一种盐酸普萘洛尔片中基因毒性杂质的检测方法

技术领域

本发明属于药品分析领域，尤其涉及一种盐酸普萘洛尔片中基因毒性杂质的检测方法。

背景技术

盐酸普萘洛尔片是一种β受体阻滞剂，可以拮抗交感神经兴奋和儿茶酚胺作用，适应症有高血压和劳力性心绞痛，也作为二级预防，降低心肌梗死死亡率。亚硝胺类杂质属于ICH M7(R1)(《评估和控制药物中DNA反应性(致突变)杂质以限制潜在致癌风险》)指南【1】中提及的“关注队列”物质。为了保证药品的安全和质量可控，必须实现有效的风险控制。依据相关文献获知，N-亚硝基普萘洛尔是盐酸普萘洛尔片制备中易产生的基因毒性杂质。

N-亚硝基普萘洛尔(N-Nitroso Propranolol)，化学名为N-(2-羟基-3-(萘-1-氧基)丙基)-N-异丙基亚硝酰胺，化学结构式为：

目前，几乎没有文献涉及盐酸普萘洛尔片中N-亚硝基普萘洛尔的检测，因此提供一种灵敏度高、专属性强的检测方法，实现对盐酸普萘洛尔片中基因毒性杂质的有效控制，保证其用药安全，具有重大的研究意义。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种盐酸普萘洛尔片中基因毒性杂质的检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种盐酸普萘洛尔片中基因毒性杂质的检测方法，包括如下步骤：

(1)以不同浓度的N-亚硝基普萘洛尔溶液为对照品，采用高效液相色谱质谱联用仪，记录对应的质谱图，并测试每个对照品的峰面积；

(2)以N-亚硝基普萘洛尔溶液的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(3)测试盐酸普萘洛尔片样品的峰面积，将其带入步骤(2)所述标准曲线中，计算得到盐酸普萘洛尔片中基因毒性杂质的含量。

优选的，步骤(1)中，N-亚硝基普萘洛尔溶液的浓度为0.5ng/mL～20.0ng/mL。

优选的，步骤(1)中，N-亚硝基普萘洛尔溶液按照如下方法制备得到：将N-亚硝基普萘洛尔加入到浓度为80％的甲醇溶液中，溶解配制成对应浓度的溶液。

优选的，步骤(1)中，高效液相色谱质谱联用仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的长度为150mm，直径为3.0mm，填料粒径为1.8μm。

优选的，步骤(1)中，高效液相色谱质谱联用仪的色谱柱温为45℃～55℃，更优选的为50℃。

优选的，步骤(1)中，高效液相色谱质谱联用仪的色谱的流动相由A相和B相按照30～45：70～55的体积比组成；A相为含浓度为0.009～0.011mol/L的甲酸铵和浓度为0.09～0.11％的甲酸的水溶液，B相为含浓度为0.09～0.11％的甲酸的甲醇溶液。

更优选的，A相为含浓度为0.01mol/L的甲酸铵和浓度为0.1％的甲酸的水溶液，B相为含浓度为0.1％的甲酸的甲醇溶液。

优选的，步骤(1)中，高效液相色谱质谱联用仪的色谱的流动相的流速为0.3～0.5mL/min，更优选的为0.4mL/min。

优选的，步骤(1)中，高效液相色谱质谱联用仪的色谱的进样量为1～20uL，更优选的为10uL。

优选的，步骤(1)中，高效液相色谱质谱联用仪的洗脱方式为梯度洗脱。

优选的，步骤(1)中，高效液相色谱质谱联用仪的质谱参数如下：毛细管电压为3500～4500V，干燥气温度为280～350℃，干燥气流量为10～15L/min，定量离子对为母离子m/z 289.00，子离子m/z 72.00。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS法)用于检测盐酸普萘洛尔片中N-亚硝基普萘洛尔的含量，能快速、准确地对盐酸普萘洛尔片及其原料中的基因毒性杂质进行测定，有效保证产品质量，降低用药风险。该方法专属性强，准确度和灵敏度高，且操作简便，适用于日常检测。

附图说明

图1为0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相B得到的MRM图。

图2为0.1％甲酸的甲醇溶液作为流动相B得到的MRM图。

图3为超纯水配制的流动相A得到的MRM图。

图4为屈臣氏饮用水配制的流动相A得到的MRM图。

图5为选择Agilent ZORBAX SB-C18 3.0×150mm，1.8μm为色谱柱得到的MRM图。

图6为选择Waters ACQUITY UPLC C18 3.0×150mm，1.7μm为色谱柱得到的MRM图。

图7为实施例【3.2线性】部分对应的线性图。

图8为实施例【3.5.2测定及接受标准】部分对应的测试结果对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

质量标准：

按照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)和质谱法(中国药典2020年版四部通则0431)测定。

对照品系列溶液：精密称取N-亚硝基普萘洛尔对照品适量，加入浓度为80％的甲醇溶液溶解并分别定量稀释制成每1mL中含N-亚硝基普萘洛尔0.5、1、2、5、10、20ng的溶液。

供试品溶液：取待测样品10片，精密称定，研细，混匀，精密称取细粉约440mg，置于5mL容量瓶中，加入浓度为80％的甲醇溶液稀释至刻度，涡旋5分钟，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如Agilent ZORBAX SB-C18 3.0×150mm，1.8μm或效能相当的色谱柱)，以0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液为流动相A，0.1％甲酸的甲醇溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速为0.40mL/min，柱温为50℃，进样体积为10μL。

表1梯度洗脱制度一览表

质谱条件：以三重四级杆串联质谱仪检测，采用电喷雾电离源(ESI)，使用正离子扫描模式，毛细管电压为4000V，干燥器温度为300℃。检测模式为多反应监测(MRM)，化合物的监测离子对参见表2。

表2监测离子对一览表

系统适用性要求：取浓度为1ng/mL的对照品溶液，重复进样6次，主峰面积的相对标准偏差不得过10.0％，浓度为0.5ng/mL的对照品溶液，所得主峰的信噪比应不低于10，分别取对照品系列溶液进样，以浓度对应峰面积绘制标准曲线，计算线性回归方程，R

测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱质谱联用仪，记录质谱图，量取峰面积，按标准曲线法计算，不得过盐酸普萘洛尔标示量的0.23ppm。

分析方法开发过程：

质谱条件方面，经过Scan全扫描(确定化合物质量数)-SIM选择离子监测(优化碎裂电压和碰撞池电压)-Product Ion Scan子离子扫描(优化碰撞能量)-MRM多反应监测(确认定量离子)整个逻辑顺序来建立QQQ参数。

色谱条件方面，常用的LC/MS溶剂一般为高质量的甲醇、乙腈、水和挥发性溶剂，所以选用0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液为流动相A，0.1％甲酸的甲醇溶液或者0.1％甲酸的乙腈溶液为流动相B，设置合适的流速和梯度洗脱。

图1为0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相B得到的MRM图，0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液(超纯水)作为流动相A，取对照品溶液(5ng/ml)，注入高效液相色谱质谱联用仪，记录质谱图。

图2为0.1％甲酸的甲醇溶液作为流动相B得到的MRM图，0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液(超纯水)作为流动相A，取对照品溶液(5ng/ml)，注入高效液相色谱质谱联用仪，记录质谱图。

参见图1～2，能够看到用乙腈配制的流动相B，峰型前沿明显，用甲醇配制的流动相B则峰形对称，所以选择1％甲酸的甲醇溶液作为流动相B。

质谱对水质要求较高，分别选用实验室纯水机制备的超纯水和屈臣氏饮用水配制流动相A。

图3为超纯水配制的流动相A得到的MRM图，0.1％甲酸的甲醇溶液作为流动相B，取超纯水，注入高效液相色谱质谱联用仪，记录质谱图。

图4为屈臣氏饮用水配制的流动相A得到的MRM图，0.1％甲酸的甲醇溶液作为流动相B，取屈臣氏饮用水，注入高效液相色谱质谱联用仪，记录质谱图。

参见图3～4，能够看出两者基线噪音相近，所以选择更便利和检测成本低的超纯水。

选择Agilent色谱柱和Waters色谱柱进行对比。

图5为选择Agilent ZORBAX SB-C18 3.0×150mm，1.8μm为色谱柱得到的MRM图，0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液为流动相A，0.1％甲酸的甲醇溶液为流动相B，取对照品溶液(10ng/ml)，注入高效液相色谱质谱联用仪，记录质谱图。

图6为选择Waters ACQUITY UPLC C18 3.0×150mm，1.7μm为色谱柱得到的MRM图，0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液为流动相A，0.1％甲酸的甲醇溶液为流动相B，取对照品溶液(10ng/ml)，注入高效液相色谱质谱联用仪，记录质谱图。

参见图5～6，能够看到Agilent色谱柱的峰响应更高，且同等条件下，Agilent色谱柱走样时的压力比waters色谱柱低200Bar左右，因此选用Agilent色谱柱。

分析方法验证

1.仪器、化学试剂及样品信息

1.1.仪器信息

表3为仪器信息统计表。

表3仪器信息一览表

1.2.试剂信息

表4为试剂信息统计表。

表4试剂信息一览表

1.3.样品信息

表5为样品信息统计表。

表5样品信息一览表

2.溶液配制

所有溶液在目标浓度和称量准确度符合要求的前提下，其体积均可放大或缩小以适应实际需要。

2.1流动相/稀释剂/空白溶液/空白辅料溶液

2.1.1流动相A：0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液

精密称取甲酸铵0.63g于试剂瓶中，加水1000ml使溶解，向其中加入1.0ml甲酸，混匀，超声脱气，即得。

2.1.2流动相B：0.1％甲酸的甲醇溶液

量取甲醇1000ml于试剂瓶中，向其中加入1.0ml甲酸，混匀，超声脱气，即得。

2.1.3稀释剂/空白溶液：80％甲醇

量取甲醇800ml和水200ml于同一试剂瓶中，混匀，即得。

2.1.4空白辅料溶液：称取盐酸普萘洛尔片辅料约400mg，置5mL容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，涡旋5分钟，滤过，取续滤液，即得。

表6为空白辅料成分统计表。

表6空白辅料成分一览表

2.2对照品系列溶液

表7为对照品系列溶液组成统计表。

表7对照品系列溶液组成一览表

3.验证项目

3.1重复性

3.1.1溶液配制

同“2.溶液配制”项下对照品溶液2。

3.1.2测定及接受标准

取对照品溶液2，重复进样6次，主峰面积RSD≤10.0％，保留时间RSD≤2.0％。

采用高效液相色谱串联质谱法

色谱条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 3.0×150mm，1.8μm

流动相A：0.01mol/L甲酸铵-0.1％甲酸的水溶液

流动相B：0.1％甲酸的甲醇溶液

洗脱方式：梯度洗脱(具体见表1)

流速：0.40mL/min

柱温：50℃

质谱条件为：

离子源及电离方式：ESI源，正离子模式

监测模式：MRM模式

毛细管电压：4000V

干燥气温度：300℃

干燥气流量：13L/min

测试记录见表8。

表8重复性测试结果一览表

3.2线性

3.2.1溶液配制

同“2.溶液配制”项下对照品系列溶液。

3.2.2测定及接受标准

取对照品系列溶液进样，以浓度对应峰面积绘制标准曲线，计算线性回归方程，R

测试记录见表9，对应的线性图见图7：

表9线性测试结果一览表

3.3定量限和检测限

3.3.1溶液配制

取“2.溶液配制”项下储备液2适量，用稀释剂逐步稀释至目标杂质S/N≈10时，作为定量限溶液；S/N≈3时，作为检测限溶液。

3.3.2测定及接受标准

LOQ应不得超过其限度的50％。

测试记录见表10：

表10定量限和检测限测试结果一览表

3.4准确度

3.4.1溶液配制

供试品溶液：取本品10片(参见1.3.样品信息)，精密称定，研细，混匀，精密称取细粉约440mg，置5ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，涡旋5分钟，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液：同“2.溶液配制”项下对照品溶液2、对照品溶液4、对照品溶液5。

加标供试品溶液：

低浓度：取本品的细粉约440mg，置5ml容量瓶中，加对照品溶液2稀释至刻度，涡旋5分钟，滤过，取续滤液，即得(平行配制三份)。

中浓度：取本品的细粉约440mg，置5ml容量瓶中，加对照品溶液4稀释至刻度，涡旋5分钟，滤过，取续滤液，即得(平行配制三份)。

高浓度：取本品的细粉约440mg，置5ml容量瓶中，加对照品溶液5稀释至刻度，涡旋5分钟，滤过，取续滤液，即得(平行配制三份)。

3.4.2测定及接受标准

九份加标供试品溶液的回收率应在70％～130％，且RSD≤10％。

测试记录见表11：

表11准确度测试结果一览表

注：PNH浓度为根据粉末称样量、平均片重和标示量计算出的API浓度。

3.5专属性

3.5.1溶液配制

空白辅料溶液：同“2.溶液配制”项下空白辅料溶液；

对照品溶液：同“2.溶液配制”项下对照品溶液5；

供试品溶液：同“3.4准确度”项下供试品溶液；

加标供试品溶液：同“3.4准确度”项下高浓度。

3.5.2测定及接受标准

空白辅料溶液对目标杂质的测定无干扰，供试品溶液和加标供试品溶液中目标杂质附近无相邻峰。

测试结果见图8，从图8中我们能够看出，本发明所述的测试方法具有较好的专属性。

3.6溶液稳定性

3.6.1溶液配制

对照品溶液：同“2.溶液配制”项下对照品溶液2；

供试品溶液：同“3.4准确度”项下供试品溶液；

3.6.2测定及接受标准

检测条件下，选取不少于3个时间点进行试验，各时间点测得浓度与0h测得浓度的比值在70％～130％之间。

测试记录见表12和表13：

表12对照品溶液稳定性测试结果一览表

表13供试品溶液稳定性测试结果一览表

参见表12～13，能够得出：本发明所采用的对照品溶液和供试品溶液的稳定性良好，用于检测溶液，保证了测量的准确性。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。