检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法。

背景技术

伤寒是由一种肠道沙门氏菌伤寒杆菌(Salmonella Typhi,S.Typhi)感染引起的全身性发热疾病，主要出现于欠发达国家或发展中国家的贫困地区人口中，当今仍是一个重要的公共卫生问题。伤寒沙门氏菌通过受污染的水或食物经粪-口途径传播，通常与不良的卫生条件和卫生习惯有关。

在全球范围内，最新估计每年存在1100万至1800万的伤寒感染负担，感染人群以学龄或学龄以下的儿童为主。伤寒是许多欠发达国家或发展中国家贫困地区中最常见的菌血症病因之一，大多数病例起源于南亚次大陆，然而在这些国家内，疾病负担的分布往往是不均匀的，卫生条件差的地区受影响最大。在大多数发达国家，改善卫生基础设施可明显减轻疾病负担，但为改善水和卫生设施而发展适当的基础设施需要大规模投资，对于欠发达国家或发展中国家贫困地区的人口来讲，这是一个遥远的目标，因此在欠发达国家或发展中国家贫困地区进行疫苗接种仍然是最经济有效的解决方法。

非劣效原则以及免疫学方法的检测指标替代疫苗临床效力判定终点已经应用于新的疫苗审批中。因此建立标准化的、国际上认可的免疫学检测方法对疫苗的研发具有重要意义。常用的免疫学方法分为两种：血清抗体浓度检测(酶联免疫吸附测定)和血清抗体的体外杀菌功能检测。

血清抗体的体外杀菌功能检测通常包括血清杀菌试验和调理吞噬杀菌试验两种方式，通常，血清杀菌试验通常用于革兰氏阴性菌，而调理吞噬杀菌试验通常用于革兰氏阳性菌。血清杀菌试验和调理吞噬杀菌试验在补体激活途径中存在一定差异。具体而言，血清杀菌试验主要通过补体激活一系列酶和蛋白质反应来形成膜攻击复合体(MembraneAttack Complex，MAC)，最终导致微生物细胞膜的破坏。这个过程是在体液免疫中发挥作用的，而不是直接涉及免疫细胞；而调理吞噬杀菌试验则是免疫细胞通过表面上的受体识别和定位外部的微生物。这些受体与微生物表面的分子结合，触发吞噬的起始过程。一旦微生物被识别，免疫细胞通过细胞膜的变形将其包裹在一个称为吞噬囊的膜囊中。吞噬囊内含有蛋白酶、核酸酶和脂肪酶等消化物质，这些消化物质通过调控酸性环境和产生氧自由基等方式协同作用以杀死或分解微生物。

肠道沙门氏菌伤寒杆菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌的结构中存在脂多糖(LPS)，即通常所说的内毒素。脂多糖具有高抗原性，会引起强烈的免疫反应。当将调理吞噬杀菌试验应用于革兰氏阴性菌时，革兰氏阴性菌会在试验过程中被更快地吞噬和杀死，不易得到稳定的试验方法，因此调理吞噬杀菌试验更常用于革兰氏阳性菌，以便更稳定地控制试验的过程。

在该领域研究中，还尚未确定伤寒结合疫苗的保护相关因素或替代物，同时没有检测伤寒疫苗的血清抗体的体外杀菌功能的方法。而判断伤寒疫苗诱导的杀菌指数有着重要的意义，至今还没有杀菌指数的检测方法应用于实际临床检测评价中。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明创造性地将调理吞噬杀菌试验应用于革兰氏阴性菌伤寒杆菌，并通过调整试验条件，得到稳定的试验方法，以便快速、准确地计算出伤寒疫苗诱导的调理杀菌指数，从而有效评估伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌水平。

本发明提供了一种检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法。具体而言，本发明提供了：

(1)一种检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法，包括采用调理吞噬杀菌试验检测所述伤寒疫苗免疫血清对伤寒杆菌的体外杀菌功能，其中在完成所述调理吞噬杀菌试验的吞噬杀菌步骤后，在7.5至9.5的pH下培养经过所述吞噬杀菌步骤的伤寒杆菌。

(2)根据(1)所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

1)对所述伤寒疫苗免疫血清进行补体灭活和稀释，得到稀释的灭活血清；

2)将所述稀释的灭活血清与伤寒杆菌混合孵育，得到经调理的混合菌液；

3)将吞噬细胞、补体与所述经调理的混合菌液混合孵育，得到经杀菌的混合菌液；

4)在培养基中，在35℃至37℃且7.5至9.5的pH下培养所述经杀菌的混合菌液12小时至18小时；以及

5)对菌落进行计数，根据经过上述步骤2)至4)的伤寒杆菌的生长情况确定所述伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能。

(3)根据(2)所述的方法，其中在步骤1)中，所述补体灭活的温度为56℃，时间为30分钟至60分钟。

(4)根据(2)所述的方法，其中在步骤1)中，将所述血清稀释2至150000倍。

(5)根据(2)所述的方法，其中在步骤2)中，进行所述混合孵育的伤寒杆菌的光密度OD

(6)根据(2)所述的方法，其中在步骤2)中，所述混合孵育的时间为30分钟至60分钟，温度为20℃至25℃。

(7)根据(2)所述的方法，其中在步骤3)中，所述吞噬细胞为经诱导分化后的HL60细胞。

(8)根据(2)所述的方法，其中在步骤3)中，所述吞噬细胞的浓度为1×10

(9)根据(2)所述的方法，其中在步骤3)中，所述混合孵育在35℃至37℃下进行0.5小时至3小时，优选进行1.5小时至3小时。

(10)根据(2)所述的方法，其中在步骤2)和3)中，所述稀释的灭活血清被伤寒杆菌、吞噬细胞、补体的溶液进一步稀释，使得所述稀释的灭活血清具有最终稀释倍数，在步骤5)中，将获得50％杀菌率时的血清的最高所述最终稀释倍数作为所述伤寒疫苗免疫血清的调理杀菌指数。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明的方法打破了伤寒疫苗血清学评价领域内对于革兰氏阴性菌常规选择血清杀菌试验来评价其血清体外杀菌功能的惯性思维，首次创造性地将调理吞噬杀菌试验应用于革兰氏阴性菌伤寒杆菌，并有效且准确地评估了伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌水平，填补了全球领域内仅使用酶联免疫吸附测定(ELISA)评估伤寒疫苗效果的空缺，提供了伤寒疫苗血清学评价领域内的新的体外杀菌功能检测方法。

此外，本发明巧妙地改进了调理吞噬杀菌试验的条件，将经过吞噬杀菌步骤的伤寒杆菌的培养生长环境的pH调整为7.5至9.5，从而使得菌落形态更为清晰，能够通过平板菌落计数法对菌落进行计数，该计数方式快速、简便易行，并且能够直观且准确地体现菌落数目，从而提高了检测方法的可靠性、准确性和检测速度。

附图说明

图1为改变吞噬杀菌时间及振荡条件的调理吞噬杀菌试验样品照片。每列从右到左分别为CTA、CTB、样品5(免疫后)、样品5(免疫后)；每列从上到下的血清最终稀释倍数分别为437400倍、145800倍、48600倍、16200倍、5400倍、1800倍、600倍、200倍。

图2为是否添加三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)的调理吞噬杀菌试验样品照片，图A为调理吞噬杀菌试验不加Tris碱的情况，图B为调理吞噬杀菌试验加Tris碱的情况。每列从右到左分别为CTA、CTB、样品3(免疫后)、样品3(免疫后)；每列从上到下的血清最终稀释倍数分别为437400倍、145800倍、48600倍、16200倍、5400倍、1800倍、600倍、200倍。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

在调理吞噬杀菌试验中，调理物质主要是指IgG抗体和C3b补体分子。调理物质中的C3b补体分子与细菌结合产生C3b-细菌复合物，C3b-细菌复合物可以与巨噬细胞的C3b受体结合，从而促进巨噬细胞对细菌的吞噬；同时，调理物质中的IgG抗体也可以与巨噬细胞的Fc受体结合，从而提高细胞被吞噬的效率。

如本申请中所使用的术语“调理杀菌指数”代表伤寒疫苗诱导的体外杀菌功能强度的数值，其能够反映伤寒疫苗诱导的特异性杀菌能力的强弱。

为了快速且准确地检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能，本发明的发明人首次提出将调理吞噬杀菌试验应用于伤寒杆菌，并将伤寒疫苗诱导的调理杀菌指数作为评价伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的主要指标。

在本发明的研究中发现，诸如伤寒杆菌之类的革兰氏阴性菌在进行调理吞噬杀菌试验时存在不稳定性问题，针对该问题，本发明的发明人通过调整试验条件，并且巧妙地将经过吞噬杀菌步骤的伤寒杆菌的培养生长环境的pH调整为7.5至9.5，从而显著提高了调理吞噬杀菌试验对于伤寒杆菌的检测方法的适用性。此外，本发明的检测结果具有高的准确性且简便易行。

由此，本发明提供了一种检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法，该方法包括采用调理吞噬杀菌试验检测伤寒疫苗免疫血清对伤寒杆菌的体外杀菌功能，其中在完成调理吞噬杀菌试验的吞噬杀菌步骤后，在7.5至9.5的pH下培养经过所述吞噬杀菌步骤的伤寒杆菌。

在调理吞噬杀菌试验中，当使用常规培养基(pH值为约7.0)培养经过吞噬杀菌步骤的伤寒杆菌时，伤寒杆菌的生长情况十分不稳定，因此造成试验结果重复性差。出乎意料的是，本发明的发明人发现，当将培养基的pH值调整为7.5至9.5时，经过吞噬杀菌步骤的伤寒杆菌的生长情况稳定且良好，菌落形态更为清晰，仅使用简单的平板菌落计数法即可对菌液中的剩余菌落进行计数，并且试验结果具有良好的稳定性和准确性。当培养基的pH为9.5以上时，会抑制细菌生长。

在本发明的一些实施方案中，检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法包括以下步骤：1)对伤寒疫苗免疫血清进行补体灭活和稀释，得到稀释的灭活血清；2)将所述稀释的灭活血清与伤寒杆菌混合孵育，得到经调理的混合菌液；3)将吞噬细胞、补体与所述经调理的混合菌液混合孵育，得到经杀菌的混合菌液；4)在培养基中，在35℃至37℃且7.5至9.5的pH下培养所述经杀菌的混合菌液12小时至18小时；以及5)对菌落进行计数，根据经过上述步骤2)至4)的伤寒杆菌的生长情况确定所述伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能。

在步骤1)中，将伤寒疫苗免疫血清中的补体灭活的目的在于避免血清中存在的补体发挥作用，从而对模拟体外杀菌试验的结果产生影响。将伤寒疫苗免疫血清中的补体灭活的温度优选为56℃，时间优选为30分钟至60分钟。在一个优选的实施方案中，将伤寒疫苗免疫血清中的补体灭活的温度为56℃，时间为30分钟。

将伤寒疫苗免疫血清中的补体灭活可在预定温度的水浴、油浴、恒温箱或本领域已知的任何恒温设备中进行。在一个优选的实施方案中，将伤寒疫苗免疫血清中的补体灭活可在56℃的水浴中进行。

可将经过补体灭活的血清稀释合适的倍数A，使补体灭活的血清的浓度为初始浓度的1/A。对补体灭活的血清进行稀释的目的是将杀菌率为50％时的血清稀释倍数控制在试验所涉及的范围之内。本领域技术人员能够根据补体灭活的血清的杀菌情况(例如通过预实验结果等)确定合适的稀释倍数。在本发明的优选实施方案中，补体灭活的血清的稀释倍数A可为2至150000倍，优选稀释50至110000倍，例如稀释200至80000倍、稀释500至50000倍。由于血清样品存在个体差异，在一些情况中，也可以不对血清进行稀释，即，使用原倍的补体灭活的血清。当补体灭活的血清的稀释倍数A大于150000时，即稀释后浓度为初始浓度的1/150000时，对伤寒杆菌的调理吞噬杀菌效果变得不明显。

优选地，在步骤2)的调理过程中，进行混合孵育的伤寒杆菌的光密度OD

在步骤2)的调理过程中，稀释的灭活血清和伤寒杆菌的体积比的范围优选为1.5:1至2.5:1，更优选的体积比为2:1。可使用本领域已知的任何混匀装置将稀释的灭活血清与伤寒杆菌混合。

在本发明的优选实施方案中，在步骤2)的调理过程中，混合孵育的时间(即，调理时间)为30分钟至60分钟；混合孵育的温度(即，调理温度)为室温，特别是20℃至25℃。

在本发明的一些实施方案中，可使用摇床进行本发明的步骤2)的混合，混合速度可为400rpm至800rpm，优选为450rpm。在一个优选的实施方案中，使用数显摇床进行本发明的步骤2)，混合速度为450rpm，调理时间为30分钟。

在步骤3)中，吞噬细胞优选为经诱导分化后的HL60细胞。在本发明的一些实施方案中，可通过本领域已知的常规方法使HL60细胞分化以得到分化后的HL60细胞，并用于本发明的调理吞噬杀菌试验。

在本发明的优选实施方案中，吞噬细胞的浓度为1×10

在本发明的方法中，添加补体的目的在于，补体为调理吞噬杀菌试验杀菌所必须，并可控制体外杀菌的补体条件相同以进行试验结果的比较和分析。在本发明一个实施方案中，调理吞噬杀菌试验中添加的补体可为乳兔补体。尽管在本发明的实施方案中使用的是乳兔补体，但本领域技术人员知晓，也可以使用其他合适的补体进行根据本发明的方法，只要其能够促进巨噬细胞吞噬并杀死伤寒杆菌即可。

在本发明的一些实施方案中，步骤3)的杀菌在35℃至37℃、5％CO

在步骤4)中，最优选地，所述培养基的pH值为8.0。

在步骤5)中，优选使用平板菌落计数法对菌液中的菌落进行计数。

在本发明的一些实施方案中，在步骤2)和3)中，稀释的灭活血清被伤寒杆菌、吞噬细胞、补体的溶液进一步稀释，使得稀释的灭活血清具有最终稀释倍数B，将获得50％杀菌率时的血清的最高最终稀释倍数B作为调理杀菌指数。在本发明的优选实施方案中，将获得50％杀菌率时的血清的最高最终稀释倍数B作为伤寒疫苗免疫血清的调理杀菌指数。

在本发明的一个实施方案中，杀菌率的计算公式如下：

杀菌率＝(1-样品孔中存活的伤寒杆菌菌落数目/CTB中存活的伤寒杆菌菌落数目)×100％

其中，CTB表示对照样品B，使用根据本发明的检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法进行制备，不同之处在于，CTB的制备过程不添加伤寒疫苗免疫血清。也就是说，CTB的制备过程使用伤寒杆菌、吞噬细胞和补体。

此外，本发明的方法还通过非特异性杀菌率评估试验结果的准确性和可靠性。非特异性杀菌率的计算公式如下：

非特异杀菌率＝(1-CTB中存活的伤寒杆菌菌落数目/CTA中存活的伤寒杆菌菌落数目)×100％

其中，CTB与前述定义相同，CTA表示对照样品A。CTA的制备过程也不添加伤寒疫苗免疫血清，而使用伤寒杆菌、吞噬细胞和灭活的补体。当非特异杀菌率为30％以下时，试验结果方能使用。

在本发明的一些实施方案中，伤寒疫苗免疫血清为伤寒疫苗免疫人后血清。

在本发明的优选的具体实施方案中，根据本发明的检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法包括以下步骤：

1)将伤寒疫苗免疫人后血清置于56℃水浴中30分钟以进行补体灭活，将灭活血清稀释A倍，得到稀释的灭活血清，其中A为50至110000；

2)将稀释的灭活血清与伤寒杆菌在多孔培养板中、于室温(例如20℃至25℃)进行混合孵育30分钟，得到经调理的混合菌液。培养板每孔(约1mL混合菌液)的伤寒杆菌的数目为40000-96000个/mL(例如，伤寒杆菌的数目可为46750个/mL)，并且每孔的稀释的灭活血清和伤寒杆菌的体积比为2:1，其中，稀释的灭活血清由于添加伤寒杆菌而被进一步稀释；

3)将分化后的HL60细胞、乳兔补体与经调理的混合菌液在37℃、5％CO

4)在培养基中，在37℃、5％ CO

5)对菌落进行计数，计算试验中培养板每孔的杀菌率，将获得50％杀菌率时的灭活血清的最高最终稀释倍数B作为伤寒疫苗免疫人后血清的调理杀菌指数。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

实施例中所用材料、试剂和仪器来源如下：

a.细胞：HL60细胞，来源于美国典型菌种保藏中心(简称为ATTC)；

b.伤寒杆菌：来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)；

c.平板培养基：当总体积为800mL时，加入24g托德-休伊特肉汤(Todd-Hewittbroth，简称为THB)，12g酵母粉，12g琼脂，TTC储备液(添加量为培养基体积的1/2000至1/4000，即TTC储备液添加体积为400μL至200μL)。高压灭菌(115℃，30分钟)后冷却至56℃，使用三羟甲基氨基甲烷(Tris碱，购自Sigma-Aldrich，货号SLBQ4845V，浓度为1mol/L)调整pH为7.5至9.5，倒入方形培养皿待用，每个方形培养皿13mL至15mL；

d.TTC储备液：2,3,5,-三苯基氯化四氮唑(简称为TTC)1.25g，加水至40mL，待其完全溶解后，补足水至50mL，用0.22μm滤膜过滤后备用。由此获得TTC储备液，添加至培养基时直接取相应体积的TTC储备液进行添加；

e.HL60细胞增殖用CM1培养基：RPMI 1640 500mL，添加GlutaMax 5.7mL，胎牛血清57mL，2～8℃保存；

f.HL60细胞分化用CM2培养基：RPMI1640 500mL，添加GlutaMax 5.7mL，胎牛血清57mL，DMF 4mL，2～8℃保存；

g.HL60细胞复苏用CM3培养基：RPMI1640 500mL，添加GlutaMax 6.4mL，胎牛血清128mL，2～8℃保存；

h.明胶溶液(1％)：明胶0.5g，加水至50mL，高压灭菌(115℃，30分钟)后备用，室温保存；

i.调理吞噬缓冲液(Opsonization Buffer，OB缓冲液，含Ca

j.调理吞噬缓冲液(OB缓冲液，不含Ca

k.数显摇床(迷你轨道摇床，型号为7644-20115，购自Bellco Biotechnology)

l.补体：乳兔补体，购自青岛中创汇科生物科技有限公司，商品批号：21072203、21072117、21072111、21072116、21072202、21072209、21072313、21072312、21072214、21072206、21072217、21072301、21072310、21072116、21072211、21072115、21072307、21072309、21072306、21072305、21072302、21072303、21072308、21072311。

m.伤寒疫苗免疫人前/后血清样品：来源于批准号为2006L01307的药物临床试验。

实施例1：伤寒疫苗免疫人后血清的调理吞噬杀菌试验

1.伤寒疫苗免疫人后血清的补体灭活和稀释

将伤寒疫苗免疫人后血清样品常温解冻后，置于56℃水浴中30分钟，从而使血清中的补体灭活。

将补体灭活后的伤寒疫苗免疫人后血清样品按照表1所示的分配方案添加至96孔U型底组织培养板中，并用OB缓冲液稀释相应的倍数，添加至96孔U型底组织培养板中的稀释的血清样品为每孔14μL。

表1.96孔U型底组织培养板中的样品稀释分配方案(本实验使用来源于5个人的血清样品，分别为样品1至5，其中每个样品分为免疫前血清和免疫后血清)

注：3-12列示出了各血清样品的稀释倍数；CTA为对照样品A：含有伤寒杆菌+吞噬细胞+灭活的乳兔补体(将乳兔补体置于56℃水浴30分钟进行灭活)；CTB为对照样品B：含有伤寒杆菌+吞噬细胞+未灭活的乳兔补体。

2.伤寒杆菌的处理及调理

从-80℃冰箱中取出伤寒杆菌(500μL/支)，立即置于37℃水浴融化，待融化后离心(12500rpm，2min)，结束后弃去上清，加入500μL OB缓冲液(含Ca

将数目为46750个/mL(OD值为约0.8)的伤寒杆菌以7μL/孔添加至上述步骤1中的96孔U型底组织培养板中，使用数显摇床以450rpm孵育30分钟。

3.吞噬杀菌

HL60细胞按照以下步骤进行处理和分化：

(1)HL60原代细胞的处理和储存

监测组织培养箱中的CO

原代HL60细胞库存的可接受标准如下：

a.没有污染，包括支原体培养。

b.培养物符合HL60细胞的显微特征(如细胞大小、形态变化等)。

c.妥善保存来源文件。

(2)工作HL60细胞的使用

为了适当保持工作HL60细胞的培养和细胞的完整性，按照以下方法严格控制细胞浓度和质量。在4个月(约48传代)后废弃HL60细胞，并解冻新的冷冻HL60原代细胞以用于试验。

a.周一：在每个150平方厘米的细胞培养瓶中加入40mL新鲜的CM1(用于增殖的培养基)，使最终体积达到120mL/瓶。进样前每个培养瓶中有80mL。细胞浓度应为3×10

b.周三：混合培养瓶内容物，从每个培养瓶中取出80mL(每个培养瓶中剩余40mL)。取出的细胞汇集起来用于分化。向每个培养瓶中的剩余细胞中加入80mL新鲜CM1，使最终体积达到120mL/培养瓶。细胞浓度应为约3×10

c.周五：混合培养瓶内容物并去除100mL(每个培养瓶剩余20mL)。取出的细胞汇集后用于分化。向每个培养瓶中的剩余细胞中加入60mL新鲜CM1，使最终体积为80mL/培养瓶。细胞浓度应为2×10

(3)HL60细胞的分化

按上述方法常规收集HL60细胞，将收集的HL60细胞轻轻地重新悬浮。使用CM2培养基将浓度调整至4×10

在周三或周五进行分化。分化后第5天或第6天的HL60细胞用于OPA试验(检测伤寒疫苗免疫血清的体外杀菌功能的方法)。分化6天以上的HL60细胞应直接丢弃。

通过台盼兰色或碘化丙啶染色方法检测分化的HL60细胞的存活率。通过流式细胞仪监测普通HL60细胞和分化的HL60细胞表面表达的标记物(CD11b、CD35和CD71)。

分化的HL60细胞作为检测效应细胞的可接受标准如下：

a.培养物符合分化的HL60细胞的显微特征(如细胞大小、形态变化等)。

b.细胞存活率≥90％(台盼兰色法)或≥65％(碘化丙啶染色法)。

c.总细胞数的≥55％表达CD35。

d.总细胞数的≤20％表达CD71。

e.在流式细胞术中定义为Annexin V+/PI-的凋亡细胞≤细胞总数的25％。

将分化后的HL60细胞离心(1500rpm，5min)，弃去上清，重悬于50mL不含Ca

同时，以相同操作配制CTA对照和CTB对照，不同之处在于，CTA对照不添加血清，吞噬杀菌步骤添加的乳兔补体为灭活补体，CTA对照包含伤寒杆菌、吞噬细胞和灭活补体；CTB对照不添加血清，CTB对照包含伤寒杆菌、吞噬细胞和乳兔补体；使用与血清等体积的OB缓冲液(含Ca

在吞噬杀菌步骤后，96孔板的每个孔实际包含14μL稀释的血清、7μL伤寒杆菌、35μL乳兔补体与吞噬细胞的混合液(包含7μL乳兔补体和28μL吞噬细胞)，总体积为56μL。因此，最初体积为14μL的稀释的血清被进一步稀释4倍，血清的最终稀释倍数如下表2所示。

表2.96孔U型底组织培养板中的血清最终稀释倍数

4.存活菌培养

使用8道移液枪每孔吸取10μL经杀菌的混合菌液点种在平板培养基(pH 8)表面，倾斜流淌，流淌长度控制在约1cm至1.5cm，且不互相接触。每块平板共32条菌液，待菌液干燥后倒置平板，并置于37℃、5％ CO

5.菌落计数和数据分析

次日取出培养后平板，使用全自动菌落分析仪(型号为ProtoCOL，购自Synbiosis公司)对平板上的菌落进行计数。通过杀菌率计算公式计算每个样品的杀菌率。表3示出了样品1-5的剩余菌落数统计(每个样品至少进行2组平行实验)。

表3.通过全自动菌落分析仪测得的剩余菌落数值

根据表3所示的剩余菌落数测定结果，通过以下公式计算杀菌率。

杀菌率＝(1-样品孔中存活的伤寒杆菌菌落数目/CTB中存活的伤寒杆菌菌落数目)×100％

将获得50％杀菌率时的血清的最高最终稀释倍数作为伤寒疫苗免疫血清的调理杀菌指数。

以样品1(免疫后)为例计算的杀菌率及调理杀菌指数结果如表4所示。在该试验中，使用CTB作为对照样品，通过全自动菌落分析仪测得的剩余菌落数为69.25个。对于样品1(免疫后)的血清样品在某些稀释倍数时的剩余菌落数大于70个的情况，本领域技术人员可以理解，这是菌落生长及计数实验中存在的误差，将这些情况下的杀菌率记为～0％，即对菌落生长无明显抑制作用。

如果在最终倍比稀释的血清样品中包括杀菌率为50％的数据点，则该血清的最终稀释倍数值可作为调理杀菌指数。如果在最终倍比稀释的血清样品中不包括杀菌率为50％的数据点，则通过线性内插法计算调理杀菌指数。现以样品1(免疫后)为例进行说明，首先选择杀菌率为50％以上(5400倍，杀菌率为78.26％)和以下(16200，杀菌率为～0％)的两个最终稀释倍数值5400和16200，将它们取对数以得到相应的Log(最终稀释倍数的Log值)。以Log为横坐标，以杀菌率为纵坐标做点图，将两点求线性回归以获得直线，在该直线上确定纵坐标为杀菌率50％的数据点的横坐标Log值，对该Log值取反对数，即获得杀菌率50％时的血清最终稀释倍数值，即为调理杀菌指数。

表4.样品1(免疫后)的调理杀菌指数计算结果

使用与样品1相同的计算方法，计算了样品2至5的调理杀菌指数，结果列于表5中。

表5.根据本发明的方法得到的调理杀菌指数结果

根据表5的结果，各免疫后血清样品的调理杀菌指数显著高于相应的免疫前血清样品的调理杀菌指数。通过肉眼观察免疫前后的体外杀菌情况(菌落生长情况)，以及通过计算得到的调理杀菌指数可知，免疫后和免疫前的调理杀菌指数有明显变化，说明对于伤寒疫苗临床试验，该方法可以作为测定功能抗体水平的方法。

实施例2至实施例14：吞噬杀菌时间及振荡条件对调理吞噬杀菌试验的影响

使用与实施例1相同的调理吞噬杀菌试验步骤和条件进行实施例2至实施例14(使用免疫后的血清样品5)，不同之处在于，改变了吞噬杀菌的时间以及是否进行振荡，具体条件(包括实施例1的)如表6所示。

表6.改变吞噬杀菌时间及振荡条件的调理吞噬杀菌试验

如图1所示，在实施例2至实施例8的调理吞噬杀菌试验中，吞噬杀菌时未进行振荡，这会导致结果较不准确，杀菌效果较差。在实施例1、9至14的调理吞噬杀菌试验中，吞噬杀菌时进行振荡，吞噬杀菌时间有所不同。研究发现，振荡使试验结果更为准确，杀菌效果更好；杀菌时间对试验结果有影响，如果杀菌时间过短，则反应不完全，所体现的不是真实的试验结果。因此，选择杀菌效果开始不发生变化的时间点作为试验的杀菌时间。通过上述实施例，发现吞噬杀菌2小时即可达到最佳效果，再延长杀菌时间也未观察到结果的显著变化，因此优选进行吞噬杀菌2小时。

实施例15：存活菌培养时的pH对调理吞噬杀菌试验的影响

使用与实施例1相同的调理吞噬杀菌试验步骤和条件进行实施例15(使用免疫后的血清样品3)，不同之处在于，在存活菌培养时使用的平板培养基中不添加Tris碱，此时的平板培养基pH为7.02-7.22。

如图2所示，根据实施例15的调理吞噬杀菌试验，不使用Tris碱将平板培养基的pH调整为8，则菌落轮廓清晰度变差，使菌落计数仪不容易进行识别。

相比之下，将pH调整为8的样品表现出更清晰的单个菌落轮廓，使菌落计数仪能够更准确地识别，从而提高试验结果的准确性。