一种TLR4结合肽Pep5及其应用

技术领域

本发明属于多肽领域，具体涉及一种TLR4结合肽Pep5及其应用。

背景技术

TLR4是TOLL样家族中的一员，可以识别外源性病原体相关分子和内源性危险相关分子并启动免疫反应。作为一个跨膜蛋白，TLR4包含胞外、跨膜、胞内三部分，胞外部分与MD2结合形成二聚体后可识别LPS，形成三聚体，两个三聚体结合可形成“M”型六聚体，诱导TLR4胞内二聚化，启动下游信号，产生一系列的炎症因子和细胞因子。TLR4的过度激活会引发严重的炎症反应，产生的炎症因子也与多种疾病的发生发展密切相关，包括骨关节炎、心血管疾病、癌症、疼痛等。TLR4可作为呼吸系统和神经系统并发症、疼痛、炎症、阿尔兹海默症等疾病的治疗靶点。因此，如果能阻断TLR4激活，则有望治疗TLR4信号通路介导的相关疾病。

针对TLR4进行疾病治疗的底层逻辑是阻断TLR4信号通路的激活，根据TLR4受体胞外部分激活信号通路的特点，可以通过三个途径进行阻断：第一，阻止TLR4与MD2形成二聚体；第二，阻止TLR4-MD2与LPS形成三聚体；第三，阻止两个三聚体二聚化。

目前，针对TLR4抑制剂前体物质的研究很多，但是进入到临床试验的仅有三种，都由于各种原因停滞，还没有进入临床使用的相关抑制剂。因此，如果能针对TLR4胞外提供新的靶向结合肽，则有望提供新的潜在TLR4治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种TLR4结合肽Pep5及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：多肽Pep5，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IN NO:1所示。

相应的，多肽Pep5，编辑所述多肽的DNA序列如SEQ IN NO:2所示。

相应的，所述多肽Pep5在与TLR4结合中的应用。

相应的，利用所述多肽制备的药物、保健品、食品。

优选的，所述药物为可以缓解或治疗疼痛的药物。

优选的，所述药物为可以治疗TLR4介导的信号通路导致的疾病的药物。

相应的，包括所述多肽的药物、保健品、食品。

优选的，所述药物为可以缓解或治疗疼痛的药物。

优选的，所述药物为可以治疗TLR4介导的信号通路导致的疾病的药物。

本发明具有以下有益效果：本发明提供了一个新的、能与TLR4特异性结合的多肽Pep4，并通过SPR技术验证Pep5可以与TLR4稳定结合，进而影响TLR4信号通路。Pep5不仅可以作为药物开发的候选物，制备为可治疗TLR4信号通路介导的相关疾病的药物、保健品或特医食品等，还可以作为研究TLR4通路的新工具。

附图说明

图1为TLR4与Pep5结合位点示意图；

图2为TLR4与Pep5的SPR检测结果示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种新的多肽Pep，其氨基酸序列如SED IN NO:1所示，编码该多肽的DNA序列如SED IN NO:2所示。所述多肽Pep可以与TLR4特异性结合，影响TLR4信号通路，从而可阻断TLR4激活，治疗TLR4信号通路介导的相关疾病。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。

实施例一：TLR4结合肽Pep5来源

选择来自广东蛇类养殖场的中华眼镜蛇。将蛇置于-80℃保持2小时，处死后取出毒腺，在液氮中放置2小时后转移至-80℃长期保存。使用RNAisoPlus(Takara)提取毒腺的总RNA并对其纯化，随后立即进行凝胶电泳，验证提取总RNA的完整性，并使用nanodrop检测提取总RNA的浓度。再用Oligotex试剂盒(QIAGEN)从总RNA中分离Poly(A)+mRNA。使用SMARTTM cDNA构建技术反转录出cDNA，使用的试剂均由Takara提供。

根据mRNA的3'polyA结构合成一段包含Hind III酶切位点的oligo(dT)序列，作为起始引物，记作SMART I-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATTCGGG。根据mRNA的5’帽子结构合成一段包含EcoR I酶切位点的Oligo(dG)序列作为反转录第一链的延伸模板，记作CDSⅢPrimer-ATTCTAGACAAGCTTGGACATG-d(T)30VN(N＝A,G,C,orT；V＝A,G,orC)。反转录第一链时，先在离心管中加入3μL mRNA，1μL SMART I，1μL CDSⅢPrimer，混匀后72℃孵育2min，冰上冷却2min，继续加入2μL 5X First-Strand Buffer，1μL DTT(20mM)，1μL dNTP Mix(10mM)，1μL SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase，42℃孵育1h，置于冰上终止第一链的合成。

在合成第一链过程中，以SMART I作为反应起始引物，到达5'末端时在cDNA第一链末端加上的(dC)，能直接与CDSⅢPrimer的Oligo(dG)进行配对，然后MMLV可以转换模板，将CDSⅢPrimer作为新的模板继续延伸cDNA第一链。最终得到的cDNA第一链，两端分别包含了一个酶切位点。将CDSⅢPrimer作为3'PCR Prime，合成5'PCR Primer-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT，进行第二链合成。离心管中加入2μL First-Strand cDNA，80μLDeionized H

实施例二：TLR4结合肽Pep5的人工合成和分子量计算

1、序列比对。多肽Pep5的氨基酸序列如SED IN NO:1所示，编码该多肽的碱基序列如SED IN NO:2所示。将Pep5的碱基序列输入NCBI数据库进行blast，比对结果显示：Pep5与虎斑响尾蛇(Crotalus tigris)基因组的Crotalus tigriszinc finger FYVE-typecontaining1(ZFYVE1)基因同源，比对到的位置为4378～4238，Sequence ID为XM_039333225.1，Query Cover为90％，分数为255bits(138)，Expect为1e-63，Identities为140/141(99％)，Gaps为0/141(0％)，GenBank结果显示：Pep5比对到的区间为非CDS序列。将Pep5的氨基酸序列进行tblastx，没有检索到任何信息，说明Pep5是虎斑响尾蛇转录组中ZFYV1基因包含的一小段非编码序列所表达出来的一个新多肽。

2、多肽合成。利用固相合成Fmoc法(SPPS)，使用Wang树脂作为固相合成载体，具体步骤包括：将0.5g 0.8mmol/g的Wang树脂、0.3mmol Fmoc-氨基酸、0.6mmol DIPEA、20mLDCM加入合成反应器中，震荡2小时，然后使用10mL试剂(哌啶：DMF＝1：4，V：V)进行氨基保护基Fmoc。依次将Wang树脂和下一活化氨基酸在室温下震荡进行反应，氨基酸活化剂为1.2mmol HBOt/DCC(1:1，v/v)，反应溶剂为10mL NMP、10mL DCM。缩合过程中采用茚三酮定性监测反应进程：取少量树脂于EP管中，滴加适量乙醇洗涤3次，加入2滴茚三酮指示剂，沸水浴5min，观察树脂及EP管中溶液的颜色，如果树脂颜色变浅很多，为浅黄色，表示已缩合完全，可以进行下一个氨基酸的加载缩合。所有氨基酸都合成上后，用氮气干燥树脂，使用切割试剂(TFA-DCM,19:1,V/V)将目标多肽从树脂上裂解下来并除去侧链保护基，得到Pep5粗品，使用反向HPLC进行纯化，得到纯化Pep5干粉制品。

3、纯度确认和分子量计算。将0.1mg多肽Pep5溶于0.5mL 10％ACN(乙腈)和90％H

计算多肽Pep5的理论分子量，计算公式为：

实施例三：TLR4结合肽Pep5的性能展示

1、Pep5与TLR4的结合分数预测。

针对TLR4进行疾病治疗的底层逻辑是阻断TLR4信号通路的激活，根据TLR4受体胞外部分激活信号通路的特点，可以通过三个途径进行阻断,具体为：(1)阻止TLR4与MD2形成二聚体；(2)阻止TLR4-MD2与LPS形成三聚体；(3)阻止两个三聚体二聚化。

使用HDOCK服务器预测TLR4分别与Pep5和MD2的结合分数，每次得到100个结果，选择得分最高的结果进行分析。结果显示：TLR4与Pep5的预测结合分数为0.9767，与MD2的预测结合分数为0.9941。Pep5与TLR4的结合位点在TLR4上的分布位置在149～547位氨基酸之间，MD2与TLR4的结合位点在TLR4上的分布位置在15～313位氨基酸之间，有一定的重合区间。其中，231位的AGR、310位的GLU为完全重合的结合位点。进一步分析TLR4与Pep5的结合位点信息，并使用pymol进行了可视化，结果如图1所示。图1中，A为TLR4与Pep5结合位点显示图；B、C为Pep5结构预测图，B为cartoon形式，C为surface形式；D为TLR4与Pep5结合surface图。结果显示：多肽Pep5可能可以通过结合TLR4通过空间位阻来阻断TLR4与MD2的结合，进而阻断TLR4信号通路的激活。

2、与TLR4的结合能力验证。

购买商业化的TLR4(Abcam)胞外部分蛋白(24-632aa)作为靶标，使用实施例二合成的Pep5作为配体小分子，使用Biacore T200检测两者的结合力。芯片选用CM5芯片(GEHealthcare)，本实施例所用缓冲液为1×HBS-EP+(10×HBS-EP+，0.1M HEPES，1.5M NaCl，0.03M EDTA，0.5％v/v Surfactant P20，pH＝7.4)。

将TLR4蛋白干粉短暂高速离心后用超纯水复溶为400μg/mL的母液。分别用pH为4.0、4.5、5.0的醋酸钠溶液将TLR4母液稀释为20μg/mL的溶液进行蛋白偶联条件筛选，筛选结果显示pH＝4.0为TLR4偶联的最佳条件。

根据公式

其中，Rmax为芯片表面最大结合容量，设置为100RU，analyteMW和ligandMW分别为Pep5的分子量和TLR4蛋白分子量，S

偶联时，先将EDC和NHS(GE Healthcare)等比混合后对芯片进行活化，用pH＝4.0的醋酸钠稀释的TLR4蛋白溶液进行偶联，设置偶联量为1718.85RU，偶联完成后，使用乙醇胺(GE Healthcare)对芯片表面进行封闭。对Pep5经过表面测试可知，最大响应浓度为1250nM，Pep5与TLR4结合之后，可以自己解离回到基线水平，所以不需要进行再生。正式实验时，用超纯水将Pep5干粉复溶为1M的母液，用1×HBS-EP+缓冲液分别将Pep5母液分别稀释为0nM、9.76nM、19.53nM、39.06nM、78.13nM、156.25nM、312.5nM、625nM和1250nM的溶液，按照浓度由低到高的顺序依次流过芯片表面，使用一个没有偶联蛋白的空白通道作为参照，排除非特异性结合作用，最终结果扣减掉空白通道和0浓度，得到Pep5和TLR4的结合力。

结果如图2所示。图2使用表面等离子体共振(SPR)验证多肽Pep5与TLR4之间的结合力。图2中，不同的线段代表不同的浓度(单位为nM)，从下到上依次为：9.76nM、19.53nM、39.06nM、78.13nM、156.25nM、312.5nM、625nM和1250nM。结果显示：不同浓度的多肽Pep5和TLR4都能响应，且响应结果与浓度成正比。证明多肽Pep5与TLR4蛋白能很好的结合，且存在明显的浓度依赖：多肽Pep5浓度越高，与TLR4展示的结合能力越强。使用BiacoreEvaluation Software 3.2分析图2的结合曲线，根据亲和度的拟合，所述结合肽与TLR4结合的平衡解离常数(KD)为1.51×10

3、溶解度测试。量取3管100μL的去离子水，分别加入0.5mg、1mg、1.5mg的Pep5干粉，用涡旋振荡仪震荡至完全溶解，然后12000g室温离心20min，取出所有上清进行称量，重复检测三次，取平均值，计算出Pep5室温下的溶解度为6.02mg/mL。

综上，所述结合肽能与TLR4特异性结合，证明该结合肽可作用于TLR4受体，且溶解性良好，有望用于TLR4功能研究，并具有制备靶向TLR4药物、缓解疼痛药物的潜力。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。