一种硝酸纤维素膜及其制备方法和运用

技术领域

本申请涉及蛋白层析技术领域，具体涉及硝酸纤维素膜及其制备方法和运用。

背景技术

层析法是一种常用的用于对蛋白进行检测、分离、提纯的方法。在层析法中，带有显色剂的免疫层析技术使一种新型抗原检测技术，该技术以微孔滤膜为载体，将特异性的抗原或抗体固定在上述载体上，并将待测样品放置于另一端，通过毛细作用使待测样品通过含有显色剂的区域，并被显色剂捕获，随后结合待测样品中抗原组分的显色剂再被针对该抗原的特异性抗原或抗体的检测先捕获，最终在检测先上富集形成显色，而未结合待测抗原的显色剂则无法富集于检测线上，最终在质控线上富集。该方法具便捷易测、稳定性和直观性，成本较低，具有广泛的运用。

在免疫层析技术中，为了使待测样本中的目标抗原或目标抗体有充分的时间与显色剂或检测线上的特异性抗体或抗原发生反应，需要对液体在微孔滤膜上的爬速进行控制，爬速越慢，具有的反应时间就越长，通常情况下，爬速与微孔膜的孔隙大小相关，孔隙越小，爬速越慢。

硝酸纤维素膜是一种在免疫层析领域常用的微孔滤膜，其具有性质稳定、非特异性吸附较弱、整体结构均匀、强度高、耐污耐折等优点，目前已经被广泛地使用在多种检测试纸中。硝酸纤维素膜通常通过分相法制备得到，在分相的过程中，硝酸纤维素通过在非溶剂或蒸汽作用下析出，从而形成微孔结构，但是在上述过程中，由于硝酸纤维素本身析出后，在动力学作用下，会更倾向于在已经析出的硝酸纤维素表面吸附，形成团聚的结点结构，而结点的分布会引起液体流动通道的蜿蜒、提高了液体层析流动的阻力。

胶体金是一类典型的显色剂，其显色效果好，粒径通常较小，当微孔滤膜具有较低的孔隙率、较小的流通孔径和较低的爬速时，采用胶体金作为显色剂可以使其顺利地通过微孔滤膜，以实现更高的灵敏度和更低的背景色。但是当蛋白本身尺寸较大时，结合蛋白后的胶体金会有较大幅度的体积和结合性能的变化，因此，在硝酸纤维素膜中的结点分布引起的液体流道阻力较大时，容易阻滞表面吸附有待测蛋白的胶体金颗粒的流动，产生较大的背景深度。

发明内容

为了提供一种具有较低的爬速、较小的孔隙率的同时，对大分子蛋白具有较低非特异性吸附的免疫层析微孔滤膜，本申请提供一种硝酸纤维素膜及其制备方法。

本申请中所涉及的硝酸纤维素膜通过硝酸纤维素纤维形成，纤维相交交织形成网状结构，并在内部产生供液体通过的流道，所述纤维上具有结点，在外表面上，所述单位面积的结点分布数量N1、结点平均直径R1和外表面平均SEM孔径D1满足如下关系：N1·R1

在上述技术方案中，在硝酸纤维素膜用于在较低的爬速下分离具有较大分子量的蛋白的过程中，蛋白在结合抗体之后体积变大，进而容易卡在膜孔中，进而导致后续的大分子无法通过，产生堵膜的现象。堵膜的现象通常和硝酸纤维素膜中的结构有关，由于在硝酸纤维素膜的制备过程中，会在纤维上产生结点，结点中为部分硝酸纤维素纤维团聚后形成的近似球形的结构，因此在体系中具有对膜内的虹吸效应和对蛋白的力学效应具有显著的影响。在本申请中，在过滤分子量较大，或形状较为不规整的蛋白时，需要单位面积的结点分布数量、结点平均直径和外表面平均孔径满足如上公式所示的关系，其中，(N1·R1

优选的，K1值与纤维的平均直径R2之间满足如下关系：K1＝K2·R2

在特定的孔隙面积率范围内，一般纤维直径越大，对应的纤维的孔径也越大，整体上，纤维的直径越大的情况下，纤维在铺展过程中越平整，进而可以形成更好的引导液体流动的流道。在上述方案中，纤维直径的平方和K1的值基本上成正比，即纤维直径越大，在具有接近的表面SEM平均孔径的条件下可以容纳更大的结点密度和更大的结点直径

优选的，所述纤维的平均直径R2为2～3μm；所述结点平均直径R1为4～7μm。

在上述方案中，体系在保持特定的孔隙面积率的情况下，应当具有较粗的纤维，该状态下，蛋白或结合抗体后的蛋白受到的纤维的阻拦的可能性较小，形成的孔隙结构也更为规整。但是纤维也不应当过粗，否则容易产生体系内的不均匀现象，进而导致条带发生扭曲；在上述基础上，在保持上述直径取值纤维状态的基础上，体系不应当在现为上具有较大的纤维结点平均直径，否则过大的纤维结点会严重影响体系的均匀性，使得膜内各区域产生不同的毛细力，进而造成划线区域的平整度降低。

优选的，所述单位面积结点分布数量N1和结点平均直径R1之间具有如下关系N1·R1

在本申请中，结点的数量和尺寸应当为反相关的关系，对应结点的数量越大，则需要结点的尺寸越小，具体地，结点数量应当和结点的直径的平方成反比，由于在膜的截面上，结点会以截面的形式对物料碱性阻拦，因此K3在一定范围内，可以减少结点对于虹吸效果及液体流动阻力的影响。但是，结点不能是过小且过密的状态，否则过于细碎的结点会在纤维素膜内部产生具有很大比表面积的区域，在该区域中，会使得硝酸纤维素膜对蛋白的吸附性能明显增强，因此需要避免小而密的结点排布情况。

优选的，外表面上的所述结点平均直径R1和外表面平均SEM孔径D1之比不大于0.66。

外表面上结点的平均直径相较于外表面的平均孔径应当控制在较小的范围内，即，在保持较较大的外表面孔径的情况下，尽可能控制较小的结点平均直径，进而减少纤维表面的凹凸不平的状态，提高蛋白流动的流畅性和均匀性。

优选的，所述硝酸纤维素纤维上，被结点覆盖的长度占硝酸纤维素纤维的总长度的比例P2为3～6.5％。

在液体流动过程中，硝酸纤维素纤维可以起到导向的作用，而液体和蛋白顺纤维移动的过程中，结点会起到改变流向、调节流速的效果，但是过大的结点或过密的结点都会在体系中产生容易卡主蛋白的缺陷，进而导致堵膜现象更加频繁地发生，因此，在上述方案中，对纤维上结点的密度进行了限定，在该状态下，液体随纤维流动时在，蛋白不易被纤维上的结点卡住，进一步减少了堵膜现象的发生。

优选的，所述硝酸纤维素纤维上，对于被结点覆盖的长度占硝酸纤维素纤维的总长度的比例P2与纤维直径与结点直径之间的比值P3之间具有如下关系：P2∶P3＝6～12％。

在上述方案中，结点相较于纤维直径越凸出，其在纤维上的分布密度应当更加稀疏，否则容易在纤维上产生更多的凹陷和卡槽，更加容易使蛋白卡在纤维上，同时更加凸出于纤维的结点在更密的结点分布情况下，也容易使体系中产生诸多较小的间隙，也更容易卡住。在上述公式中，被结点覆盖的长度占硝酸纤维素纤维的总长度的比例和结点直径与纤维直径之间的比值之间成反比，其乘积应当在特定的范围内。

另外，本申请还涉及到上述硝酸纤维素膜的制备方法，其包含如下步骤：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素5～20份，有机溶剂80份，非离子表面活性剂5～20份，脂肪族多元醇0.1～10份；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

在硝酸纤维素膜成型的过程中，由于硝酸纤维素在溶液中分布具有一定的不稳定性，其析出会先形成一个个小球，再在小球之间发生纤维的连接，进而产生交织的网络装结构。上述过程中，形成的小球就是本申请中所述的结点。在本申请中，配置质量浓度较低的硝酸纤维素分子溶液，并经过先蒸发分相预处理，再溶剂分相的方式，真空分相的过程中，可以减少新的结点的形成，并在体系内形成基础的交联结构，随后再进行分相，可以在上述初步交联的基础上，进一步形成网状的结构，在该状态下，不容易形成大体积的结点，整体结点产生的数量也较小。

优选的，所述步骤S2中，温度控制为15～30℃，湿度为30～50％，时间为1～60s。

经过实验，控制在该温度和真空度的情况下，可以进一步减少结点的产生，且在该真空度下，控制较好的成核过程，可以使纤维析出更加均匀，形成质地均匀的硝酸纤维素膜。同时，在体系中控制较低的湿度，有助于降低该步骤中高分子析出的速率。

优选的，所述步骤S3中，选用凝固浴为0.1～1％质量浓度的氯化钠溶液。

在上述技术方案中将凝固浴中设置成具有一定浓度的氯化钠溶液，其可以通过调节溶液中的电荷平衡，控制硝酸纤维素的析出速度，使之可以形成更加均匀和符合要求的硝酸纤维素膜。

优选的，步骤S3中控制温度为10～30℃，分相的时s间为20～600s。

在上述方案中，采用较低的温度，进行较慢地分相设置，可以有效地控制新的结点的产生，在较低的温度下，硝酸纤维素分子会更加倾向于在已有的纤维上进行附着，或在已有的核心上进行延伸，同时为了形成更低的能量体系，因此会产生更好的交联体系，而非更多的结点体系，形成纤维化明显、结点数量少的膜层结构。

优选的，脂肪族多元醇为甘油，所述甘油的质量份为1～5份。

上述体系中通过添加甘油，调节了铸膜液的粘度、铺展性能和产物的析出性能，甘油本身可以在加工完成后被水洗，同时也可以调节硝酸纤维素的析出性能，实现均匀的析出。

本申请还涉及硝酸纤维素膜在免疫层析领域的运用，其可以制备成免疫层析试纸或试剂盒，与用于胶体金、乳胶微球等显色剂的免疫层析领域。

综上所述，在本申请中设计合成了一种新型的硝酸纤维素膜，可以用于目标蛋白的免疫层析检测，其在具有较低爬速、较小孔径的情况下，减少其对层析中吸附有目标蛋白的胶体金颗粒的阻滞，减少了堵膜的现象发生，降低了背景景深。

附图说明

图1为本申请实施例1中的硝酸纤维素膜表面SEM图；

图2为本申请实施例10中的硝酸纤维素膜表面SEM图；

图3为实施例1中硝酸纤维素膜层析均匀性示意图；

图4为实施例6中硝酸纤维素膜层析均匀性示意图；

图5是实施例1中硝酸纤维素膜划线均匀性的示意图；

图6是实施例14中硝酸纤维素膜划线均匀性的示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

硝酸纤维素膜表面的SEM平均孔径，或截面的SEM平均孔径，或结点、均可以通过使用扫描电子显微镜对膜结构进行形貌表征后，再利用计算机软件(如Matlab、NIS-Elements等)或手工进行测量，并进行相应计算。在实际进行测量时，可以先用电子显微镜对膜表面进行表征，获得相应的SEM图，而由于膜表面孔洞大致是均匀的，因此可以选取一定的面积，例如1μm

对于结点的面积、和孔的面积，也可以通过相同的方式进行计算，可以通过人工划分大致的孔区域、结点区域，再通过计算机进行分析计算，也可以通过划格法进行计算。对于纤维的长度，也可以通过人工标识纤维的轨迹，随后通过计算机进行计算。

需注意的是，本领域技术人员也可以通过其他测量手段获得上述参数，上述测量手段仅供参考。

实施例1～30中，均涉及硝酸纤维素膜，各实施例具有不同的参数，具体如表1所示。

表1

在表1中，K1＝N1·R1

结点分布密度的统计方法通过划分区域后，统计具有清晰轮廓的结点数量，并在多个50μm*50μm的方块内取平均值。其中，部分结点近似于圆形，而部分结点的形状为不规则的形状，该类结点通常是通过两个或多个较为接近的晶核在形成结点的过程中相互融合形成的结构，在统计时仅记作一个结点。

膜平均SEM孔径和孔隙面积率统计时，仅统计在SEM电镜下，处于最外侧的孔的孔径，即在图中，最外侧的纤维结构形成的圈，纤维的长度和直径的统计也仅统计最外侧的纤维，即不被其他纤维遮挡的纤维，纤维和纤维在形成网格结构的过程中，会形成如图1中A区域所示的交汇点，在该区域不计做结点，也不统计其宽度作为纤维直径的统计。在统计纤维的长度时，将上述交汇点抽象成不具有面积的点，并以点连接各点，用于统计纤维长度，在该过程中，结点覆盖部分纤维或覆盖全部纤维，均按照结点覆盖纤维的部分进行计算。

通过调整不同的制备方法，可以制备得到具有不同微观性质的硝酸纤维素膜，需注意的是，下文仅提供可以用于制备得到对应硝酸纤维素膜的微观性质制备方法，采用非以下实施例中所叙述的其他方法制备得到的具有相同微观性质结构的硝酸纤维素膜，应当具有类似的效果，也属于本申请的保护范围内。

实施例1中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素10份，有机溶剂80份，吐温60，10份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为45％，时间为30s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例2中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素15份，有机溶剂80份，吐温60，4份，甘油0.1份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为30℃，湿度控制为50％，时间为30s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.1％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为200s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例3中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素12份，有机溶剂80份，吐温60，10份，甘油5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为40％，时间为50s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为400s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例4中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素6份，有机溶剂80份，吐温60，8份，甘油5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为15℃，湿度控制为35％，时间为15s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.2％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为540s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例5中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素8份，有机溶剂80份，月桂醇聚氧乙烯醚6份，甘油4.5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为20℃，湿度控制为40％，时间为45s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.2％的氯化钠溶液，温度为20℃，处理时间为540s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例6中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素18份，有机溶剂80份，吐温60，10份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为10℃，湿度控制为30％，时间为60s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.1％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为600s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例7中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素15份，有机溶剂80份，吐温60，5份，甘油1份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为40℃，湿度控制为60％，时间为20s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.8％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为240s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例8中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素17份，有机溶剂80份，吐温60，5份，乙二醇8份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为50％，时间为5s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为90s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例8中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素5份，有机溶剂80份，吐温60，15份，甘油10份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为15℃，湿度控制为50％，时间为5s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例9中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素13份，有机溶剂80份，吐温60，5份，甘油2.5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为45％，时间为30s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例10中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素16份，有机溶剂80份，吐温60，16份，甘油8份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为35％，时间为20s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为纯水，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例11中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素18份，有机溶剂80份，吐温60，5份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为35％，时间为50s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.3％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为600s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例12中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素16份，有机溶剂80份，吐温60，5份，甘油5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为30℃，湿度控制为30％，时间为45s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为600s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例13中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素8份，有机溶剂80份，吐温60，6份，甘油1份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为50％，时间为5s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.8％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为300s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例14中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素30份，有机溶剂80份，吐温60，15份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为50％，时间为60s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例15中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素12份，有机溶剂80份，吐温60，8份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为30℃，湿度控制为40％，时间为45s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例16中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素15份，有机溶剂80份，吐温60，15份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为20℃，湿度控制为30％，时间为60s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为240s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例17中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素15份，有机溶剂80份，吐温60，12份，甘油1.5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为20℃，湿度控制为45％，时间为40s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为20℃，处理时间为180s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例18中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素6份，有机溶剂80份，吐温60，6份，甘油1.5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为50％，时间为30s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例19中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素12份，有机溶剂80份，吐温60，12份，甘油5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为20℃，湿度控制为40％，时间为40s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为240s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例20中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素8份，有机溶剂80份，吐温60，15份，甘油10份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为50％，时间为30s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例21中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素18份，有机溶剂80份，吐温60，2份，甘油0.5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为50％，时间为60s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为20℃，处理时间为180s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例22中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素10份，有机溶剂80份，吐温60，25份，甘油10份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为30％，时间为90s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为180s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例23中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素5份，有机溶剂80份，吐温60，15份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为45％，时间为120s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为20s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例24中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素7份，有机溶剂80份，吐温60，5份，丙二醇3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为30℃，湿度控制为45％，时间为60s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度1％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为60s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例25中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素6份，有机溶剂80份，吐温60，6份，甘油2份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为45％，时间为30s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为120s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例26中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维12份，有机溶剂80份，吐温60，6份，甘油2份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为15℃，湿度控制为45％，时间为60s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.1％的氯化钠溶液，温度为30℃，处理时间为50s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例27中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素10份，有机溶剂80份，吐温60，8份，甘油3份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为20℃，湿度控制为45％，时间为45s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为20℃，处理时间为180s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例28中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素20份，有机溶剂80份，吐温60，20份，甘油6份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为40℃，湿度控制为60％，时间为60s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为30s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例29中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素15份，有机溶剂80份，吐温60，5份，甘油5份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为25℃，湿度控制为30％，时间为120s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为25℃，处理时间为180s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

实施例30中硝酸纤维素膜的制备方法如下：

S1、配置铸膜液，铸膜液按照质量份包括硝酸纤维素12份，有机溶剂80份，吐温60，10份，甘油0.1份；有机溶剂选用丙酮；

S2、将铸膜液涂敷在基底材料上，并进行蒸发分相预处理，得到第一初膜，该步骤中，温度为20℃，湿度控制为40％，时间为45s；

S3、将第一中间产物浸润到凝固浴中进行分相，得到第二初膜，凝固浴为质量浓度0.5％的氯化钠溶液，温度为20℃，处理时间为240s；

S4、将上述体系浸入水体系溶液中清洗，随后干燥，得到硝酸纤维素膜。

将实施例1～30中的进行划线测试，并制备成蛋白免疫层析检测用试纸，具体制备方法如下：

1、将制备得到的硝酸纤维素膜进行划线处理，画出检测线和质控线，其中质控线采用羊抗鼠IgG多克隆体，检测线为乙型肝炎病毒单克隆抗体1。

2、将划线后的硝酸纤维素膜裁切并铺展固定在基底材料上，得到反应区，在本申请中，基底材料为聚酯板。

3、在反应区的一端放置显色剂垫，在本实施例中，显色剂垫选用微孔膜结构，在本申请中，选用聚丙烯纤维膜，显色剂垫的制备方法如下：

将显色剂溶液通过碳酸钾调整至pH＝10，将标记抗体加入到溶液中，室温震荡反应，随后用BSA对显色剂的外表进行封闭，随后离心分离并清洗，得到金标复合物，将金标复合物喷涂在显色剂垫。在本实施例中，选用的显色剂粒为胶体金，粒径范围为40～60nm，标记抗体为乙型肝炎病毒单克隆抗体2。

4、在显色剂垫的外侧铺设样品垫，样品垫为玻纤膜。

5、在反应区的另一端铺设吸水垫。

需注意，在本申请中，选用乙肝表面抗原仅是为了示例，实际上也可以通过换用不同抗体的方式，以检测不同的抗原。

在本实施例中，换用不同的实施例中得到的不同的蛋白层析检测试纸，并对试纸进行检测，检测的方法具体如下：

配置乙肝表面抗原缓冲溶液，缓冲溶液为10M的PBS体系，加入0.05％质量分数的triton、适量表面活性剂，配置成浓度为100ng/mL的乙肝表面抗原样本，将配置好的乙肝表面抗原缓冲溶液滴在样品垫上进行检测。另外，在上述基础上，额外添加诺如病毒和腺病毒，作为阴性的对照组。对照组的浓度均为1000ng/ml。在检测过程中，观察C线和T线外的背景底色，由深到浅依次记为+++、++、+，基本无背景色记为-。

对实施例1～30进行测试的结果如表2所示。

表2

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通过上述实验数据，可以明显的看到，本申请中制备得到的硝酸纤维素膜均可以较为正常地用于蛋白免疫层析检测的技术领域中，具有良好的选择性和转移性。在整体上，滤膜的爬速在90s/4cm附近，爬速主要与滤膜表面的平均孔径正相关，该硝酸纤维素膜整体具有较小的表面SEM孔径，因此整体爬速较低，适用于具有较小的平均粒径的胶体金颗粒。

在上述实施例中，首先，实施例14和实施例29中，具有明显过大的K1值，K1值即为(N1·R13)/D1的值，当其过大时，意味着相较于纤维表面孔径，该硝酸纤维素膜具有过大的结点数量和结点直径，即结点在表面覆盖了过大的表面积，产生最明显的结果就是表面划线出现不均匀的现象，同时背景色变深，其原因是过大的结点覆盖会引起液体流动的阻滞，对物料的传输产生影响，其也是背景色较深的原因，在上述基础上，实施例7尽管K1在可取的范围内，但是K2值取值较大，在该范围内，尽管结点的数量和尺寸控制在了一定范围内，但是其相较于R2依然较大，同样地，在体系内会形成局部过大的比表面积，具有略深的背景深度。

相对的，在实施例8、10和13中，则具有较低的K1值，当K1过低时，一方面膜表面对物料的留存能力较差，具体体现在划线容易发白，另一方面，由于将结点数量控制在很低的水平实际上是比较难的，因此实施例10和实施例13都有一个明显的特点，即纤维结点的直径很小，这会给结点分布区域带来过大的比表面积，进而提高了膜在局部区域非特异性吸附，导致尽管实施例10和实施例13尽管整体上背景色较浅，但是在局部区域仍然会形成色块。在上述基础上，实施例20尽管K1在范围内，但是K2值取值过低，其同样也会产生类似的效果，其发白的现象不明显，但是整体上依旧存在较深的背景色。证明了即使在控制结点的数量和直径在特定范围内的情况下，还需要保持结点直径和纤维直径具有特定的关系，否则都容易产生不良的影响，影响检测的准确性。

进一步地，在上述基础上，实施例6中，结点的直径较大，尽管其整体具有较大的孔隙，但是结点直径的增大依旧带来了明显的发白的效应，且在层析过程中，过大的结点直径明显影响了层析的均匀度。而实施例22和23尽管具有明显较小的结点直径，但两个实施例中P2·D1/R1的值较小，K3也较小，意味着尽管结点数量不多，粒径也不大，但是结点的主要存在区域都覆盖在纤维上，容易对纤维的导流效果产生影响，在结果上体现就是层析不均匀，且划线区域出现锯齿。在实施例26中，则具有较大的结点数量和过大的K3值，其结点在体系内形成了过大的体积，阻碍胶体金体系流动的同时，也给体系带来了更大的不均匀性，划线发白效应也较为明显。

在实施例30中，通过调节实验参数制备了一种具有较细纤维直径和较低的R1/D1值的硝酸纤维素膜，由于纤维直径本身较细，因此液体在硝酸纤维素膜流动时，硝酸纤维素膜内容易出现电荷不平衡的现象，对部分的胶体金和蛋白体系产生吸附，具有轻微的背景色。实施例11和12中则制备得到了过粗的纤维体系，纤维在过粗的情况下，其产生的毛细效果略有减弱，整体对流速有一定的影响，且对于蛋白的荷载能力和结合能力都有一定的减弱，在划线时，液体很容易通过纤维的缝隙流走，因此划线区域对于物料的结合性能也有一定的减弱，产生的之间现象就是划线发白且不均匀，且流速有一定的降低。

在实施例9和实施例21中，均具有较大的R1/D1的值，同时在实施例21中，纤维表面被结点覆盖了较大的面积，上述性质标明了节点在体系中相较于孔隙和纤维形成了较大的阻力体系和封堵结构，尽管对液体的流速没有明显的影响，但是会对体系中蛋白和胶体金体系产生明显的阻滞，其具有较深的背景色，同时，在划线区域会由于节点的分布过多，导致一定程度的锯齿现象。在实施例2、11和28中，在其他参数均满足要求的情况下，依旧形成了过多的结点体系，在该状态下，整体上均匀度和流动性较好，但是依旧会对蛋白和胶体金产生一定的阻滞和非特异性吸附，在特定情况下产生一定的背景颜色。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。