一种DNA-脂肪酸偶联物及其在细胞膜的修饰上应用

技术领域

本发明涉及细胞工程学技术领域，具体涉及一种DNA-脂肪酸偶联物及其在细胞膜的修饰上应用。

背景技术

细胞膜是一种重要的细胞结构，可以为细胞生命活动提供相对稳定的内环境。同时，作为细胞与细胞、细胞与微环境相互作用的直接区域，它还具有物质摄取、微环境响应、控制离子流通等功能。因此，对细胞膜表面进行修饰，对于调控和研究细胞的生命活动具有重要的意义。目前，已有大量的材料被用于细胞膜修饰，其中DNA因其良好的可编程性、优异的可设计性等优点而被广泛应用。

目前，将DNA修饰到细胞膜的常用方法有以下三种；一是，基于共价交联的方法：细胞膜表面存有大量蛋白质，这些蛋白质中含有大量游离的巯基、氨基等活性官能团，可以通过氨基与琥珀酰亚胺脂、巯基与马来酰亚胺等传统高效的交联手段将DNA探针修饰到细胞膜表面。二是，基于代谢标记的方法：该方法通过人工合成的糖代谢前体将化学标签（如，叠氮基团）整合到细胞膜表面的糖基化蛋白上，利用生物正交反应，将炔基修饰的DNA探针交联到细胞膜表面。三是，基于疏水端插入细胞膜的方法：磷脂双分子层是细胞膜的基本骨架，其中间是由链状脂肪酸构成的疏水空腔，传统的DNA探针通常在尾端修饰胆固醇，如此便可以利用胆固醇与磷脂双分子层内部疏水区域的亲疏水相互作用，自发锚定到细胞表面上。在以上这些方法中，基于疏水端插入细胞膜的方法由于其快速高效、细胞毒性小等优点，受到了广泛应用。

虽然基于疏水端插入细胞膜的方法已被广泛应用，但由于细胞膜具有相似的膜结构，而传统的DNA探针多是通过尾端的胆固醇分子和细胞膜之间简单的物理相互作用固定于膜上，这也就使得传统的DNA探针在进行修饰时不具备良好的选择性，更不利于其应用到精密的分子探针的设计中。

发明内容

针对基于疏水端插入这一膜修饰策略选择性差的问题，开发具有一定选择性的疏水端插入的膜修饰新策略。选择脂肪酸作为疏水锚点，并结合DNA可设计性强的特点，在同一DNA纳米结构中通过调控脂肪酸的距离，开发了一种疏水选择性的膜修饰方法。

本申请的技术方案如下：

一种DNA-脂肪酸偶联物，原料包括：脂肪酸、DNA链；所述的DNA链3

优选地，所述的原料还包括：N，N-二甲基甲酰胺DMF、二环己基碳二亚胺DCC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS。

进一步地，所述的脂肪酸长度n：18≥n≥6。

优选地，DNA链、脂肪酸的摩尔比为1：500；和/或

脂肪酸、二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的摩尔比为1：1：1。

上述DNA-脂肪酸偶联物的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取脂肪酸，用N，N-二甲基甲酰胺溶解；

（2）称取DCC和NHS，用DMF溶解；加入步骤（1）中搅拌活化；

（3）DNA链用碱性溶液进行溶解；将溶解好的DNA链加入步骤（2）中，搅拌，反应过夜；

（4）反应完成后，待反应溶液中固体析出后离心，将上清吸出，纯化底部析出物，进而得到产物。

优选地，步骤（3）所述的碱性溶液为：NaHCO

步骤（4）将反应溶液中固体析出的过程为：向反应溶液中加入NaCl溶液和冰乙醇，低温静置，待固体析出；和/或

步骤（4）纯化的方法为：析出物中加入三乙醇胺（TEAA）溶解后用高效液相色谱纯化。

本发明的另一个目的，保护一种pH响应型DNA三棱柱探针，采用上述DNA-脂肪酸偶联物或上述方法制备的DNA-脂肪酸偶联物，构建pH响应型DNA三棱柱探针。

本发明的另一个目的，保护一种细胞膜的修饰方法，采用权利要求7所制备的pH响应型DNA三棱柱探针。

进一步地，其特征在于，pH为6.5-6.8时，插入细胞膜中。

本发明的另一个目的，保护上述修饰方法或上述pH响应型DNA三棱柱探针在ATP成像上的应用。

脂肪酸（如图1）是一种较好的疏水锚点，且具有以下几个优点：（1）碳链部分长度可调，即疏水性可调；（2）能够通过简单的缩合反应与DNA偶联；（3）单个脂肪酸难以插膜，双脂肪酸易插膜。因此本发明选择脂肪酸作为疏水锚点，并结合DNA可设计性强的特点，在同一DNA纳米结构中通过调控脂肪的距离以及长度，开发了一种疏水选择性的膜修饰方法。

本发明的有益效果：

（1）与传统的使用胆固醇疏水锚定探针相比，本发明制备的基于脂肪酸的锚定探针在细胞膜插入方面具有显著的pH选择性，在pH为6.5-6.8下能够实现插膜。

（2）与其他细胞膜修饰方法相比（例如基于基因工程的方法，基于细胞代谢的方法和基于共价交联的方法），本发明制备的探针具有快速、高效、普适性强等优点。

附图说明

图1为不同长度脂肪酸示意图，从图中看出脂肪酸的长度多样，可选择性较强。

图2中，A为脂肪酸和DNA合成示意图，本实验使用缩合反应将脂肪酸中羧基与DNA末端修饰的氨基进行偶联，合成C

图3中，A图至F图为C

图4中，A为流式细胞表征图，从A图中可以看出当脂肪酸长度大于等于14时，探针开始具有插膜能力；B为流式细胞数据统计图，从图中可以看出以C

图5中，A为距离调控示意图，通过引入柔性链增加摆动幅度进而增加两脂肪酸间距离；B为流式细胞表征图，C为流式细胞数据统计图，从B、C图中可以看出随着柔性链长度增加，两脂肪酸间距离增加，使得插膜能力逐步下降；D为激光共聚焦成像图。

图6中，A为基于DNA三棱柱骨架的pH响应性探针示意图，其在pH6.5时可折叠，将底部两脂肪酸拉近，从而实现插膜；B为流式细胞表征图，C为流式细胞数据统计图，从B、C两图可以看出，当pH处于6.5时，DAN三棱柱探针有明显的插膜现象，而pH为7.4时探针几乎不插膜；D为激光共聚焦成像图，其结果与流式细胞统计结果相符，且当疏水锚点改为胆固醇时，探针不具备pH选择性；证明脂肪酸作为疏水锚点的DNA探针具备更好的选择性。

图7中，A为基于DNA三棱柱骨架的pH响应性探针检测ATP原理图；B为荧光光谱图，从图中可看出该探针对ATP具有较好的响应；C为流式细胞表征图，D为流式细胞数据统计图，E为激光共聚焦成像图，从C、D、E三图中可以看出，只有当pH为6.5且ATP存在下，探针才能实现插膜以及荧光恢复。

具体实施方式

实施例1 DNA-脂肪酸偶联物的合成及表征

脂肪酸末端羧基与DNA氨基通过缩合反应交联在一起；具体来说，本实验购买长度为21个碱基的两条互补DNA链：CDNA1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示（具体为：5

合成方法如下：首先按照摩尔比DNA：脂肪酸=1：500，称取对应质量的脂肪酸，随后将其用100 μL DMF溶解，按照摩尔比脂肪酸：二环己基碳二亚胺（DCC）：N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）=1：1：1，称取对应质量的DCC和NHS，并将称量完毕的DCC和NHS用100 μL DMF溶解；随后依次将脂肪酸、DCC和NHS加入到同一个试管中，在37 ℃下搅拌，活化1小时；DNA先用台式离心机12000 rpm离心 5 min，随后加入200 μL，浓度为0.1 M的NaHCO

根据HPLC结果显示，随着脂肪酸长度的增加，化合物的疏水性增加，使产物在柱中的停留时间更长。如图2所示，化合物峰的时间向后移动，表明DNA链和脂肪酸成功偶联；如图3中的质谱数据证明偶联物分子量正确，进一步表明DNA-脂肪酸偶联物（C

实施例2 考察不同脂肪酸长度及个数的DNA探针插膜效果

（2.1）脂肪酸探针（C

将C

（2.2）用含有1 mM Mg

测试了不同长度的脂肪酸如，C6、C9、C12、C14、C16、C18。如图4所示，我们可以看到，当脂肪酸长度小于14时，单脂肪酸探针（SC

实施例3 脂肪酸间距离对探针插膜的影响

Poly-1T：CDNA1-1T的碱基序列如SEQ ID NO.1所示（具体为：5

Poly-5T：CDNA1-5T的碱基序列如SEQ ID NO.3所示（具体为：5

Poly-10T：CDNA1-10T的碱基序列如SEQ ID NO.5所示（具体为：5

Poly-20T：CDNA1-20T的碱基序列如SEQ ID NO.7所示（具体为：（5

a.合成末端具有不同长度柔性链（poly-1T、poly-5T、poly-10T、poly-20T）的膜探针；方法同实施例2的（2.1）中描述。

b.用含有1 mM Mg

以DC

实施例4 pH响应的细胞膜插入探针构建及插膜验证

SLZ1：碱基序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：5

SLZ2：碱基序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：5

SLZ3：碱基序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：5

C1：碱基序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：5

C3：碱基序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：5

C

C

（4.1）pH响应型DNA三棱柱探针组装：

将上述各链条溶解后按等摩尔比例和5×TAE、超纯水混合，使所有DNA链条终浓度为5 μM，然后将该混合液在PCR仪中按以下程序组装DNA三棱柱：

95 ℃（4 min）→95 ℃（-1 ℃/min）→70 ℃（-0.5 ℃/min）→40 ℃（-1 ℃/min）→30 ℃（30 s）。

（4.2）pH响应的插膜实验：

用不同pH（pH=6.5和pH=7.4）含有1 mM Mg

以DNA三棱柱作为探针的骨架，在其上下两个底边分别引入i-Motif序列（碱基序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：CCCCCTTTCCCCCTTTCCCCCTTTCCCCC）用于调节两脂肪酸距离，这种设计的目的是在pH=6.5时，通过i-Motif的收缩将底边两侧的脂肪酸拉近，实现低pH响应型膜插入，并通过细胞流式和激光共聚焦显微镜进行了验证。从结果可以看出当pH=6.5时，探针明显的锚定于细胞表面，而pH=7.4时由于两脂肪酸间距离较远，探针近乎没有插膜的趋势（图6）；证明这种基于低pH的响应性探针的成功构建；而以胆固醇为疏水锚点的传统探针并不具备pH选择性，任何pH下都可插膜。

实施例5 pH响应的插膜探针应用于ATP成像

SLZ1：碱基序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：5

SLZ2：碱基序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：5

SLZ3：碱基序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：5

ATP aptamer：碱基序列如SEQ ID NO.17所示，具体为：5

C3-cy5：碱基序列如SEQ ID NO.18所示，具体为：5

C

C

（5.1）探针构建

将上述各链条溶解后按等摩尔比例和5×TAE、超纯水混合，使所有DNA链条终浓度为5 μM，然后将该混合液在PCR仪中按以下程序组装DNA三棱柱：

95 ℃（4 min）→95 ℃（-1 ℃/min）→70 ℃（-0.5 ℃/min）→40 ℃（-1 ℃/min）→30 ℃（30 s）。

（5.2）pH响应的插膜探针应用于ATP成像

用不同pH（pH=6.5和pH=7.4）含有1 mM Mg

本申请以DNA三棱柱作为探针的骨架，在其上下两个底边分别引入i-Motif序列使探针能在低pH的肿瘤微环境下将底边两侧的脂肪酸拉近，实现TME响应性膜插入，并在三棱柱顶部两侧边分别引入检测元件（ATP aptamer）和信号响应元件（C3-Cy5）用于ATP检测成像；首先使用荧光光谱仪测定了检测元件和信号响应元件对ATP的响应能力，随后通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行了验证。荧光光谱结果显示，检测元件和信号响应元件对ATP有良好的响应；通过流式和共聚焦结果可知，当pH=6.5时探针锚定于细胞膜，ATP（ATP+）存在的条件下，探针对ATP进行响应，发出荧光（图7）。且与其它对照条件有显著性的差异，证明了该探针的可行性。