激光光源1光线传播方向依次设有准直扩束镜2，SLM 3，准直透镜4，中继透镜5，管镜6，二向色镜7，物镜8，荧光样品9，滤光片10，集光透镜11和相机12。成像过程为非相干成像。

激光光源1出射光通过准直扩束镜2后，入射至SLM 3表面，散射光经准直透镜4和中继透镜5，会聚于管镜6与中继透镜5的公共焦面形成强度非均匀分布的散斑光场。管镜6和物镜7组成无限远成像系统，管镜6的后焦面与物镜7前焦面为一组共轭面，SLM 3产生不同的散斑图案可以改变物镜8前焦面的散斑强度分布，对荧光样品9进行随时间变化的非均匀激发。荧光样品9发出的荧光经物镜收集以及二向色镜7和滤光片10滤除杂散光后经集光透镜11会聚于前焦面，相机12感光平面与集光透镜11前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。

一种基于相位调制散斑的空间谱估计显微成像方法包括以下步骤：

步骤一、由激光器发射的光束沿光传输路径入射到SLM3的反射表面上，经SLM3调制后，在荧光样品上形成散斑照明；

步骤二、改变SLM3的散斑图案实现照明光的相位调制，对荧光样品9进行随时间变化的非均匀激发；

步骤三、利用CCD相机12采集由荧光样品9在随时间变化的散斑照明下生成的原始图像序列；

步骤四、利用空间谱估计对原始图像序列进行重构，获得高分辨率图像。

所述步骤一具体实施方式：

所述步骤二具体实施方式：

荧光样品9发出的荧光经物镜收集以及二向色镜7和滤光片10滤除杂散光后经集光透镜11会聚于前焦面，相机12感光平面与集光透镜11前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。