一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法

技术领域

本发明属于生物药学分析化学领域，具体涉及一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法。

背景技术

静脉活性药物可用于治疗急性和慢性痔，其确切的作用机制尚不清楚，但已证明可改善静脉张力，稳定毛细血管通透性和增加淋巴引流。

柑橘黄酮片为复方制剂，其就是静脉活性药物中的一种，每片含柑橘黄酮（纯化微粒化黄酮成份）500mg，由450mg类黄酮糖苷地奥司明和50mg黄烷酮苷橙皮苷构成；临床上常用于治疗静脉淋巴功能不全和急性痔疮发作等相关病症，在多国指南中作为一线/A级推荐。研究表明，该药物具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤等，应用前景广阔。依据国家药品监督管理总局（NMPA）对于仿制药的审评要求，国内口服片剂仿制药需要开展一致性评价，即评价仿制药与原研药在人体内是否具有生物等效性。

其中，类黄酮糖苷地奥司明是芸香苷，即苷元与葡萄糖和鼠李糖的7位糖苷相连，口服后在肠道内被肠道菌群水解成苷元（香叶木素）而吸收入血，而苷元又会被Ⅱ相酶迅速转化成结合代谢物，如硫酸盐和葡萄糖醛酸苷进行循环，主要存在形式为3-O-葡萄糖醛酸香叶木素和3,7-O-双葡萄糖醛酸香叶木素，故在血浆中较难检测到地奥司明和香叶木素。

黄烷酮苷橙皮苷也是芸香苷，口服后被肠道菌群水解为苷元（橙皮素），在血浆中以葡萄糖醛酸苷和磺基葡萄糖苷酸的形式循环，其中橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和橙皮素-3’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为主要的橙皮素-葡萄糖醛酸苷。所以，血浆中同样难以检测到游离的橙皮素。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，该方法能有效检测出柑橘黄酮片中香叶木素和橙皮素的含量，有利于评价仿制药与原研药在人体内是否具有生物等效性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，包括如下步骤：

步骤1：血浆样品孵育所需的溶液的准备

替代生物基质：按照体积比为1:5将含1%BSA的1×PBS缓冲溶液和超纯水混合；

β-葡萄糖醛酸酶溶液：称取一定量的β-葡萄糖醛酸酶，加入到所述替代生物基质中溶解，且溶解后溶液浓度为5000U/mL，然后再加入摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液混合搅拌获得β-葡萄糖醛酸酶溶液，β-葡萄糖醛酸酶溶液的浓度为2500U/mL；

标准曲线替代生物基质：称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；再分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液，香叶木素标准曲线工作溶液的浓度为2~600ng/mL，橙皮素标准曲线工作溶液的浓度为1~300ng/mL；然后按照体积比为1:1将香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液混合形成若干组的标准曲线工作溶液，标准曲线工作溶液中的香叶木素和橙皮素的摩尔比为2:1；将若干组的标准曲线工作溶液按照体积比为1:19加入所述替代生物基质中形成若干个标准曲线替代生物基质；

内标工作溶液：称取一定量的同位素标记橙皮素Rac-hesperetin-

步骤2：水解孵育及样品前处理条件

取制备好的标准曲线替代生物基质和待测样品100μL，并向其加入100μL的β-葡萄糖醛酸酶溶液；涡旋1min后，置于37℃水浴锅中水浴18h；

水浴后降温，然后加入50μL内标工作溶液，再涡旋1min；然后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋5min后置高速冷冻离心机中离心10min，高速冷冻离心机的工作温度为4℃、转速为4000rpm；

取上清液50μL，加入100μL的超纯水，涡旋2min获取标准曲线进样液和待测样品进样液；

步骤3：采用液相色谱-质谱法对标准曲线进样液进行检测，并制作标准曲线；然后采用液相色谱-质谱法对待测样品进样液进行检测，并将检测结果从标准曲线获取对应的香叶木素和橙皮素的浓度；

在液相色谱-质谱法中选用C18反相色谱柱，柱温40℃，进样体积3µL，流动相A相为超纯水，B相为乙腈，流速为0.4 mL/min，洗脱梯度如下：

；

在液相色谱-质谱法中的质谱条件为电喷雾电离，正离子模式，多反应监测，气帘气30psi，碰撞气8psi，离子源喷雾电压-4500V，离子源温度500℃，喷雾气40psi，辅助加热气50psi，香叶木素和橙皮素的离子对分别为299.1/256.0、301.1/164.0，内标的离子对为305.0/164.0。

进一步地，步骤（1）中所述摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液的制备方法为：称取2.042g乙酸钠粉末，加入15mL超纯水，充分搅拌溶解后加入400μL冰乙酸调节pH为5。

进一步地，步骤（1）中所述含1%BSA的1×PBS缓冲溶液的制备方法为：称取1g牛血清白蛋白（BSA），加入5mL20×PBS缓冲液和95mL超纯水，充分搅拌溶解。

进一步地，标准曲线替代生物基质有7组，其中，香叶木素浓度分别为0.1、0.2、1、4、15、24、30ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05、0.1、0.4、1.6、7.5、12、15ng/mL。

本发明还包括质控检测，所述质控检测包括如下步骤：

质控样品工作溶液制作：称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；再分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素质控样品工作溶液和橙皮素质控样品工作溶液，香叶木素质控样品工作溶液的浓度为2~450ng/mL，橙皮素质控样品工作溶液的浓度为1~225ng/mL；然后按照体积比为1:1将香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液混合形成质控样品工作溶液，质控样品工作溶液有4组，香叶木素浓度分别为0.1、0.3、12、22.5ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05、0.15、6、11.25ng/mL；香叶木素浓度为0.1ng/mL且橙皮素浓度为0.05的质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入所述替代生物基质中形成质控样品替代生物基质，将剩余3组质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入到空白血浆基质中形成质控样品空白血浆基质；

按照步骤（3）所述的水解孵育及样品前处理条件对质控样品替代生物基质和质控样品空白血浆基质进行处理并进样；然后再采用液相色谱-质谱法对质控样品进样液进行重复检测，根据重复检测结果的变异系数判定质控结果。

本发明的有益效果为：通过加入β-葡萄糖醛酸酶进行预孵育的方法，将血浆中的葡萄糖醛酸苷结合型香叶木素和橙皮素转化为游离型香叶木素和橙皮素，并构建液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法对两种成份进行同时定量检测，用于支持柑橘黄酮片在人体内的药代动力学研究。

附图说明

图1为本发明空白血浆中香叶木素的色谱图。

图2为本发明LLOQ样品中香叶木素的色谱图。

图3为本发明空白血浆中橙皮素的色谱图。

图4为本发明LLOQ样品中橙皮素的色谱图。

图5为本发明空白血浆中内标的色谱图。

图6为本发明LLOQ样品中内标的色谱图。

图7为本发明香叶木素的标准曲线图。

图8为本发明橙皮素的标准曲线图。

图9为本发明应用于临床中香叶木素血药浓度-时间曲线图。

图10为本发明应用于临床中橙皮素血药浓度-时间曲线图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，该方法通过加入β-葡萄糖醛酸酶进行预孵育的方法，将血浆中的葡萄糖醛酸苷结合型香叶木素和橙皮素转化为游离型香叶木素和橙皮素，并构建LC-MS/MS方法对两种成份进行同时定量检测，解决了无法直接测定血浆中香叶木素和橙皮素浓度的问题，为柑橘黄酮片仿制制剂的生物等效性研究提供了技术支撑。

材料：香叶木素（中国食品药品检定研究院）、橙皮素（质量控制化学品）、同位素标记橙皮素Rac-hesperetin-

检测设备：超高效液相色谱仪（日本岛津，LC-40D XS；SIL-40C XS）、质谱仪（美国sciex仪器公司，Triple QuadTM 6500+）、反相色谱柱（WATERS XBridge C18，2.1mm I.D.×150mm，5µm）、液相色谱柱（美国菲罗门C18，4.0mm×2.0mmI.D.）、高速冷冻离心机（湖南湘仪，H2050R）、超纯水仪（赛默飞世尔科技公司，MICROPUREUV/UF with Tank）、十万分之一天平（梅特勒-托利多，XSR105DU）。

（1-1）摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液：称取2.042g乙酸钠粉末，加入15mL超纯水（超纯水仪），充分搅拌溶解后加入400μL冰乙酸调节pH为5，制备的乙酸钠缓冲液有效保质期为5天。

（1-2）含1%BSA的1×PBS缓冲溶液：称取1g牛血清白蛋白（BSA），加入5mL20×PBS缓冲液和95mL超纯水，充分搅拌溶解。

（1-3）替代生物基质：取步骤（1-2）制备的含1%BSA的1×PBS缓冲溶液和超纯水按照体积比为1:5混合获得。

（1-4）β-葡萄糖醛酸酶溶液：称取一定量的β-葡萄糖醛酸酶，加入到步骤（1-3）制备的替代生物基质中溶解，且溶解后溶液浓度为5000 U/mL，然后再加入步骤（1-1）制备的摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液混合搅拌获得β-葡萄糖醛酸酶溶液，β-葡萄糖醛酸酶溶液的浓度为2500U/mL，需要说明的是，β-葡萄糖醛酸酶溶液需要每次新配。

（1-5）标准曲线和质控样品工作溶液：

称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入稀释溶剂甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素标准曲线工作溶液、香叶木素质控样品工作溶液、橙皮素标准曲线工作溶液、橙皮素质控样品工作溶液，然后按照体积比为1:1将香叶木素和橙皮素储标准曲线工作溶液混合构成若干组标准曲线工作溶液，以及若干组质控样品工作溶液。

表1 香叶木素标准曲线工作溶液和质控样品工作溶液

表2橙皮素标准曲线工作溶液和质控样品工作溶液

表1为本实施例制备的香叶木素标准曲线工业溶液和质控样品工作溶液，表2为本实施例制备的橙皮素的标准曲线工业溶液和质控样品工作溶液，表中XYMS为香叶木素，CPS为橙皮素，MID为中间溶液，STD1~STD7为标准曲线工作溶液，QC1~QC4为质控样品工作溶液。将上述XYMS-STD1和CPS-STD1按照体积比1:1混合形成STD1标准曲线工作溶液，以此类推形成STD2~STD7标准曲线工作溶液、以及QC1~QC4质控样品工作溶液。

（1-6）内标工作溶液：称取一定量的同位素标记橙皮素Rac-hesperetin-

（1-7）葡萄糖醛酸苷结合型待测物工作溶液：称取一定量的香叶木素-3-O-葡糖苷酸和橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/mL的D-3-OG储备液和H-7-OG储备液；取D-3-OG储备液加入稀释溶剂甲醇稀释成浓度为1600ng/mL的D-3-OG工作溶液，取H-7-OG储备液加入稀释溶剂甲醇稀释成浓度为800ng/mL的H-7-OG的工作溶液；将D-3-OG工作溶液和H-7-OG的工作溶液按照体积比为1:1混合成结合型待测物混合工作溶液。

因香叶木素和橙皮素均为人体内源性物质，定量检测时极易受到血浆基质中背景信号的干扰，所以标准曲线工作溶液STD1~STD7和质控样品工作溶液QC1含药样品需使用替代生物基质进行制备，而质控样品工作溶液QC2~QC4需采用筛选后的空白血浆基质进行制备。

取STD1~STD7标准曲线工作溶液和QC1质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入到替代生物基质、以及QC2~QC4质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入空白血浆基质中获得含药替代生物基质或空白血浆基质。

其中，STD1~STD7的含药替代生物基质中香叶木素浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、1ng/mL、4ng/mL、15ng/mL、24ng/mL、30ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.4ng/mL、1.6ng/mL、7.5ng/mL、12ng/mL、15ng/mL；QC1含药替代生物基质、QC2~QC4含药空白血浆中香叶木素浓度分别为0.1ng/mL、0.3ng/mL、12ng/mL、22.5ng/mL；橙皮素的浓度分别为0.05ng/mL、0.15ng/mL、6ng/mL、11.25ng/mL。

为考察香叶木素-3-O-葡糖苷酸和橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷水解为香叶木素和橙皮素的孵育条件，需制备含D-3-OG和H-7-OG的血浆样品。取结合型待测物混合工作溶液适量按体积比1:19加入到空白血浆当中，涡旋混匀后获得结合形待测物空白血浆基质，其中D-3-OG空白血浆浓度为40ng/mL，H-7-OG空白血浆浓度为20ng/mL。

（3-1）取制备好的含药样品替代生物基质或空白血浆基质100μL放入96孔板中，并向其加入100μL的β-葡萄糖醛酸酶溶液；涡旋1min后，置于37℃水浴锅中水浴18h；

（3-2）水浴后置于冰上降温，然后加入50μL内标工作溶液，再涡旋1min；然后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋5min后置高速冷冻离心机中，高速冷冻离心机的工作温度4℃、转速为4000rpm，离心10min；

（3-3）取上清液50μL转移至新的96孔板中，加入100μL的超纯水，涡旋2min后进样。

（4-1）设置色谱条件，如表3所示：

表3 色谱条件

（2）设置质谱条件，如表4所示：

表4质谱条件

取制备好的结合型待测物空白血浆基质100μL加入96孔板中，加入100μL的β-葡萄糖醛酸酶溶液，涡旋1min后于水浴锅中水浴一定时间，水浴锅温度依次设定为37℃和60℃，孵育时间依次设定为2h、4h、8h、18h。

当达到对应的孵育时间后，取出水浴后的样品于冰上降温，加入50μL内标工作溶液，涡旋1min；然后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋5min后置高速冷冻离心机中，温度为4℃，转速4000rpm，离心10min。

取上清液50μL转移至另一96孔板中，加入100μL超纯水，涡旋2min后进样。

同时进样提前制备好的含对应理论水解后浓度的香叶木素和橙皮素血浆样品。通过比较水解样品和理论浓度样品中香叶木素和橙皮素与内标的峰面积比，判断是否达到完全水解，判断标准为偏差在±15%之间。

结果显示，当孵育时间为2h时，孵育温度设为37℃和60℃水解转化率没有显著差异，而随着孵育时间延长，37℃的水解转化率优于60℃。另一方面，当孵育时间为2h、4h、8h时，水解转化率随着孵育时间延长而逐渐增加，但未能达到完全转化。当孵育时间延长至18h时，D-3-OG和H-7-OG的转化率约为100%。所以，在后续正式实验中均按照温度37℃和时间18h条件进行孵育。

（6-1）选择性

取空白替代生物基质、STD1标准曲线含药替代生物基质（LLOQ）各100μL，按照水解孵育及样品前处理条件进行处理，然后进样分析，评价方法的选择性。结果如图1~图6所示，该方法对香叶木素和橙皮素以及内标具有较高的选择性。在空白替代基质样品中，内源性化合物对待测物和内标的保留时间以及响应没有明显干扰。

（6-2）标准曲线

采用加权的最小二乘线性回归模型对待测物与内标的峰面积比（

香叶木素和橙皮素的标准曲线分别如图7、图8所示，香叶木素的典型回归方程为

（6-3）精密度和准确度

本实施例的批内准确度和精密度通过在一个分析批内对4个浓度水平（QC1~QC4）的QC重复测定6次来进行评估，而批间准确度和精密度在3天内进行评估。准确度的接受标准为各浓度测定的均值在理论浓度的±15%（LLOQ为±20%）之间，精密度的接受标准为各浓度水平的变异系数（CV%）在±15%（LLOQ为±20%）之间。

结果显示，本实施例测定香叶木素和橙皮素的准确度和精密度均在可接受范围之内，结果可重复，方法准确可靠。

（6-4）提取回收率与基质效应

采用QC2、QC3和QC4进行提取回收率的评价。将经过筛选后的空白血浆基质提取后，向其中添加QC2、QC3和QC4浓度的待测物和内标制得（每个浓度各6份），得到待测物及内标未提取测定的峰面积（REC.POST）。以准确度精密度同浓度样本，作为提取后测定的峰面积（REC.PRE），以不同浓度配制样品提取后测定的峰面积（REC.PRE）分别与相同浓度未提取样品测定的峰面积（REC.POST）平均值之比计算提取回收率。每个浓度待测物和内标提取回收率的变异系数及不同浓度的待测物和内标总体CV%均不超过15.00%。

采用QC2和QC4进行基质效应的评价。使用6个不同来源经过筛选的血浆。分别考察含有基质的峰面积和不含基质（溶液）的峰面积，分别计算待测物和内标基质效应因子和内标归一化的基质效应因子，不同来源基质的内标归一化基质效应因子的CV%应不超过15.00%。

结果表明，在3个QC浓度水平进行评价，香叶木素的提取回收率在88.1%~95.6%之间，橙皮素的提取回收率在87.7%~95.2%之间，内标的提取回收率在100.4%~102.2%之间，CV%在8.8%以内。在QC2和QC4浓度水平下，香叶木素的内标归一化基质效应因子均值分别为0.92和0.77，橙皮素的内标归一化基质效应因子均值分别为1.51和1.32，CV%在7.6%以内。因此，香叶木素和橙皮素的提取回收率和基质效应在各QC水平上均可接受。

本实施例为柑橘黄酮片受试制剂与参比制剂的临床生物等效性研究，本实施例为预实验，采用了三序列三周期重复交叉设计，共纳入了18例受试者，按先后顺序随机分配至A、B、C组，每组6例。给药剂量为500mg，分别于给药前-24h、-18h、-12h、给药前0h（给药前90min内）及给药后20min、40min、60min、80min、100min、120min、140min、160min、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、24h、48h、72h、96h，由前臂静脉采血4mL至已标记好的含有EDTA-K

香叶木素和橙皮素的血药浓度-时间曲线分别如图9、图10所示，其中R为参比制剂，T为受试制剂，可见参比制剂和受试制剂的体内过程存在较大差别。

以上所述仅是本发明优选的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何基于本发明所提供的技术方案和发明构思进行的改造和替换都应涵盖在本发明的保护范围内。