生脉饮五味子醇甲含量测定方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及生脉饮五味子醇甲含量测定方法。

背景技术

生脉饮现有标准执行2020年版《中国药典》一部中生脉饮标准，由红参、麦冬、五味子共3味中药组成，具有益气复脉、养阴生津的功效。而现行生脉饮质量标准中，对五味子醇甲含量测定中供试品溶液的制备，其操作步骤繁琐，耗时长，且制备过程会用到乙醚，乙醚具有特殊刺激性气味，具有麻醉作用，且对眼睛有刺激性。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供生脉饮五味子醇甲含量测定方法，对现有的生脉饮中五味子醇甲含量测定方法进行改进，能够同时兼顾到人身安全，并提高工作效率。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明实施例提供了生脉饮五味子醇甲含量测定方法，包括以下步骤：

对照品溶液(Ⅰ)的制备：精密称取五味子醇甲对照品10mg，置20ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含五味子醇甲0.5mg的溶液；

对照品溶液(Ⅱ)的制备：精密吸取对照品溶液(Ⅰ)3ml，置50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含五味子醇甲30ug的溶液；

供试品溶液(Ⅰ)的制备：精密称取供试品适量，置量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

空白溶液：取纯化水即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液(Ⅱ)与供试品溶液(Ⅰ)各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

在一些实施例中，液相色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水比例为56∶44为流动相；检测波长为250nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于2000。

在一些实施例中，还包括以下步骤：专属性实验：按照所述液相色谱条件试验，精密吸取空白溶液、流动相、70％乙醇、阴性样品、对照品溶液、供试品溶液(Ⅰ)各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。

在一些实施例中，还包括以下步骤：准确度：精密吸取生脉饮供试品2.5ml共6份，分别置25ml量瓶中，加入浓度为0.5214mg/ml五味子醇甲对照品溶液1.4ml，置上述25ml量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(Ⅱ)；计算回收率及其相对标准偏差，不得大于8％。

在一些实施例中，还包括以下步骤：精密度：按照所述液相色谱条件试验，精密吸取供试品5ml，置25ml容量瓶中，加70％乙醇稀释刻度，摇匀，即得，平行制备6份，计算含量及其相对标准偏差，不得大于8％。

在一些实施例中，还包括以下步骤：定量限：按照所述液相色谱条件试验，精密吸取浓度为30.81ug/ml的五味子醇甲对照品溶液1ml，置50ml容量中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，记录色谱图，计算此时的浓度。

在一些实施例中，还包括以下步骤：线性浓度溶液的制备：

线性浓度1：精密吸取对照品溶液(Ⅱ)1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲0.6162ug的溶液；

线性浓度2：精密量取对照品溶液(Ⅱ)5ml，置10ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲15.40ug的溶液；

线性浓度3：取对照品溶液(Ⅱ)，即得，30.81ug/ml的溶液；

线性浓度4：精密吸取对照品溶液(Ⅰ)2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲102.70ug的溶液；

线性浓度5：精密吸取对照品溶液(Ⅰ)5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲256.75ug的溶液；

线性浓度6：取对照品溶液(Ⅰ)，即得，513.5ug/ml的溶液；

按照所述液相色谱条件试验，精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程，相关系数R不得小于0.99。

在一些实施例中，还包括以下步骤：溶液稳定性：按照所述液相色谱条件试验，取生脉饮供试品混合均匀度溶液10ul，分别于0小时、3小时、8小时、12小时、16小时，记录色谱图，计算供试品溶液中五味子醇甲的含量，并计算相对标准偏差，不得大于8％。

在一些实施例中，还包括以下步骤：按照所述液相色谱条件试验，分别精密吸取供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法，计算供试品溶液中五味子醇甲的含量。

在一些实施例中，所述液相色谱条件中的色谱柱的规格为4.6mm*250mm*5um。

生脉饮口服液，其功能主治为：益气复脉，养阴生津。用于气阴两亏，心悸气短，脉微自汗。自投入市场以来，一直疗效确切、副作用小深受广大医生和患者的欢迎，市场前景良好。

生脉饮口服液按部颁标准中药成方制剂的制法，党参300g、麦冬200g、五味子100g以上三味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约300ml，放冷，加乙醇600ml，放置24小时，滤过，滤液减压浓缩成稠膏状，加水适量稀释，滤过，另加单糖浆300ml及防腐剂适量，加水至1000ml，搅匀，静置，滤过，灌封，灭菌，即得。

现有的质量标准只其相对密度(应不低于1.08)进行了控制，不利于在生产中控制与监测药品的质量。

这就要求我们生产出高质量的产品，但原有的质量控制方很难对不不同剂型的产品进行有效的质量控制。

现有产品检测方法影响因素较多，结果重现性较差，不能很好的控制药品质量，从而不能很好地保证产品质量的稳定均一。

为保证其质量稳定均一，这就要求对产品有一个好的质量控制方法对其进行有效的质量控制，使产品做到“安全、有效、质量可控”。

如申请号为200910186588.3，名称为“生脉饮中药制剂的检测方法”，涉及生脉饮中药制剂的检测方法，特别涉及生脉饮的检测方法，本发明的生脉饮口服液的检测方法，包括鉴别和含量测定的步骤：所述鉴别采用薄层色谱法，以五味子，麦冬为对照，鉴别生脉饮口服液中的药物成分；所述含量测定采用高效液相色谱法测定生脉饮口服液中五味醇甲的含量。

该发明采用高效液相色谱法进行含量测定，再加上配合薄层鉴别，更具有准确、重现性好的特点，较原方法精密度、灵敏度、稳定性均较高。从而可准确严格地控制产品的质量与均一性。该专利中使用的是三氯甲烷和甲醇制备供试品溶液。

现有生脉饮为《中国药典》2015年版一部及2020年版一部收载，由红参、麦冬、五味子共3味中药组成，具有益气复脉、养阴生津的功效。《中国药典》2015年版及2020年版均采用人参二醇、人参三醇对照品、麦冬对照药材、五味子对照药材、五味子醇甲对照品，对处方中红参，麦冬、五味子分别进行了薄层色谱鉴别，对处方中五味子采用高效液相色谱法测定五味子醇甲(C

中药特征图谱具有整体性、特征性及可量化等特点，为保证制剂质量和临床疗效，完善生脉饮质量标准，对其有效成分进行质量控制，评价生脉饮的一致性与稳定性，通过建立生脉饮中人参皂苷类与五味子醇甲、五味子酯甲的特征图谱，以期能够更有效的对生脉饮的质量进行更准确的控制。

如申请号为202011355970.5，名称为“一种生脉饮的质量标准检测方法”，提供了一种生脉饮的质量标准检测方法，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲为参照品制备形成参照物溶液，通过对比人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd、五味子醇甲和五味子酯甲的特征峰与待测生脉饮的液相色谱图，从而确认待检测生脉饮中含有的有效成分，进而判断待测生脉饮是否符合生脉饮的质量检测标准。但是，上述专利文件在制备供试品溶液时使用到了乙醚。

本发明提供的生脉饮五味子醇甲含量测定方法，参照2020年版《中国药典》一部中生脉饮标准五味子醇甲含量测定，对供试品溶液制备方法进行改进，进而改进生脉饮五味子醇甲含量测定方法，作为内控质量标准，实现对生脉饮五味子醇甲含量进行测定的目的。

本发明提供的生脉饮五味子醇甲含量测定方法，根据生脉饮提取工艺所用溶剂(65％乙醇渗漏)、结合实验室现有溶剂：甲醇、50％甲醇、95％乙醇、70％乙醇、水，观察供试品稀释后溶液的澄清度，根据供试品的溶解效果，来确定最佳稀释溶剂，并使其在线性范围内。

本发明提供的生脉饮五味子醇甲含量测定方法，对现有的生脉饮中五味子醇甲含量测定方法进行改进，使得方法操作步骤更简便，能够同时兼顾到人身安全，并提高工作效率。避免操作过程使用有毒试剂，危害人身健康、安全。同时，本方法可以降低检验成本，把先进的检验技术运用到日常检验中去。

附图说明

为了更清楚地说明本公开中的技术方案，下面将对本公开一些实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。此外，以下描述中的附图可以视作示意图，并非对本公开实施例所涉及的产品的实际尺寸、方法的实际流程等的限制。

图1为根据本公开一些实施例中对照品溶液浓度与峰面积的线性相关系数的示意图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本公开一些实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开所提供的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

实施例

1.试验材料及仪器

2.五味子醇甲(五味子)含量测定方法

照《中国药典》2020年版四部高效液相色谱法(通则0521)测定。

液相色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水比例为56∶44为流动相；检测波长为250nm。理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于2000。

对照品溶液(Ⅰ)的制备：精密称取五味子醇甲对照品10mg，置20ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含五味子醇甲0.5mg的溶液。

对照品溶液(Ⅱ)的制备：精密吸取对照品溶液(Ⅰ)3ml，置50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含五味子醇甲30ug的溶液。

供试品溶液(Ⅰ)的制备：精密称取供试品适量，置量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液(Ⅱ)与供试品溶液(Ⅰ)各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

3.方法和结果

专属性、准确度、精密度(重复性)、定量限、线性、范围、耐用性。

3.1验证步骤

3.1.1试验用具：50ml容量瓶、25ml量瓶、20ml量瓶、5ml移液管。

3.1.2试剂的配制

70％乙醇：量取95％乙醇736.8ml，置1000ml量筒中，加水稀释至刻度，转移至1000ml量瓶中，摇匀，即得。

流动相的配制：取溶剂过滤器，用纯化水用水冲洗两次，安上0.45μm水系微孔滤膜，开启真空泵，用1000ml量筒量取纯化水560ml，真空抽滤，抽滤完毕，关闭真空泵，换上0.45μm有机系微孔滤膜，开启真空泵，用1000ml量筒量取甲醇440ml，真空抽滤，抽滤完毕，关闭真空泵，将滤瓶内的溶液移入贮液瓶中，混合均匀，超声15min以上，即得。

3.1.3操作步骤：照《中国药典》2020年版四部高效液相色谱法(通则0521)测定。

3.1.3.1液相色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水比例为56∶44为流动相；检测波长为250nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于2000。

3.1.3.2对照品溶液(Ⅰ)的制备：取五味子醇甲对照品①

对照品溶液(Ⅱ)的制备：精密吸取对照品溶液(Ⅰ)3ml，分别置50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含五味子醇甲①

3.1.3.3供试品溶液(Ⅰ)的制备：精密称取供试品5ml，置25ml量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.1.3.4空白溶液：取纯化水即得。

3.2专属性实验：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Welch UItimate LP-C184.6mm*250mm*5um)试验，精密吸取空白溶液(纯化水)、流动相、70％乙醇、阴性样品(缺五味子)、对照品溶液、供试品溶液(Ⅰ)各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果空白溶液、流动相、70％乙醇，在与对照品溶液相应的保留时间处，无其它色谱峰出现，表明方法专属性可行，后附图谱。

3.3准确度：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Thermo Hypersil GOLD4.6mm*250mm*5um)试验，测得282308011批生脉饮中间产品五味子醇甲含量0.278mg/ml；精密吸取生脉饮供试品(批号：282308011中间产品)2.5ml共6份，分别置25ml量瓶中，加入浓度为0.5214mg/ml五味子醇甲对照品溶液1.4ml，置上述25ml量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(Ⅱ)。按“3.1”项下试验条件试验，计算回收率(85％～110％)及其相对标准偏差，不得大于8％。结果见表1，后附图谱。

表1回收率试验

结论：根据上表可以看出6份样品回收率的均在85％～110％之间，其相对标准偏差为2％，不大于8％。

3.4精密度(重复性)：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Thermo HypersilGOLD 4.6mm*250mm*5um)试验，精密吸取供试品(批号：282308011中间产品)5ml，置25ml容量瓶中，加70％乙醇稀释刻度，摇匀，即得，平行制备6份，按“3.1”项下条件试验，计算含量及其相对标准偏差，不得大于8％。结果见表2，后附图谱。

表2精密度(重复性)试验

结论：根据上表可以看出6份样品含量的相对标准偏差为2％，不大于8％，说明本方法的重复性良好。

3.5定量限：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Thermo Hypersil GOLD4.6mm*250mm*5um)试验，精密吸取浓度为30.81ug/ml的五味子醇甲对照品溶液1ml，置50ml容量中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，在“3.1”项下条件下试验，记录色谱图，查看色谱图信噪比S/N为21.6～37.0，计算此时的浓度为：0.6162ug/ml，作为定量限浓度，连续进样6次，6针峰面积的相对标准偏差为7％，不大于16％，后附图谱。

3.6线性及范围

3.6.1线性浓度溶液的制备

线性浓度1：精密吸取对照品溶液(Ⅱ)1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲0.6162ug的溶液。

线性浓度2：精密量取“3.1”项下对照品溶液(Ⅱ)5ml，置10ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲15.40ug的溶液。

线性浓度3：取“3.1”项下对照品溶液(Ⅱ)，即得，30.81ug/ml的溶液。

线性浓度4：精密吸取对照品溶液(Ⅰ)2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲102.70ug的溶液。

线性浓度5：精密吸取对照品溶液(Ⅰ)5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含五味子醇甲256.75ug的溶液。

线性浓度6：取“3.1”项下对照品溶液(Ⅰ)，即得，513.5ug/ml的溶液。

3.6.2按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Thermo Hypersil GOLD 4.6mm*250mm*5um)试验，精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程，相关系数R不得小于0.99，对照品溶液浓度与峰面积见表3，线性相关系数见图1，后附图谱。

表3对照品溶液浓度与峰面积

结论：根据表3和图1可以得出，在五味子醇甲浓度为0.6162～513.5ug/ml之间时，浓度与峰面积呈线性，线性方程为y＝0.3524x+2.0581，相关系数R

3.7溶液稳定性：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Thermo Hypersil GOLD4.6mm*250mm*5um)试验，取282308011混合均匀度溶液10ul，分别于0小时、3小时、8小时、12小时、16小时，按照“3.1”项下条件试验，记录色谱图，计算供试品溶液中五味子醇甲的含量，并计算相对标准偏差，不得大于8％，结果见表4，后附图谱。

表4溶液稳定性试验

结论：从上表可见，供试品溶液在室温条件下放置16小时，五味子醇甲含量的相对标准偏差为：1％，不大于8％，说明供试品溶液在18小时内稳定。

3.8按照“3.1”项下液相色谱条件试验，分别精密吸取供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法，计算供试品溶液中五味子醇甲的含量，检验结果见表5，后附图谱。

表5含量测定

以改变液相色谱条件如流速、柱温、流动相比例、更换色谱柱等来试验，通过6次试验，结合试验结果证明本方法的适用性。

3.9耐用性

3.9.1液相色谱条件同“3.1”项下液相色谱条件。

3.9.2对照品溶液：同“3.1”项下对照品溶液(Ⅱ)。

3.9.3供试品溶液(Ⅱ)的制备：同“3.1”项下供试品溶液(Ⅰ)。

3.9.4测定法分别量取对照品溶液(Ⅱ)、供试品溶液(Ⅱ)各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.9.5结果计算：按照外标法，以峰面积计算供试品溶液(Ⅱ)中五味子醇甲的含量。

3.9.5.1按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Welch UItimate LP-C184.6mm*250mm*5um)试验，系统适用性试验见表6、含量测定见表7，后附图谱。

表6系统适用性试验

表7含量测定

3.9.5.2调整柱温：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Welch UItimate LP-C18 4.6mm*250mm*5um)试验，当柱温设为：30℃时，系统适用性试验见表8、含量测定见表9，后附图谱。

表8系统适用性试验

表9含量测定

3.9.5.3调整流速

3.9.5.3.1调整流速：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Welch UItimate LP-C18 4.6mm*250mm*5um)试验，当流速设为：1.2ml/min，系统适用性试验见表10、含量测定见表11，后附图谱。

表10系统适用性试验

表11含量测定

3.9.5.3.2调整流速：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Caprisli C18-P100A 4.6*150mm，5um)试验，当流速设为：0.8ml/min，系统适用性试验见表12、含量测定见表13，后附图谱。

表12系统适用性试验

表13含量测定

3.9.5.4更换色谱柱：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：Caprisli C18-P100A 4.6*150mm，5um)试验，系统适用性试验见表14、含量测定见表15，后附图谱。

表14系统适用性试验

表15含量测定

3.9.5.5调整流动相的比例：按照“3.1”项下液相色谱条件(色谱柱：CaprisliC18-P 100A 4.6*150mm，5um)试验，流动相的组成调整范围(最小比例的流动相比例可在相对值±30％或者绝对值±2％的范围内调整)，即可以由甲醇-水比例为56∶44，调整为：甲醇-水比例为43∶57或甲醇-水比例为70∶30。

3.9.5.5.1当流动相的比例调整为：甲醇-水比例为70∶30时，系统适用性试验见表16、含量测定见表17，后附图谱。

表16系统适用性试验

表17含量测定

3.9.5.6含量测定汇总见表18

表18含量测定汇总

通过对液相色谱条件：柱温、流速、流动相的比例、不同品牌色谱柱的调整，从上表数据中可看出，测定条件有小的变动时，测定结果不受影响，说明本方法的耐用性良好。

4.可接受标准见表20

表19可接受标准

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。