一种用于检测心肌损伤标志物的纳米金笼免疫层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种用于检测心肌损伤标志物的纳米金笼免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

心肌损害主要表现为胸闷、胸闷、心慌、气促气急、呼吸困难、四肢乏力等，由心肌炎导致的心肌损害还可出现头痛、发烧、全身痛等。该病的常见并发症为心力衰竭。心肌损伤可由很多原因引起，如心肌梗死、心肌炎等，患者常有心脏异常症状。疾病的早期诊断是实现心肌损害相关疾病有效治疗的基础。目前公认的心肌损伤的标志物包括cTnI、HFABP、MPO和NT-proBNP。

胶体金免疫层析技术是20世纪80年代发展起来的，其基本原理与免疫渗滤技术相同。由于其稳定性好、安全、简便，且不需任何仪器设备等优点，被广泛应用于医学诊断、农产品农药兽药残留、进出口产品病原微生物检测等领域。然而目前公开的胶体金免疫层析试纸条在检测高浓度样本时，容易出现钩状效应，使得线性范围变窄，严重影响试纸条的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测心肌损伤标志物的纳米金笼免疫层析试纸条，采用小颗粒的纳米金笼作为显色标记物标记抗体，避免检测时出现钩状效应的问题，实现试纸条检测线性范围宽的目的，扩大应用前景。

本发明提供了一种用于检测心肌损伤标志物的纳米金笼免疫层析试纸条，包括背板和由下向上依次粘贴在所述背板上的样品区、结合区、检测区和吸水区，所述结合区负载着修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼标记的抗心肌损伤标志物第一抗体；所述检测区的检测线包被有抗心肌损伤标志物第二抗体；

所述修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼的制备方法，包括以下步骤：

在沸腾状态下，将硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液混合，煮沸混合液至浅黄色不变，得到银纳米粒子悬浊液；

在沸腾状态下，将所述银纳米粒子悬浊液和氯金酸混合，煮沸至颜色不变，得到纳米金笼悬浊液；

将所述纳米金笼悬浊液调节pH值至中性，添加链霉亲和素，第一静置，得到链霉亲和素修饰的纳米金笼悬浊液；

向所述链霉亲和素修饰的纳米金笼悬浊液添加生物素，第二静置，得到修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼。

优选的，所述硝酸银溶液的浓度为50～100mg/L；

所述柠檬酸钠溶液的质量浓度为0.01％～0.05％。

优选的，所述硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液混合后，还包括添加聚乙烯吡咯烷酮；

所述聚乙烯吡咯烷酮的添加浓度为1～5mg/mL。

优选的，所述硝酸银和氯金酸的质量比为1：(1.8～2.5)；

所述硝酸银和链霉亲和素的质量比为5:1；

所述链霉亲和素和生物素的质量比为1：1。

优选的，所述第一静置的温度为20～27℃；所述第一静置的时间为1.5～2.5h；

所述第二静置的温度为20～27℃；所述第二静置的时间为0.5～1.5h。

优选的，所述修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼标记的抗心肌损伤标志物第一抗体的制备方法，采用NHS对修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼中生物素进行活化，然后与抗心肌损伤标志物第一抗体混合，使活化的生物素和抗心肌损伤标志物抗体的氨基发生化学反应形成酰胺键，得到纳米金笼标记的抗心肌损伤标志物第一抗体。

优选的，所述活化时，硝酸银和NHS的质量比为(10～20)：3。

优选的，所述心肌损伤标志物包括以下至少一种：cTnI、HFABP、MPO和NT-proBNP。

优选的，所述第一抗体的负载浓度为10μg/mL；

所述第二抗体的包被浓度为1.5mg/mL。

优选的，所述样品区的材料预先用处理液处理；

所述处理液为含质量浓度1～5％NaCl、质量浓度0.5％～2％PEG6000和质量浓度0.1％～0.5％Tween 20的20mM～50mM Tris缓冲液，pH值为6.5～8.5。

本发明提供了一种用于检测心肌损伤标志物的纳米金笼免疫层析试纸条，本发明采用新型的纳米金笼制备方法制备得到的纳米金笼具有颗粒小的特点，使其作为显色标记物标记抗心肌损伤标志物第一抗体时，能够大大扩宽检测线性范围，避免在检测高浓度样本时，出现钩状效应的问题，大大提高了免疫层析试纸条的应用范围。

附图说明

图1为本发明提供的试纸条的结构示意图；

图2为四联检测试纸条中检测区上各检测线分布示意图；

图3为三联试纸条和单一标志物检测试纸条中检测区上检测线分布示意图；

图4为二联检测试纸条中检测区上各检测线分布示意图；

图5为4种标志物单独检测试纸条中检测区上检测线分布示意图；

图6为二联试纸条和两个独检测试纸条中检测区上检测线分布示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测心肌损伤标志物的纳米金笼免疫层析试纸条，结构示意图见图1，包括背板和由下向上依次粘贴在所述背板上的样品区、结合区、检测区和吸水区，所述结合区负载着修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼标记的抗心肌损伤标志物第一抗体；所述检测区的检测线包被有抗心肌损伤标志物第二抗体；

所述修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼的制备方法，包括以下步骤：

在沸腾状态下，将硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液混合，煮沸混合液至浅黄色不变，得到银纳米粒子悬浊液；

在沸腾状态下，将所述银纳米粒子悬浊液和氯金酸混合，煮沸至颜色不变，得到纳米金笼悬浊液；

将所述纳米金笼悬浊液调节pH值至中性，添加链霉亲和素，第一静置，得到链霉亲和素修饰的纳米金笼悬浊液；

向所述链霉亲和素修饰的纳米金笼悬浊液添加生物素，第二静置，得到修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼。

在本发明中，所述硝酸银溶液的浓度优选为50mg/L～100mg/L，更优选为80mg/L。所述柠檬酸钠溶液的质量浓度优选为0.01％～0.05％，更优选为0.01％。所述硝酸银在柠檬酸钠的作用下发生还原反应。实验表明，柠檬酸钠的添加量影响银纳米粒子的大小，具体为当柠檬酸浓度为0.01％时，银纳米粒子的粒径为40nm～60nm；当柠檬酸浓度为0.05％时，银纳米粒子的粒径为25～35nm。

在本发明中，所述硝酸银溶液和柠檬酸钠溶液混合后，优选还包括添加聚乙烯吡咯烷酮。所述聚乙烯吡咯烷酮的终浓度优选为0.01～0.05mg/mL，更优选为0.05mg/mL。所述聚乙烯吡咯烷酮添加的作用是控制所述还原反应中银纳米粒子的形貌。具体为当聚乙烯吡咯烷酮的终浓度低于0.01mg/mL时，银纳米粒子容易出现团聚的现象；当聚乙烯吡咯烷酮终浓度高于0.05mg/mL时，银纳米粒子具有稳定的晶体结构特点。所述还原反应优选在沸腾条件下持续18～22min，更优选为20min。

在本发明中，所述硝酸银和氯金酸的质量比为1：(1.8～2.5)，更优选为1:2。所述煮沸的时间优选为10～20min，更优选为15min。所述氯金酸的添加量影响还原的程度。

在本发明中，所述第一静置或第二静置的温度优选为20～27℃，更优选为25℃。所述第一静置的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2.0h。所述第二静置的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1.0h。

在本发明中，所述硝酸银和链霉亲和素的质量比优选为5:1。所述链霉亲和素和生物素的质量比为1：1。本发明制备的修饰有链霉亲和素—生物素的纳米金笼，结构为纳米金笼-链霉亲和素-生物素；所述纳米金笼通过静电吸附与链霉亲和素-生物素系统中的链霉亲和素结合。所述修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼的结构优选为多面体结构。

在本发明中，所述链霉亲和素-生物素的纳米金笼标记的抗体的制备方法，优选采用NHS对所述修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼中生物素进行活化，然后与抗心肌损伤标志物第一抗体混合，使活化的生物素和抗心肌损伤标志物第一抗体的氨基发生化学反应形成酰胺键，得到修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼标记的抗心肌损伤标志物第一抗体。

在本发明中，所述活化时，硝酸银和NHS的质量比优选为(10～20)：3，更优选为5:1。所述NHS的浓度优选为12～18μg/mL，更优选为15μg/mL。所述活化的温度优选为35～39℃，更优选为37℃。所述活化的温度优选为13～16min，更优选为15min。所述抗心肌损伤标志物第一抗体的终浓度优选为10μg/mL～15μg/mL，更优选为12μg/mL。本发明对所述抗体的种类没有特殊限制，以检测目标抗原对应的抗体即可。上述制备方法制备的修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼标记的抗心肌损伤标志物第一抗体的结构为纳米金笼—链霉亲和素—生物素—第一抗体，其中生物素与第一抗体通过酰胺键共价连接。

在本发明中，所述化学反应的温度优选为20～27℃，更优选为25℃。所述化学反应的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。所述化学反应结束后，优选离心，收集沉淀，重悬，得到标记的抗心肌损伤标志物第一抗体。所述离心的转速优选为10000～120000rpm，更优选为12000rpm。所述离心的时间优选为15～30min，更优选为30min。所述重悬用溶剂优选为20mM Tris溶液。

在本发明中，所述试纸条优选与卡壳组装形成试纸卡。本发明对卡壳的结构不做具体限定，采用本领域所熟知的用于盛装层析试纸条的卡壳即可。所述心肌损伤标志物优选包括以下四种：cTnI、HFABP、MPO和NT-proBNP。所述试纸条用于检测cTnI、HFABP、MPO、NT-proBNP4种标志物，可根据检测试纸条的条数，优选包括以下任意一种：一根同时检测cTnI、HFABP、MPO、NT-proBNP标志物的四联检测试纸条，一根同时检测cTnI、HFABP、MPO、NT-proBNP中任意三种标志物的三联检测试纸条和单独检测剩余的标志物的试纸条形成的第一试纸条组，两根同时检测cTnI、HFABP、MPO、NT-proBNP中任意2种不重复的标志物的二联检测试纸条形成的第二试纸条组、4根分别检测cTnI、HFABP、MPO、NT-proBNP标志物中的一种的检测试纸条形成的第三试纸条组和一根同时检测cTnI、HFABP、MPO、NT-proBNP中任意两种标志物的二联检测试纸条和两根分别检测剩余两种标志物其中一种的检测试纸条形成的第四试纸条组。

在本发明中，所述四联检测试纸条中检测区上优选设置有平行排列的T1、T2、T3、T4检测线(图2)，本发明对T1、T2、T3、T4检测线包被的第二抗体的种类不做特殊限制，每种检测线上包被一种不重复的标志物对应的第二抗体即可；所述结合区优选同时负载四种标志物对应的第一抗体。

在本发明中，所述三联检测试纸条中检测区上优选设置有平行排列的T1、T2、T3检测线(图3)，本发明对T1、T2、T3检测线包被的第二抗体的种类不做特殊限制，每种检测线上包被一种不重复的标志物对应的第二抗体即可，所述结合垫上优选同时负载三种标志物对应的第一抗体即可。

在本发明中，在第二试纸条组中，所述二联检测试纸条的检测区优选设置有平行排列的T1和T2检测线，另一条二联检测试纸条的检测区优选设置有平行排列的T3和T4检测线(图4)，本发明对T1、T2、T3和T4检测线包被的第二抗体的种类不做特殊限制，4种标志物对应的第二抗体均分为两组分别包被在检测上即可，所述结合垫优选根据检测线上包被的第二抗体的种类对应性负载第一抗体即可。

在本发明中，在第三组试纸条组中，4根检测试纸条中检测区分别设置一条检测线，所述检测线上包被一种不重复的标志物对应的第二抗体(图5)，结合垫中负载相应标志物的第一抗体。

在本发明中，在第四试纸条组中，所述二联检测试纸条的检测区优选设置有平行排列的T1和T2检测线；另两条检测试纸条的检测区优选均设置有一条检测线，即T3检测线或T4检测线(图6)。本发明对T1、T2、T3和T4检测线包被的第二抗体的种类不做特殊限制，以四种检测线包被不同的标志物对应的第二抗体即可。在第四试纸条中，所述二联检测试纸条的结合区或两条检测试纸条的结合区分别负载与所检测的不同标志物对应的第一抗体即可。

在本发明中，所述抗心肌损伤标志物第一抗体优选包括以下至少一种抗体：cTnI第一抗体、HFABP第一抗体、MPO第一抗体和NT-proBNP第一抗体。；HFABP第一抗体、MPO第一抗体和NT-proBNP第一抗体购自海肽公司，货号分别为10E1、16E1、16E6。所述结合区上修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼标记抗心肌损伤标志物的第一抗体的喷涂浓度优选为10μg/mL，喷涂量优选为5～10μL/cm，更优选为5μL/cm。所述结合区的材料优选为玻璃纤维素膜。检测区根据待检测标志物的种类设置对应数量的检测线和1条质控线。所述检测区包被有以下至少一种抗体：cTnI第二抗体、HFABP第二抗体、MPO第二抗体和NT-proBNP第二抗体。其中cTnI第一抗体为购自潍坊百诺迪公司的标记抗体。所述cTnI第二抗体为购自潍坊百诺迪公司的包被抗体。HFABP第二抗体、MPO第二抗体和NT-proBNP第二抗体分别购自海肽公司，货号分别为28、18B7、15F11。所述第二抗体的包被浓度优选为1.5mg/mL，喷涂量优选为1μL/cm。所述检测区的材料优选为硝酸纤维素膜。所述样品区的材料优选为玻璃纤维素膜。所述玻璃纤维素膜预先用处理液进行浸泡、烘干处理。所述处理液优选为含质量浓度1％～5％NaCl、质量浓度0.5％～2％PEG6000和质量浓度0.1％～0.5％Tween 20的20mM～50mMTris缓冲液，pH值为6.5～8.5，更优选为3％NaCl、1％PEG6000和0.6％Tween 20的50mMTris缓冲液。所述底板优选为PVC板。所述吸水区的材料优选为吸水纸。本发明对所述试纸条的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的试纸条的制备方法即可。

在本发明中，所述试纸条的检测原理，优选如下：样品滴加到卡壳中的加样孔处，在毛细作用下往吸水区方向移动；样品在经过金垫时，样品中的抗原与修饰有生物素-链霉亲和素的纳米金笼标记的抗体发生特异性反应，形成5联偶联物在毛细作用下继续向吸水区方向移动，在经过T线时，样品中的抗原与T线上的另外一种抗体结合，在T线处形成捕获抗体-抗原-标记抗体-生物素-链霉亲和素-纳米金笼的复合物并固定在T线处，在T线处显现一个蓝色的线；若样品中不含目标抗原则T线处不显色。抗原的浓度和T线的显色强度呈正相关。其余液体继续移动，过量的抗体-生物素-链霉亲和素-纳米金笼复合物会与C线处的羊抗鼠IgG结合，在C线处显色。质控线为证明此试纸条是否可靠，如C线不显色则此试纸检测结果无效。检测时长优选为15min。在15min后在仪器上进行定量检测，原理为测试T/C的信号值，即T线的信号强度除以C线的信号强度，得到比值，校准后生成校准曲线，再次检测可直接读出浓度大小。

本发明试纸条的性能指标：

1.最低检出限：

心肌肌钙蛋白I(cTnI)不高于：0.01ng/mL；

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)不高于：0.05ng/mL；

髓过氧化物酶(MPO)不高于：0.10ng/mL；

N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)不高于：0.01ng/mL；

2.线性范围

cTnI线性范围为0.025ng/mL～10ng/mL，H-FABP线性范围为0.1ng/mL～120ng/mL，MPO线性范围为0.5ng/mL～250ng/mL，NT-proBNP线性范围为0.025ng/mL～10ng/mL，在生产企业所规定的线性范围内，试纸的相关系数r均应不小于0.99。

3.重复性

变异系数(CV)均应≤10％。

4.批间差

变异系数(CV)均应≤15％

5.准确度

回收率应为80％～120％范围内。

6.适用样本类型

血清、血浆、全血样本。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于检测心肌损伤标志物的纳米金笼免疫层析试纸条及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼的制备方法

1)纳米金笼的合成：

A.将硝酸银溶于100mL蒸馏水，得到终浓度为50mg/L的硝酸银溶液，煮沸，加入柠檬酸钠溶液至终浓度为0.01％，进行还原反应，煮沸20min直至溶液呈现浅黄色，即可得到银纳米颗粒。在还原反应过程中每100mL加入5mg的PVP对银纳米粒子的形貌进行控制。

B.用电偶置换反应直接制备纳米金笼，将制备好的银纳米粒子溶液煮沸后加入终浓度为0.01％的氯金酸后，持续煮沸，直至颜色不发生变化，得到纳米金笼悬浊液。

2)链霉亲和素标记纳米金笼

用0.2M K

3)生物素与链霉亲和素连接

在链霉亲和素标记纳米金笼悬浊液中加入10μg/mL生物素，室温静置1h，形成修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼悬浊液。

本发明用银做牺牲模板通过电偶置换反应制备出纳米金笼，电偶置换反应推动两种金属之间发生氧化还原反应是基于不同电化学电势。对于金纳米颗粒，Ag纳米颗粒作为“还原剂”，Au

在银模板与HAuCl

实施例2

一种修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼的制备方法

1)纳米金笼的合成：

A.将硝酸银溶于蒸馏水，得到终浓度为100mg/L的硝酸银溶液，煮沸，加入柠檬酸钠溶液至终浓度为0.05％，进行还原反应，煮沸20min直至溶液呈现浅黄色，即可得到银纳米颗粒。在还原反应过程中每100毫升加入5mg的PVP对银纳米粒子的形貌进行控制。

B.用电偶置换反应直接制备纳米金笼，将制备好的银纳米粒子溶液煮沸后加入终浓度为0.02％的氯金酸后，持续煮沸，直至颜色不发生变化，得到纳米金笼悬浊液。

2)链霉亲和素标记纳米金笼

用0.2M K

3)生物素与亲和素连接

在链霉亲和素标记纳米金笼悬浊液中加入10μg/mL生物素，室温静置1h，形成修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼悬浊液。

实施例3

一种修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼的制备方法

1)纳米金笼的合成：

A.将硝酸银溶于蒸馏水，得到终浓度为80mg/L的硝酸银溶液，煮沸，加入柠檬酸钠溶液至终浓度为0.02％，进行还原反应，煮沸20min直至溶液呈现浅黄色，即可得到银纳米颗粒。在还原反应过程中每100毫升加入5mg的PVP对银纳米粒子的形貌进行控制。

B.用电偶置换反应直接制备纳米金笼，将制备好的银纳米粒子溶液煮沸后加入终浓度为0.02％的氯金酸后，持续煮沸，直至颜色不发生变化。

2)链霉亲和素标记纳米金笼

用0.2M K

3)生物素与链霉亲和素连接

在链霉亲和素标记纳米金笼悬浊液中加入10μg/mL生物素，室温静置1h，形成修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼悬浊液。

对实施例1～3制备的纳米金笼样品分别按照以下方法进行表征：

1)紫外-可见吸收光谱：移取120μL超纯水于干燥的比色皿中，测其光谱，作为空白对照。移取100μL纳米金笼溶液，用超纯水将其稀释2倍。移取上述稀释的纳米金笼溶液于干燥的比色皿中，测定样品的光谱。

纳米金笼SPR峰为600nm～765nm。

2)透射电子显微镜(TEM)：用镊子夹取一片干净的铜网于垫有滤纸的玻璃皿中，喷有碳膜的为正面朝上，以同样的方法将纳米金笼溶液稀释2倍，吸取10μL样品滴加到铜网上形成液珠，盖住玻璃皿，置于超净工作台风干，制样后1～2天进行检测。

制得的纳米金笼为中空结构，壁厚和空隙比较均一，且分散性很好。测量纳米金笼的边长为55～65nm，壁厚为4～7nm。

实施例4

一种修饰有链霉亲和素—生物素的纳米金笼标记抗体的制备方法

向实施例1制备的修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼悬浊液中添加终浓度为15μg/mL的NHS，在37℃下活化15min后加入终浓度为15μg/mL的抗体(cTnI第一抗体、HFABP第一抗体、MPO第一抗体和NT-proBNP第一抗体)室温静置2h后，离心，去上清，用复溶液(含0.01g/mL牛血清白蛋白、0.1g/mL蔗糖、0.05g/mL海藻糖、0.1％proclin的0.02M Tris-HCl溶液)将沉淀10倍浓缩复溶，得到修饰有链霉亲和素—生物素的纳米金笼标记抗体溶液。

实施例5

一种用于检测心肌损伤标志物的试纸条及其使用方法

1)结合区制备：将实施例2制备的修饰有链霉亲和素—生物素的纳米金笼标记抗体溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，在各抗体的标记浓度独立为10μg/mL，喷涂量为5μL/cm；喷涂后置于37℃下烘干。

2)检测区的制备：将第二抗体(cTnI第二抗体、HFABP第二抗体、MPO第二抗体和NT-proBNP第二抗体)和羊抗鼠IgG分别用包被液溶液(含体积百分含量0.05％proclin、0.01g/ml的0.02M磷酸盐缓冲液，pH值7.4)配制成浓度为1.5mg/mL的抗体溶液，采用喷金仪将各抗体划线于硝酸纤维素膜上，干燥。

3)样本区的制备，将玻璃纤维素膜置于处理液中浸泡完全，取出，干燥。

4)将样品区、结合区、检测区和吸水区分别粘贴在PVC底板上，裁切成条，装入卡壳中，扣紧上盖，得到检测卡。

使用方法为：将待测样本滴入试纸卡的加样孔中，静置15min，在观察窗处观察检测线和质控线的颜色，进行定性判断：当质控线显色，检测线也显色，说明样品中存在相应检测抗原，当质控线显色，检测线不显示时，说明样品中为检测到相应抗原。定量判断时，在静置结束后，用仪器检测测定窗处的检测线和质控线的信号值，测试T/C值，根据标准曲线，得到检测结果。

实施例6

一种基于心肌损伤四联检测卡(纳米金笼免疫层析法)建立空白限的方法

1.实验方法

使用经典方案来评价空白限(LoB)。默认α＝β＝0.05。

实验设计方案为：

1个仪器系统：免疫层析分析仪SKan Flexi Plus；

三个批次的心肌损伤四联检测卡(纳米金笼免疫层析法)：20210504、20210505、20210506；

3个测试日；

5个空白样本，每个样本进行4次重复测量。

离群值检查：使用Grubbs法进行离群值检查，如有离群值，应进行剔除后再进行统计分析。

应用SPSS软件对空白样本进行正态检验，如数据呈正态分布，则用参数法计算空白限，如数据不符合正态分布则用非参数法计算空白限。

2.检测结果

1)cTnI空白限的建立

表1 cTnI空白样本检测数据表

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

因三个批次的空白样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算空白限，方法如下：将空白样本数据有小到大排列X

表2秩序和从空白样本测试结果秩序位置得到的LoB

通过线性插入法得出三批试剂在免疫层析分析仪：型号：SKan Flexi Plus上的空白限测值，选择较大者0.003ng/mL作为心肌肌钙蛋白I(cTnI)测量程序的LoB。空白限为0.003ng/mL。符合技术要求。

2)HFABP空白限的建立

结果见表3。

表3空白样本检测数据表

经检验后得知，心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)的空白样本检测结果没有离群值，不需要剔除数据。

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

因三个批次的空白样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算空白限，方法如下：将空白样本数据有小到大排列X

表4秩序和从空白样本测试结果秩序位置得到的LoB

通过线性插入法得出三批试剂在免疫层析分析仪：型号：SKan Flexi Plus上的空白限测值，选择较大者0.03ng/mL作为心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)测量程序的LoB。空白限为0.03ng/mL。符合技术要求。

3)MPO空白限的建立

表5 MPO空白限检测数据

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经检验后得知，髓过氧化物酶(MPO)的空白样本检测结果没有离群值，不需要剔除数据。

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

因三个批次的空白样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算空白限，方法如下：将空白样本数据有小到大排列X

表6秩序和从空白样本测试结果秩序位置得到的LoB

通过线性插入法得出三批试剂在免疫层析分析仪：型号：SKan Flexi Plus上的空白限测值，选择较大者0.06ng/mL作为髓过氧化物酶(MPO)测量程序的LoB。空白限为0.06ng/mL。符合技术要求。

4)NT-proBNP空白限的建立

表7 NT-proBNP空白限检测结果

经检验后得知，N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)的空白样本检测结果没有离群值，不需要剔除数据。

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

因三个批次的空白样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算空白限，方法如下：将空白样本数据有小到大排列X

表8秩序和从空白样本测试结果秩序位置得到的LoB

通过线性插入法得出三批试剂在免疫层析分析仪：型号：SKan Flexi Plus上的空白限测值，选择较大者0.003ng/mL作为N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)测量程序的LoB。空白限为0.003ng/mL。符合技术要求。

实验结论

由上述的空白限的检测数据和计算结果，得出心肌损伤四联检测卡(纳米金笼免疫层析法)的各检测指标的空白限。

心肌肌钙蛋白I(cTnI)的空白限为0.003ng/mL；

心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)的空白限为0.03ng/mL；

髓过氧化物酶(MPO)的空白限为0.06ng/mL；

N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)的空白限为0.003ng/mL。

实施例7

实施例3制备的心肌损伤四联检测卡的检出限建立方法

1实验方法

使用经典方案来评价检出限(LoD)。默认α＝β＝0.05。

实验设计方案为：

1个仪器系统(免疫层析分析仪SKan Flexi Plus)；

三个批次的心肌损伤四联检测卡(纳米金笼免疫层析法)：20210504、20210505、20210506；

3个测试日；

5个低浓度水平样本；每个样本进行4次重复测量。

离群值检查：使用Grubbs法进行离群值检查，如有离群值，应进行剔除后再进行统计分析。

应用SPSS软件对低浓度水平样本进行正态检验，如数据呈正态分布，则用参数法计算检出限，如数据不符合正态分布则用非参数法计算检出限。

2实验数据及结果

1)心肌肌钙蛋白I(cTnI)检出限检测数据

表9 cTnI检出限结果

经检验后得知，心肌肌钙蛋白I(cTnI)的低值样本检测结果没有离群值，不需要剔除数据。

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

检出限的建立

因三个批次的低值样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算检出限，方法如下：将5个低浓度水平样本测试结果组合，按从低到高排序。按照LoD＝LoB+DS-β公式计算，得到三个试剂批号的LoD，选择较大者作为测量程序的LoD。

表10检出限结果

备注：中位数计算：(第30位数+第31位数)/2；第5百分位数＝60×0.05+0.5＝第3.5秩序号：第5百分位数的值＝(第3位数+第4位数)/2。

由上得出三批试剂的检出限较大者作为测量程序的LoD。综上得出，心肌肌钙蛋白I(cTnI)的检出限为0.010ng/mL。假阳性的比例(α)小于5％和假阴性比例(β)小于5％。检出限值为0.10ng/mL。符合技术要求。

2)心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)检出限检测数据

表11 HFABP检出限结果

经检验后得知，心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)的低值样本检测结果没有离群值，不需要剔除数据。

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

检出限的建立

因三个批次的低值样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算检出限，方法如下：将5个低浓度水平样本测试结果组合，按从低到高排序。按照LoD＝LoB+DS-β公式计算，得到三个试剂批号的LoD，选择较大者作为测量程序的LoD。

表12检出限结果

备注：中位数计算：(第30位数+第31位数)/2；第5百分位数＝60×0.05+0.5＝第3.5秩序号：第5百分位数的值＝(第3位数+第4位数)/2。

由上得出三批试剂的检出限较大者作为测量程序的LoD。综上得出，心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)的检出限为0.50ng/mL。假阳性的比例(α)小于5％和假阴性比例(β)小于5％。检出限值为0.50ng/mL。符合技术要求。

3)髓过氧化物酶(MPO)检出限检测数据

结果见表13。

表13 MPO检出限数据

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经检验后得知，髓过氧化物酶(MPO)的低值样本检测结果没有离群值，不需要剔除数据。

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

检出限的建立

因三个批次的低值样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算检出限，方法如下：将5个低浓度水平样本测试结果组合，按从低到高排序。按照LoD＝LoB+DS-β公式计算，得到三个试剂批号的LoD，选择较大者作为测量程序的LoD。

表14检出限结果

备注：中位数计算：(第30位数+第31位数)/2；第5百分位数＝60×0.05+0.5＝第3.5秩序号：第5百分位数的值＝(第3位数+第4位数)/2。

由上得出三批试剂的检出限较大者作为测量程序的LoD。综上得出，髓过氧化物酶(MPO)的检出限为1.00ng/mL。假阳性的比例(α)小于5％和假阴性比例(β)小于5％。检出限值为0.100ng/mL。符合技术要求。

4)N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)检出限检测数据

结果见表15。

表15 NT-proBNP检出限

经检验后得知，N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)的低值样本检测结果没有离群值，不需要剔除数据。

由于验证数量为60个，所以参照柯尔莫戈洛夫-斯米诺夫的显著性，其显著性P＜0.05，因此数据呈非正态分布。

检出限的建立

因三个批次的低值样本检测数据均为非正态分布，因此采用非参数法计算检出限，方法如下：将5个低浓度水平样本测试结果组合，按从低到高排序。按照LoD＝LoB+DS-β公式计算，得到三个试剂批号的LoD，选择较大者作为测量程序的LoD。

表16检出限结果

备注：中位数计算：(第30位数+第31位数)/2；第5百分位数＝60×0.05+0.5＝第3.5秩序号：第5百分位数的值＝(第3位数+第4位数)/2。

由上得出三批试剂的检出限较大者作为测量程序的LoD。综上得出，N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)的检出限为0.010ng/mL。假阳性的比例(α)小于5％和假阴性比例(β)小于5％。检出限值为0.010ng/mL。符合技术要求。

3实验结论

由上述的检出限的检测数据和计算结果，得出心肌损伤四联检测卡(纳米金笼免疫层析法)的各检测指标的检出限。

心肌肌钙蛋白I(cTnI)的检出限为0.010ng/mL；

心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)的检出限为0.050ng/mL；

髓过氧化物酶(MPO)的检出限为0.100ng/mL；

N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)的检出限为0.010ng/mL。

实施例8

实施例3制备的心肌损伤四联检测卡线性评估

1.线性建立过程

用胎牛血清作为配制基质，将心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)，髓过氧化物酶(MPO)和N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)稀释成一系列浓度，作为企业参考品，其cTnI最终浓度分别为(0.025ng/ml、0.5ng/ml、0.75ng/ml、1ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、7.5ng/ml、10.0ng/ml、15ng/ml)；H-FABP最终浓度如下：(0.10ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、40.0ng/ml、60.0ng/ml、80.0ng/ml、100ng/ml、120.0ng/ml、150ng/ml)；MPO最终浓度如下：(0.50ng/ml、10.0ng/ml、25.0ng/ml、50.0ng/ml、75.0ng/ml、100.0ng/ml、125.0ng/ml、150.0ng/ml、200ng/ml、250.0ng/ml)；NT-proBNP最终浓度分别为(0.025ng/ml、0.5ng/ml、0.75ng/ml、1ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、7.5ng/ml、10.0ng/ml、15ng/ml)。选用SKan Flexi Plus仪器和20210504批次的检测卡进行实验。按试剂盒说明书进行操作，对每一浓度的样本均重复测定3次，计算其平均值，以理论浓度为横坐标，以实际检测浓度为纵坐标进行直线拟合，并计算线性相关系数r。结果见表17。

表17 cTnI检测结果记录表

结果计算：

数据经线性检查检验后，计算其平均值，以理论浓度为横坐标，以实际检测浓度为纵坐标进行直线拟合，并计算线性相关系数r，回归方程：

y＝1.0259x-0.0055r

表18 H-FABP检测结果记录表

结果计算：

数据经线性检查检验后，计算其平均值，以理论浓度为横坐标，以实际检测浓度为纵坐标进行直线拟合，并计算线性相关系数r，回归方程：

y＝1.0199x+0.2062r

表19 MPO检测结果记录表

/>

结果计算：

数据经线性检查检验后，计算其平均值，以理论浓度为横坐标，以实际检测浓度为纵坐标进行直线拟合，并计算线性相关系数r，回归方程：

y＝1.0161x-0.1254r

表20 NT-proBNP检测结果记录表

结果计算：

数据经线性检查检验后，计算其平均值，以理论浓度为横坐标，以实际检测浓度为纵坐标进行直线拟合，并计算线性相关系数r，回归方程：

y＝1.0175x+0.0203r

结论

经两台仪器验证，线性试验结果表明：cTnI线性范围为：0.025-10ng/ml之间，r>0.975；H-FABP线性范围为：0.1-120ng/ml之间，r>0.975；MPO线性范围为：0.5-250ng/ml，r>0.975；NT-proBNP线性范围为：0.025-10ng/ml之间，r>0.975；符合设计要求。

实施例9

重复性评估

试验过程

在仪器上分别对配制的高低两个浓度重复性参考品，重复检测10次，分别计算每个检测指标10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据式(1)得出变异系数(CV)。

CV＝SD/M×100％………………(1)

式中：

CV——变异系数；

SD——10次测量结果的标准差；

M——10次测量结果的平均值。

试验结果见表21。

表21重复性检测结果

结论

经重复性试验结果表明：本检测试剂cTnI、H-FABP、MPO、和NT-proBNP的CV均小于15％，符合设计要求。

实施例10

准确度评估

试验过程

分别取0.1ml高浓度参考品A(MPO 100ng/ml、cTnI 5ng/ml、NT-proBNP 5ng/ml、H-FABP 80ng/ml)，0.9ml低浓度参考品B(MPO 10ng/ml、cTnI 1ng/ml、NT-proBNP 1ng/ml、H-FABP 10ng/ml)，将高浓度参考品依次加入到低浓度参考品B中，混合后各重复测定3次，取平均值，根据公式(2)计算出回收率结果应符合R值为80％～120％的要求。

V

式中：

R—回收率；

V

C

V

C

C—向B液中加入A液后的检测浓度的平均值。

试验结果见表22。

表22准确度检测结果

/>

/>

/>

结论：

经准确度试验结果表明：本检测试剂cTnI、H-FABP、MPO、和NT-proBNP的回收率均在80％～120％范围内，符合设计要求。

实施例11

批间差试验

试验过程

在仪器上分别对配制的一个浓度重复性参考品，用三个批号试剂盒各重复检测10次，计算30次测量结果的平均值M和标准差SD，根据式(3)得出变异系数CV，其结果应符合的要求。

CV＝SD/M×100％(3)

式中：

CV——变异系数；

SD——30次测量结果的标准差；

M——30次测量结果的平均值。

试验结果见表23。

表23批间差检测结果

2)SKan Flexi检测结果

结果见表24。

表24 SKan Flexi检测结果

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结论

经试验结果表明：本检测卡在两台仪器上的批间差CV均小于20％，符合设计要求。

实施例12

干扰实验

试验过程

分别配制阳性参考品，用胎牛血清作为配制基质使cTnI浓度为5.0ng/ml，H-FABP浓度为10.0ng/ml，MPO浓度为100.0ng/ml，NT-proBNP浓度为4.0ng/ml，每份阳性参考品分为6份，其中3份分别添加内源性干扰物质：血红蛋白、甘油三酯、胆红素，添加浓度为临床常见浓度；另外3份分别添加外源性干扰物质：EDTA、枸橼酸钠、肝素，添加浓度为临床常见浓度,加样20分钟判断结果，记录检测结果。

结果见表25。

表25干扰实验结果

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/>

结论经试验证明，临床常见干扰物质不影响本产品的检测性能，本检测卡分析特异性表现良好。

实施例13

钩状效应(Hook效应)

试验过程

用胎牛血清作稀释液，将cTnI、H-FABP、MPO和NT-proBNP分别配制浓度为100ng/ml、2400ng/ml、2000ng/ml和100ng/ml，平行测定每种浓度样品三次，取其均值。

试验结果见表26

表26钩状效应检测结果

经测试结果显示：100ng/ml的cTnI、2400ng/ml的H-FABP、2000ng/ml的MPO和100ng/ml的NT-proBNP对检测不产生hook效应。

实施例14

不同包装规格之间不存在性能差异

本产品为检测试纸条卡型，所有各生产过程均为同一场地同一车间进行，生产过程均按照同样的操作规程制备，成品包装也是全部按照成品包装操作规程进行，产品包装时只是包装规格不同，其试剂组成成分以及生产工艺不存在任何差异，没有对试剂的性能指标产生影响的因素，不同包装规格均能满足检验要求，因此采用常用的一种规格的本产品进行的分析性能的评估，可以完整准确的反映不同包装规格试剂的各项指标。

实施例15

血清、血浆、全血一致性评价

实验要求

检测50例同源样本的血清、血浆和全血计算偏差及相关性分析

实验方法

按照说明书进行，选用20210504批次的检测卡在SKan Flexi Plus仪器上进行检测

评价标准

各指标的血清、血浆、全血样本的测试值相对偏差不超过±15％。

实验结果见表27。

表27一致性检测结果

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结论

通过对各指标的50例同源血清、血浆和全血样本进行检测，相对偏差均在±15％之内，表明三种样本之间的测值无差异，结果一致。

对比例1

一种修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼的制备方法及其制备的心肌损伤标志物检测试纸条

1)纳米金笼的合成：

A.将硝酸银溶于蒸馏水，得到终浓度为50mg/L的硝酸银溶液，煮沸，加入柠檬酸钠溶液至终浓度为0.005％，进行还原反应，煮沸20min直至溶液呈现浅黄色，即可得到银纳米颗粒。在还原反应过程中每100毫升加入5mg的PVP对银纳米粒子的形貌进行控制。

B.用电偶置换反应直接制备纳米金笼，将制备好的银纳米粒子溶液煮沸后加入终浓度为0.01％的氯金酸后，持续煮沸，直至颜色不发生变化。

2)链霉亲和素标记纳米金笼

用0.2M K

3)生物素与亲和素连接

在链霉亲和素标记纳米金笼悬浊液中加入10μg/mL生物素，室温静置1h，形成修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼悬浊液。

将制备的修饰有链霉亲和素-生物素的纳米金笼悬浊液按照实施例2的方法标记抗心肌损伤标志物的抗体，然后按照实施例3的方法制备和评估检测试纸条。

将上述制备的修饰纳米金笼作为标记物用于检测试纸条的制备，试纸条的检测结果和本发明实施例1中修饰纳米金笼(原配方)作为标记物制备试纸条的检测结果见表28。

表28不同试纸条的检测结果

与实施例1的制备方法相比，当还原硝酸银时将柠檬酸的浓度减半，则会使得还原出的银纳米粒子的粒径增大，在以其为模板时，被HAuCl

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。