一种鼠李糖乳杆菌在制备杂交狼尾草青贮饲料中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体为一种鼠李糖乳杆菌在制备杂交狼尾草青贮饲料中的应用。

背景技术

杂交狼尾草是热带、亚热带和温带地区的重要牧草，具有适应性强、速生和产量高等特点，在我国南方各省均有大面积的种植，是草食家畜的优质粗饲料。狼尾草的盛产期集中在于水热充足的夏季，季节性供应不平衡，且南方湿热气候不利于干草的调制，青贮是长期保存青绿饲草，并为反刍家畜提供优质饲草料的一种有效途径。青贮发酵是一个复杂的微生物代谢和演替的过程，乳酸菌是青贮饲料发酵过程中的优势菌群，将可溶性碳水化合物分解成有机酸，快速降低pH，抑制不良微生物活性。

但是，杂交狼尾草青贮原料含糖量低，附着的乳酸菌丰度和活性有限，自然发酵过程中有害微生物与其争夺底物，生长繁殖受抑制，导致自然青贮条件下pH下降缓慢，消耗更多营养物质，青贮品质难以提高；且湿热环境下霉菌等腐败菌生长活性旺盛，难以抑制，开窖后易出现二次发酵，发生霉变现象，降低青贮品质，影响家畜健康。

发明内容

本发明为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种鼠李糖乳杆菌在制备杂交狼尾草青贮饲料中的应用，能够有效抑制杂交狼尾草青贮饲料中常见的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌和黄曲霉毒素等致病性细菌和致病性真菌，提高青贮饲料的品质和稳定性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌在制备杂交狼尾草青贮饲料中的应用，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC1.60089，保藏日期为2023年01月06日。

优选地，所述应用具体为所述鼠李糖乳杆菌抑制杂交狼尾草青贮饲料中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、黄曲霉菌中的一种或多种。

优选地，所述应用具体为降低杂交狼尾草青贮饲料中氨态氮占总氮的比值和丁酸含量方面的应用。

优选地，所述应用具体为在提高杂交狼尾草青贮饲料有氧稳定性方面的应用。

优选地，所述青贮饲料中鼠李糖乳杆菌的添加量占青贮原料鲜重的比例为10

优选地，所述杂交狼尾草青贮饲料为杂交象草青贮饲料。

第二方面，本发明提供一种杂交狼尾草青贮饲料的制备方法，包括以下步骤：

将杂交狼尾草与鼠李糖乳杆菌混合，进行发酵，发酵产物即为杂交狼尾草青贮饲料；所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC1.60089，保藏日期为2023年01月06日。

优选地，所述鼠李糖乳杆菌的添加量占杂交狼尾草鲜重的比例为10

优选地，所述发酵温度为25～40℃。

第三方面，本发明提供一种根据所述杂交狼尾草青贮饲料的制备方法制备得到的杂交狼尾草青贮饲料。

本发明的有益效果是：

本发明在杂交狼尾草青贮饲料发酵过程中添加鼠李糖乳杆菌，可以对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌和黄曲霉毒素均有较好的抑制效果。

采用本发明方法制备得到的杂交狼尾草青贮饲料，提高了其干物质含量、粗蛋白含量和酸性洗涤纤维含量，增加了乳酸菌含量，降低氨态氮占总氮的比值和丁酸含量，改善发酵品质，提高青贮饲料暴露空气后的有氧稳定性，且抑制黄曲霉毒素B1的积累。在高温高湿地区，一般不推荐植物乳杆菌作为杂交狼尾草青贮的添加剂，但本发明的鼠李糖乳杆菌可以作为一个候选菌株，为杂交狼尾草青贮的研究开辟了探究方向。

附图说明

图1为杂交象草青贮饲料的有氧稳定性检测结果图；

图2为青贮饲料75d和有氧暴露5d后黄曲霉毒素B1含量检测图；

图3为青贮饲料有氧暴露5d后黄曲霉毒素B1的积累量图；

图4为青贮饲料75d微生物种水平的群落结构检测图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

本发明所述鼠李糖乳杆菌LG 608(Lactobacillus rhamnosus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.1.60089，保藏日期为2023年01月06日。

实施例1鼠李糖乳杆菌LG608的抑菌作用

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌种

乳酸菌：从四川农业大学现代农业基地贮藏的雅玉8号玉米青贮饲料中分离并鉴定的鼠李糖乳杆菌LG 608。

标准菌株：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，由四川农业大学草地学实验室保存。

治病菌：致病菌株主要用于抑菌试验，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)，均由四川农业大学草地学实验室保存。

1.1.2培养基

乳酸菌：MRS肉汤培养基(表1)；

致病性细菌：LB肉汤培养基(表2)；

抑菌活性检测培养基：MRS固体培养基和LB琼脂培养基，琼脂粉均为20g/L；

以上培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

表1.MRS肉汤培养基(g/L)

表2.LB肉汤培养基(g/L)

1.2实验方法

1.2.1菌种活化

将-80℃冷冻保存的LG608接种于MRS液体培养基中，37℃恒温箱培养48h，如此传代培养2次得到活性最好的LG608菌种。

将-80℃冷冻保存的致病性细菌菌种接种于LB肉汤培养基于30℃恒温箱培养48h，活化两代得到活性较强菌种。

1.2.2乳酸菌混合菌液的制备

上述活化两代的LG608菌株，进行第三代培养后备用。

1.2.3致病菌菌种浓度确定

上述活化两代的致病性细菌菌种，培养三代后，离心(4000r/min，15min)，弃上清液，沉淀用0.85％的灭菌生理盐水清洗，快速混匀器混匀后再离心，如此离心三次，将沉淀的菌泥用0.85％的灭菌生理盐水振起即得到供试菌悬液，并用灭菌生理盐水调至10

1.2.4抑菌活性的测定

采用牛津杯打孔平板法。

1.2.4.1致病性细菌测定

将已灭菌的MRS固体培养基倒入无菌培养皿中，无菌培养皿10ml，待凝固后，将灭菌后的牛津杯用灭菌后的镊子放在MRS固体培养基，取活化好的致病性细菌1ml，加入25ml灭菌后室温冷却至50℃的营养培养基中，充分摇匀，倒入无菌培养皿中(不能倒在牛津杯的孔里)，待凝固后用无菌镊子夹出牛津杯，并在牛津杯孔里加入100μl LG608的混合菌液，于37℃培养，用游标卡尺量取抑菌圈直径(以减去牛津杯外径取平均值后的数据为准)。

1.3结果与分析

抑菌效果见表4：

表4.乳酸菌发酵混合液的抑菌效果

注:LG608：鼠李糖乳杆菌；同行不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，牛津杯直径为8mm。

如表4所示，可以看出，鼠李糖乳杆菌LG 608对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌均有较好的抑制效果。

实施例2杂交象草青贮饲料的制备与检测

1实验材料

1.1青贮原料

“桂牧1号”杂交象草[(Pennisetum americanum×P.purpureum)×P.purpureumSchum cv.Mott]，于2019年7月1日在中国四川省崇州市(N30°56',E103°65')四川农业大学现代农业研究基地采集。

1.2添加剂

本实验供试菌株为课题组自选鼠李糖乳杆菌(LG608)和商业植物乳杆菌(L.plantarum)，后者为商业菌剂，购买自四川省成都市高福记生物科技有限公司。

1.3乳酸菌添加量

乳酸菌添加剂按照青贮原料10

2实验设计

杂交象草青贮实验采用双因素完全随机区组设计，因素一为青贮温度，设40℃(HT)和25℃(LT)2个水平；另一因素为微生物添加剂，设无菌水(CK)，商业植物乳杆菌(LP)和自选LG608三个水平；于室温下贮藏75d，并在有氧暴露5d时取样，每处理重复三次。

3实验方法

杂交象草青贮原料收获时株高2～2.5m，留茬高度为20cm，收获后立即揉丝，其化学成分见表5。分别添加等量乳酸菌后的样品按照500g/袋的标准装入聚乙烯塑料袋，用真空机进行真空密封。每个添加剂处理有6袋，于室温下保存。取厌氧发酵75d的样品1kg，按照500kg/m

表5.青贮原料的化学成分

4杂交象草青贮品质检测

4.1化学和发酵品质分析

取200g原料及发酵后的样品，在65℃下干燥72h，称重测量干物质(DM)含量；将干燥后的样品研磨并通过1mm的筛。粗蛋白(CP)的含量采用凯氏定氮法测定，可溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮比色法进行测定；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量按照范氏纤维法测定。

取20g样品加入180mL无菌水在4℃过夜，用4层无菌纱布过滤，用雷磁PHS-3C精密pH计测定滤液pH，取4mL滤液在4℃以12000×g离心10min后过0.22μm的有机系滤膜，(SHIMADZE-10A型高效液相色谱仪分析，色谱柱：ShodexRspak KC-811S-DVB gel Column300×8mm，检测器：SPD-M10AVP，流动相：3mmol/L高氯酸，流速：1mL/min，进样量：5μL，柱温：50℃，检测波长：210nm)测定有机酸(LA、AA、PA和BA)含量。另取4mL滤液加入1mL三氯乙酸(TCA)，在4℃储存过夜以沉淀蛋白质，所得溶液在12 000×g下离心15min获取上清液，采用苯酚-次氯酸钠法测定NH

4.2有氧稳定性及AFB1含量分析

取上述3中室温暴露的样品，使用温度记录器，每5min一次，连续记录有氧暴露过程中核心区域的温度，估计有氧稳定性。称取5g干燥样品，加入25mL混合溶剂(V乙腈/V水/V乙酸＝79/20/1)，将样品剧烈摇匀2min后离心5min(转速：4000rpm/min)，上清液过0.22μm膜，采用高效液相色谱法分析AFB1含量。

4.3微生物群落分析

4.3.1微生物分离培养

采用平板计数法进行微生物计数。在无菌环境称取20g青贮原料及各时间点发酵样品加入180mL无菌生理盐水(NaCL 0.85％)，4℃震荡摇匀1h后用双层消毒纱布过滤，滤液用无菌水进行10

4.3.2微生物基因组高通量测序

4.3.2.1DNA提取和PCR扩增

取青贮样品50g冻干粉碎后过40mm筛，取子样品5g室温球磨1min。用TIANamp细菌DNA分离试剂盒(DP302-02)提取样品中的细菌DNA。用1％琼脂糖凝胶电泳和分光光度法(光密度比为260/280nm)检测提取的DNA的质量，并通过DNA试剂盒柱(DP214-02)纯化所有DNA样品，取适量的样品于离心管中，用无菌水稀释样品至1ng/μL并保持在-20℃直至进一步分析。

以稀释后的基因组DNA为模板，使用特异性引物515F(5’-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)扩增出16S rRNA的V3～V4区的基因。PCR产物使用2％浓度的琼脂凝胶电泳检测；对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

4.3.2.2高通量测序

使用

5结果分析

5.1青贮化学成分检测

表6.青贮75d后不同处理青贮饲料的营养成分

注：不同的小写字母表示不同添加剂之间差异显著，不同的大写字母表示不同贮藏温度之间差异显著(P<0.05)。“CK”、“LG608”和“LP”分别表示“无添加”、“添加鼠李糖乳杆菌LG608”和“添加商业植物乳杆菌”。“T”、“A”和“T×A”分别表示贮藏温度、乳酸菌添加剂和二者互作对青贮饲料的影响，“*”和“**”分别表示有显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)影响，“NS”表示无显著影响，下同。

表6可以看出，乳酸菌添加剂对青贮饲料CP、NDF和ADF含量有显著影响，LG608处理的ADF含量显著高于CK和LP处理(P<0.05)；LT贮藏时LG608处理的CP含量较CK升高2.7mg/kg且差异显著(P<0.05)。

5.2青贮发酵品质

表7.发酵75d后青贮发酵品质和主要微生物数目

青贮发酵75d时饲料的发酵品质及微生物数目如表7所示，各处理的pH均低于4.2，AN/TN值和BA含量分别低于10％和10mg/g，属于良好发酵的饲料。乳酸菌添加剂对除LA含量外的各指标均有显著影响(P<0.05)。与CK相比，LG608处理的AN/TN值、PA和BA含量以及LA/AA的值分别显著下降19.86％、12.46％、29.73％和9.45％，AA含量显著升高11.31％(P<0.05)。与LP处理相比，LG 608处理的AA含量、LAB数目显著升高，PA、BA含量和酵母菌数目显著下降(P<0.05)。从整个发酵过程来看，HT处理中CK和LG 608处理的LA、AA和PA含量都呈现出不断上升的趋势，其他处理则无明显的变化趋势。

5.3青贮饲料有氧稳定性

5.3.1青贮饲料有氧暴露5d的发酵品质

表8.有氧暴露5d青贮饲料发酵品质和主要微生物数目

由表8可知，有氧暴露5d后，乳酸菌添加剂和青贮温度显著影响了杂交狼尾草的好氧发酵，乳酸菌添加剂显著影响了有氧暴露5d后青贮饲料的有机酸含量、AN/TN的值以及LAB、酵母菌和霉菌的数目，LG 608处理的AA、PA含量和LAB数目显著高于CK和LP，BA含量和酵母菌数目显著低于CK和LP(P<0.05)。

5.3.2杂交象草青贮饲料的有氧稳定性

由图1可知(注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05))，HT贮藏组中CK、LG608和LP处理的有氧稳定性分别为24.50h、29.00h和21.75h；LT贮藏组CK、LG 608和LP处理的有氧稳定性分别为25.80h、31.85h和25.30h。综上，LG 608处理的青贮饲料在厌氧发酵过程中升温过程更为缓慢，无论是在HT贮藏还是在LT贮藏，其有氧稳定性都显著高于CK处理和LP处理；添加LP的青贮饲料有氧稳定性低于CK和LG 608处理；HT贮藏组青贮饲料的有氧稳定性低于LT贮藏组的青贮饲料。

5.3.3青贮饲料有氧暴露5d后黄曲霉毒素B1含量

由图2可知，温度和添加剂均显著影响了黄曲霉毒素B1含量，有氧暴露后黄曲霉毒素B1含量显著上升(P<0.05)。在HT贮藏组中，青贮75d时LG 608处理的黄曲霉毒素B1含量为9.64μg/kg，与CK没有显著差异，但显著低于LP处理(P<0.05)；有氧暴露5d后，CK、LG 608和LP处理的黄曲霉毒素B1含量分别升高了129.85％、60.23％和72.46％，其中LG 608处理在有氧暴露后黄曲霉毒素B1含量显著低于CK和LP(P<0.05)。在LT贮藏组中，青贮75d时LP处理的黄曲霉毒素B1含量为7.04μg/kg显著低于其余处理(P<0.05)；有氧暴露5d后，CK、LG 08和LP处理的黄曲霉毒素B1含量分别升高137.37％、74.99％和223.01％，其中LG608处理的黄曲霉毒素B1含量最低(20.26μg/kg)，且显著低于CK和LP(23.08μg/kg和22.75μg/kg,P<0.05)。

有氧暴露5d后黄曲霉毒素B1的积累量如图3所示，添加剂和贮藏温度都显著影响了黄曲霉毒素B1在有氧暴露期间的积累量(P<0.05)。添加LG 608的处理在HT贮藏组和LT贮藏组中有氧暴露期间黄曲霉毒素B1的增量分别为5.80和8.68μg/kg，均显著低于CK和LP处理(P<0.05)。HT贮藏组中CK处理在有氧暴露期间黄曲霉毒素B1的积累量增长最多(10.40μg/kg)，LP处理在LT贮藏组中增长最多(15.71μg/kg)。此外，HT贮藏组的黄曲霉毒素B1增量均显著低于LT贮藏组(P<0.05)。

5.3.4青贮饲料厌氧发酵75d后微生物在种水平的群落结构

添加鼠李糖乳杆菌LG608的杂交象草青贮进行厌氧发酵75d后，对其微生物种水平的群落结构进行检测，由图4可知，无论是LT处理组，还是HT处理组，青贮饲料中微生物在种水平上均未检测到金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和李斯特菌三种致病菌，说明本发明添加了鼠李糖乳杆菌LG608后的青贮可以有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和李斯特菌。其中，青贮微生物群落中布赫内氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌处于优势地位，乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)是青贮过程中最常见微生物，可以产生LA抑制微生物活动。

综上所述，在高温高湿地区，不推荐植物乳杆菌作为象草青贮添加剂，但鼠李糖乳杆菌LG 608可以作为一个候选菌株，提高象草青贮的有氧稳定性，抑制高温潮湿地区青贮象草中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和李斯特和黄曲霉毒素B

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。