颗粒酶可活化的膜相互作用肽和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年6月30日提交的美国临时专利申请第63/216,890号的权益，该申请通过引用整体并入本文。

政府支持声明

本发明是在国立卫生研究院授予的政府资助R01 EB025207、R01 CA258297和R01AI161027下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

人颗粒酶由五种丝氨酸蛋白酶(A、B、H、K、M)组成，其主要在参与宿主防御的淋巴细胞，即自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T细胞(CTL)的分泌小泡(即，颗粒)中表达。在这些细胞类型中，颗粒酶最好被理解为是针对有问题的细胞(例如，癌细胞或被病原体感染的细胞)的促凋亡效应子。为了赋予细胞毒性，淋巴细胞在与靶细胞对接后脱粒，从而将颗粒酶瞬时释放到细胞周围空间中。与颗粒酶共分泌的是穿孔素分子，其在靶细胞的质膜上形成通道，以促进颗粒酶转运到细胞质中。颗粒酶生物化学性质随后通过几种机制触发细胞死亡，例如胱天蛋白酶的蛋白水解活化或直接DNA损伤(颗粒酶B)，以及SET介导的DNA切割活化(颗粒酶A)。然而，颗粒酶主要作为细胞毒性效应子的原则受到了更复杂的生物模型的挑战，在该模型中，分泌的颗粒酶也可以持续存在于细胞外空间中，以进行非细胞毒性信号转导功能。

发明内容

本公开总体上提供了颗粒酶可活化和可检测的膜相互作用肽，其在活化后可以与磷脂双层，如细胞膜相互作用。本公开还提供了使用这种化合物的方法。

本公开的化合物具有通用结构X

在一些实施例中，本公开提供了包含以下从N端到C端或从C端到N端的结构的分子：X

在一些实施例中，X

在一些实施例中，部分Z包含共价连接的水溶性聚合物。在一些实施例中，Z包含氨基酸序列SFLL(X

在一些实施例中，X

在一些实施例中，X

在一些实施例中，本公开提供了在存在颗粒酶活性的情况下可检测地标记磷脂双层的方法，该方法包含将如上所述的分子与有助于颗粒酶活性的颗粒酶接触，其中当接触在适于可切割接头的颗粒酶切割的条件下进行时，该分子被切割以释放膜相互作用多肽部分，用于与磷脂双层相互作用并可检测地标记磷脂双层。在一些实施例中，细胞在体内。在一些实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，本公开提供了用于评估受试者中的颗粒酶活性的方法，该方法包含向受试者施用如上所述的分子，其中X

在一些实施例中，本公开提供了用于评估受试者中的免疫细胞活化的方法，其中免疫细胞在活化时分泌颗粒酶，该方法包含向受试者施用如上所述的分子，其中X

在一些实施例中，本公开提供了制备用于将货物部分递送到磷脂双层的分子的方法，该方法包含合成如上所述的分子，其中存在X

附图说明

图1A-1F：GRIP B(一种限制性相互作用肽，用于通过成像测量体内GZMB蛋白水解)的开发和体外表征。(A)示意图，其示出了限制性相互作用肽的一般结构和体内作用机制。专用内切蛋白酶对全长前体的切割释放出标记的(例如，放射性标记的)抗微生物肽，其不可逆地与附近的磷脂膜相互作用。因此，肽在注射后的延长时间点(即，数小时，而不是数秒)的稳定积累可以反映感兴趣区域中的酶活性的相对单位。(B)图解，其示出了标识GZMB切割序列的MSP-MS研究的工作流程。来自GZMB活性的蛋白水解产物通过将该酶与228个十四肽的物理化学多样性文库一起温育而产生。通过LC-MS/MS进行的肽测序允许确定GZMB生成的切割。(C)iceLogo，其示出了P4-P4’对人GZMB的底物偏好的MSP-MS分析的综合结果。(D)图表，其示出了IEPDVSVQ(SEQ ID NO:64)肽的人颗粒酶B蛋白水解的迈克利斯-门腾动力学。GZMB的非主要和主要位点的覆盖产生了优化的底物，与单独的IEPD相比，其催化转换率提高了大约2倍。(E)GRIP B的最终氨基酸序列。膜结合结构域(SEQ ID NO:3)、颗粒酶B特异性底物(SEQ ID NO:57)、肽掩蔽结构域(SEQ ID NO:7)。(F)数据，其示出了与凝血酶、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8、颗粒酶K、MMP9和C1S相比，底物FVQWFSKFLGK(SEQ ID NO:3)对颗粒酶B的高特异性。

图2A-2D：体外作用机制研究和

图3A-3E：

图4A-4F：

图5A-5B：在野生型小鼠中，

图6A-6E：

图7A-7B：

图8A-8C：

图9A-9C：

图10A-10B：

图11A-11B：种系GZMB敲除小鼠中的成像研究表明，大肠埃希氏杆菌脓肿中的放射性示踪剂摄取是由于颗粒酶B。

图12A-12B：活大肠埃希氏杆菌脓肿诱导更大的放射性示踪剂摄取，并且比内毒素LPS的团注显著更具免疫刺激性。

图13A-13B：响应于金黄色葡萄球菌感染的

图14A-14F：用铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌进行的肌炎研究显示了与大肠埃希氏杆菌和金黄色葡萄球菌感染相似的发现。

图15A-15D：与热灭活对照相比，海洋分枝杆菌和单核细胞增生李斯特菌不诱导活细菌脓肿中的

定义

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包含遗传编码和非遗传编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽主链的多肽。该术语包含融合蛋白，包含但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白，具有或不具有N端甲硫氨酸残基；免疫标记的蛋白质等等。

术语“膜相互作用肽”是指具有多个非极性疏水氨基酸残基的肽分子，并且当不受本文所述的部分Z约束时，包含能够与磷脂双层，如细胞膜相互作用的α-螺旋结构。这种二级结构可以在将膜相互作用肽插入到磷脂双层中之前、期间或之后出现。如本文所述的膜相互作用肽的组成并不严格限于非极性疏水氨基酸残基，因为此类肽也可以包含不同类型的氨基酸残基，例如极性不带电的、极性碱性的或极性酸性的氨基酸残基。

术语“抗微生物多肽”是指一类膜相互作用肽，其衍生自天然存在的肽，基于其与细胞膜相互作用的能力，该肽在其天然形式下表现出抗微生物活性。应理解，如本文所使用，术语“抗微生物多肽”不要求或暗示如此描述的多肽具有抗微生物活性。被示出自发地与磷脂膜相互作用并可能插入到磷脂膜中的任何肽都包含在这一类别中。例如，可以应用来自天然存在的跨膜蛋白的自发地插入的膜相互作用肽。抗微生物多肽是本领域熟知的，并且包含例如普通林蛙素(temporin)家族蛋白质中的多肽。

如本文所使用，术语“前分子”是指其活性受到限制的分子，因为分子的各个部分连接在一起，因此限制了各个部分在彼此不连接时可能具有的活性。前分子的各个部分的活性是在将各个部分结合在一起的键断裂或破坏时释放出来的。本公开的前分子不抑制颗粒酶的活性。

术语“酶活化的”是指其行为被酶修改的分子。在国际生物化学和分子生物学联盟的命名委员会(NC-IUBMB)中，许多活化酶属于水解酶EC 3.1至EC 3.13或肽酶EC 3.4至3.99类别。示例性酶活性包含作用于醚、肽、碳-氮、酸酐、碳-碳、卤化物、磷-氮、硫-氮、碳-磷、硫-硫、碳-硫类型的键的那些。

术语“非标准氨基酸”意指除了天然存在的氨基酸分子之外的任何分子，其可以掺入多肽的肽主链中，代替多肽中的天然存在的氨基酸残基。这种非标准氨基酸的非限制性实例包含：羟基赖氨酸、锁链素、异锁链素等。

术语“修饰的氨基酸”意指已经历化学或生物化学修饰，如翻译后修饰的任何天然存在的氨基酸。修饰的氨基酸的非限制性实例包含：甲基化氨基酸(例如，甲基组氨酸，甲基化赖氨酸)、乙酰化氨基酸、酰胺化氨基酸、甲酰化氨基酸、羟基化氨基酸、磷酸化氨基酸或其它。

如本文所使用，“同源物”或“变体”是指基于其氨基酸序列具有相似性的蛋白质序列。同源物和变体包含与天然存在的序列相差一个或多个保守氨基酸取代的蛋白质。

如本文所使用，术语“保守氨基酸取代”意指一个氨基酸残基对具有相似化学性质的另一个氨基酸残基的取代。

如本文所使用，术语“治疗”意指至少实现了与受试者所患疾病或病状相关联的症状的改善，其中改善是指至少降低了与所治疗的疾病或病状相关联的参数(例如，症状)的大小。因此，治疗包含减轻或避免病状或至少与其相关联的症状的情况。

将了解，在本公开全文中，根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便读者，下面提供了单字母和三字母氨基酸代码。此外，下面提供的氨基酸残基还基于它们的化学性质进行了分类。下表中提供的标题(非极性、疏水；极性、不带电；极性、酸性；以及极性、碱性)用于泛指具有标识的化学性质的氨基酸残基。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，其是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包含线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、载体、探针和引物。

术语“异源的”是指由可以衍生自不同来源的结构定义的两种组分。例如，在多肽的上下文中使用“异源的”的情况下，该多肽包含可操作地连接的氨基酸序列，其可以衍生自具有不同氨基酸序列(例如，来自第一多肽的第一氨基酸序列和来自第二多肽的第二氨基酸序列)的多肽。类似地，在编码嵌合多肽的多核苷酸的上下文中，“异源的”包含可操作地连接的核酸序列，其可以衍生自不同的基因(例如，来自编码根据本文公开的一个实施例的肽的第一部分的核酸的第一组分和来自编码本文公开的肽的第二部分的核酸的第二组分)。

在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，衍生自抗微生物肽的多肽)的上下文中，“衍生自”旨在指示该多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸的序列，并且不旨在限制蛋白质或核酸的来源或制备方法。

术语“可操作地连接”是指分子之间的提供期望功能的功能性连接。例如，在多肽的上下文中，“可操作地连接”是指氨基酸序列(例如，不同结构域的)之间的提供多肽的所述活性的功能性连接。在核酸的上下文中，“可操作地连接”是指核酸之间的提供期望功能(如转录、翻译等)的功能性连接，例如核酸表达控制序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点阵列)和第二多核苷酸之间的功能性连接，其中表达控制序列影响第二多核苷酸的转录和/或翻译。

如本文在多肽结构的上下文中所使用，“N末端”和“C末端”分别是指多肽的极端氨基和羧基末端，而“N端”和“C端”分别是指多肽的氨基酸序列中朝向N末端和C末端的相对位置，并且可以分别包含N末端和C末端处的残基。“紧邻N端”或“紧邻C端”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。

“分离的”是指感兴趣的蛋白质(例如，膜相互作用肽)，如果其是天然存在的，则其处于与其可能天然存在的环境不同的环境中。“分离的”旨在包含样本内的蛋白质，这些样本基本上富含感兴趣的蛋白质，和/或其中感兴趣的蛋白质被部分地或基本上纯化。在蛋白质不是天然存在的情况下，“分离的”指示该蛋白质已经从其通过合成或重组方式制备的环境中分离出来。

“富集的”意指样本经过非天然操纵(例如，由实验人员或临床医生)，使得感兴趣的蛋白质以比起始样本中的蛋白质浓度更高的浓度存在，该起始样本如生物样本(例如，其中天然存在蛋白质或施用后存在蛋白质的样本)，或其中制备蛋白质的样本(例如，如在细菌蛋白等中)。

“基本上纯的”指示实体占组合物总含量(例如，组合物的总蛋白质)的约50％以上，或占总蛋白质含量的约60％以上。例如，“基本上纯的”肽是指其中总组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多是总蛋白质的感兴趣的实体(例如，95％、98％、99％、大于99％)的组合物。蛋白质可以占组合物中的总蛋白质的大于约90％或大于约95％。

术语“结合”是指由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用(包含诸如盐桥和水桥等相互作用)的两个分子之间的直接缔合。

如本文所使用，术语“亲核部分”是指包含亲核反应性基团的官能团。亲核反应性基团包含能够与亲电试剂反应的至少一对自由电子。亲核部分的实例包含硫亲核试剂，如硫醇、硫醇盐阴离子、硫醇羧酸盐阴离子、二硫代碳酸盐阴离子和二硫代氨基甲酸盐阴离子；氧亲核试剂，如氢氧化物阴离子、醇、醇盐阴离子和羧酸盐阴离子；氮亲核试剂，如胺、叠氮化物和硝酸盐；以及碳亲核试剂，如烷基金属卤化物和烯醇。

如本文所可互换地使用，术语“患者”或“受试者”可以是指人或非人动物，例如哺乳动物，包含人、灵长类动物、家畜和农场动物，以及动物园、运动、实验室或宠物动物，如马、牛、狗、猫、啮齿动物等。

具体实施方式

在更详细地描述本公开的发明之前，应理解，方法和组合物不限于所描述的特定实施例，因此，这些方法和组合物当然可以有所不同。还应理解，本文中所使用的术语仅为了描述特定实施例，并不意图进行限制，因为本公开的范围将仅受限于所附权利要求。

在提供一系列值的情况下，要理解，在该范围的上限与下限之间的每个居中值(到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指示)以及在该规定范围中的任何其它规定值或居中值被包含在本发明内。这些较小范围的上限与下限可以独立地被包含在所述较小范围中以及也被包含在本发明中，受制于在规定范围中的任何明确排除的界限。在规定范围包含所述界限中的一者或两者的情况下，排除那些被包含界限中的任一者或两者的范围也被包含在本发明中。

本文给出了某些范围，其中数值前面有术语“约”。术语“约”在本文中用于提供其后面的确切数字的字面支持，以及接近或近似该术语后面的数字的数字。在确定数字是否接近或近似具体记载的数字时，接近或近似未记载的数字可以是在其呈现的上下文中提供具体记载的数字的实质等同物的数字。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

尽管类似于或等同于本文所述的任何发明也可以用于本发明的实践或测试，但现在将描述代表性的说明性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与引用所述出版物相关的材料和/或方法。

任何出版物的引用都是针对其在申请日之前的公开，并且不应该被解释为承认本发明无权先于该出版物，因为所提供的出版日期可能不同于可能需要独立确认的实际出版日期。

要注意，如在本文中和在所附权利要求中所使用，单数形式“一”、“一个”和“该”包含复数个指示物，除非上下文另有明确指示。还要注意，权利要求可以被起草成排除任何可选元素。因此，该声明意图用作诸如连接权利要求元素的列举的“单独地”、“仅仅”等的排外性术语的使用或“负面”限制的使用的先行基础。

应当理解，为了清楚起见，在单独实施例的语境下描述的本发明某些特征也可以在单个实施例中以组合形式提供。相反，为了简洁起见在单个实施例的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。实施例的所有组合由本公开具体包含，并且在本文中公开，就好像每一个组合被单独和明确地公开，在这个意义上这种组合包含可操作的方法和/或组合物。

此外，在描述这些变量的实施例中列出的所有子组合也由本发明具体包含，并且在本文中公开，就好像每一个这种子组合在本文中单独和明确地公开。

本领域技术人员在阅读本公开时将理解，本文描述和示例的每个单独实施例具有离散的组件和特征，其可以容易地与任何其它几个实施例的特征分离或组合而不脱离本方法的范围或精神。任何记载的方法可以按照所记载事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

概述

本公开总体上提供了可活化和可检测的膜相互作用肽，其可以用于标识受试者的与特定生物活性(例如，蛋白水解)相关联的区域。活化后，本公开的前分子能够形成α-螺旋结构，其与磷脂双层(如细胞膜)相互作用并插入到其中。本公开还提供了使用这种化合物的方法。

本公开的化合物可用于例如与颗粒酶活性评估相关的方法中。例如，可以向受试者施用具有可被颗粒酶切割的部分X

本公开的组合物可以用于多种方法，包含例如用于对受试者体内的活性凝块、感染或恶性肿瘤进行直接成像。

限制性相互作用肽

本公开的前分子具有从N末端到C末端或从C末端到N末端的通用结构：

A-X

其中

A是具有多个非极性疏水氨基酸残基的膜相互作用肽区域，其在从组合物切割后，包含能够与磷脂双层相互作用的α-螺旋结构；

Z是抑制肽区域，其可以抑制部分A的活性，并且在一些实施例中，可以促进前分子与特定酶的靶向相互作用；并且

X

在颗粒酶介导的X

在一些实施例中，本公开的前分子具有从N末端到C末端或从C末端到N末端的通用结构：

X

其中

A、X

X

包含部分A或部分Z的切割产物的检测可以通过检测通过化学手柄X

下文更详细地描述了本公开的化合物和方法的各种特征。

完整结构X

完整结构X

本领域的普通技术人员将了解，本公开的前分子可以适用于多种情况，例如，通过提供在切割提供条件方面有所不同的颗粒酶可切割的接头。在一些实施例中，前分子具有从N末端到C末端或从C末端到N末端的结构，A-X

限制性相互作用肽的性质

如上所述，本公开的前分子具有通用结构X

肽的pI可以通过取代、消除或引入氨基酸残基，以便改变肽的总净电荷来调节。减少肽的净电荷会降低其pI值。例如，消除一个或多个带正电的氨基酸残基(例如，K、R或H)或用不带电或带负电的残基替换这些残基会降低肽的pI值。

给定肽的pI可以通过使用用于pI估计的计算机算法(例如，蛋白质计算器，斯克里普斯研究所)容易地确定。这种计算机算法可容易地经由互联网获得，并且可以基于肽的氨基酸序列确定肽的理论pI值。本公开的前分子被设计成具有小于或等于7的理论pI值。

本公开的前分子通常被设计成具有优选小于或等于约零的总净电荷。例如，这可以通过在部分A或部分Z的多肽序列中取代、消除或引入各种氨基酸残基，或通过向部分Z引入带电的部分以中和前分子的总电荷来实现。被引入以中和其它氨基酸残基或化学部分的电荷的带电的氨基酸残基或部分被放置得尽可能彼此靠近以最大化电荷抵消效果(例如，距离不超过约40埃)。在一些实施例中，如果例如膜相互作用区段自发地插入到磷脂膜中的倾向受到限制，则本公开的前分子不需要具有小于或等于约零的总电荷。

任选地缀合到本公开的前分子的货物部分可以带电，并且因此可以影响前分子的pI值和总净电荷，从而影响对膜相互作用活性的限制。加到前分子上的特定货物部分上的电荷通常会抵消或中和与其所缀合的前分子的总净电荷，并且将总pI降低到7或更低的值。例如，总净电荷为+1的前分子可以缀合到电荷为-1的可检测部分，以产生总净电荷为零的分子。水溶性荧光染料，如花青染料家族中的那些，包含Cy3、Cy5和Cy7，在这方面特别有用，因为它们具有来自两个带负电的硫酸盐基团和一个叔胺基团的两性离子性质。金属螯合部分，如能够结合放射性同位素镓-68或锝-99m的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，也具有两性离子性，其带有多个带正电和带负电的部分。金属与DOTA或DTPA的结合是通过胺基发生的，因此允许这些实体赋予至多-4的电荷。

也可以通过改变部分Z的总长度来调节部分Z抑制或防止部分A与磷脂双层相互作用的能力。这可以通过例如向部分Z添加氨基酸残基，或通过将分子(如水溶性聚合物)缀合到部分Z来实现。在一些实施例中，向部分Z添加带负电的氨基酸或类似的化学修饰，如磷酸盐或硫酸盐部分。在一些实施例中，将聚乙二醇缀合到部分Z，以便增加部分Z的长度并增强其抑制部分A在活化前与细胞膜相互作用的能力。在一些实施例中，可以将整个蛋白质(例如，白蛋白)缀合到部分Z。在某些实施例中，缀合到部分Z的聚合物或蛋白质还可以增加前分子的循环半衰期。在一些实施例中，本公开的前分子可以缀合到具有支化、树枝状或其它多价结构的聚合物。

部分A—膜相互作用肽

本公开的膜相互作用肽包含例如在接触介电常数低于水的环境时能够形成α-螺旋结构的氨基酸序列。在颗粒酶介导的X

α螺旋是蛋白质二级结构中的常见基序，并且通常包含由氢键稳定的右手盘绕或螺旋构象，其中第一氨基酸残基的N-H基团与位于多肽链中四个残基之外的氨基酸残基的C＝O基团形成氢键。典型的α螺旋的每圈螺旋包含大约3.6个氨基酸残基，并且是紧密堆积的结构。构成α螺旋的氨基酸残基的侧链朝向螺旋的外侧。部分地由于氨基酸侧链的不同化学性质，不同的氨基酸序列具有不同的形成α螺旋的倾向。

如上所述，本公开的前分子通常包含膜相互作用肽部分A。部分A可以衍生自天然存在的多肽，或者可以是天然存在的多肽的变体。部分A的总长度可以为例如约5至约10个氨基酸，或者可以为至多约15、至多约20、至多约25或至多约30个氨基酸。部分A的大小可以为约5至约10个氨基酸长，或者可以为约10至约15、约15至约20、约20至约25或约25至约30个氨基酸长。部分A的长度不长于约35个氨基酸残基。

膜相互作用肽通常包含多个非极性、疏水氨基酸残基(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸或脯氨酸)，但也可以包含其它类型的氨基酸，例如极性不带电、极性酸性和/或极性碱性氨基酸残基。一般来说，本公开的膜相互作用肽包含少于5个极性碱性氨基酸残基。在一些实施例中，部分A的氨基酸序列包含两到三个连续的非极性疏水氨基酸残基的多个区域，其中散布有一至两个连续的极性不带电、极性酸性或极性碱性残基的区域。在X

抗微生物肽

通过膜相互作用引发其效果的抗微生物肽在本领域熟知的，并且包含如普通林蛙素家族蛋白质等实例，其可以从属于普通林蛙物种的青蛙的皮肤天然获得。抗微生物肽通常包含少于约30个氨基酸残基，并且在生理条件下，含有具有非极性疏水氨基酸残基的α-螺旋结构，这促进它们与细胞膜的磷脂双层的相互作用。这种相互作用通常可以包含从结构化的桶板孔到广义的类似洗涤剂的行为的范围内的各种类型。在本公开的一些实施例中，天然存在的抗微生物肽的氨基酸序列被用作膜相互作用肽。在其它实施例中，包含相对于天然存在的抗微生物肽的修饰(例如，一个或多个氨基酸残基的消除、引入或取代，如二硫键等化学修饰的添加，或其它化学修饰(例如，酰胺化))的膜相互作用肽被用作膜相互作用肽。在其它实施例中，肽序列能够进行自发膜相互作用和/或插入，但不与膜破坏活性相关联。

抗微生物肽的实例如下提供。

对膜相互作用肽的修饰

可以将抗微生物肽或其部分以其天然存在的形式掺入本公开的化合物中，或者可以对其进行修饰以改变其化学性质并使其适用于期望用途。例如，抗微生物肽的膜相互作用潜力可以通过例如在蛋白质序列中添加、消除或取代某些氨基酸残基来增强或减弱。可以进行这种添加、消除或取代，例如以引入带电的氨基酸残基、消除带电的氨基酸残基、引入疏水氨基酸残基、消除疏水氨基酸残基等。

在一些实施例中，可以通过用二硫键或其它化学修饰(例如，酰胺化)对肽进行化学修饰来改变抗微生物肽序列。许多抗微生物肽是通过这种修饰天然产生的，以提高它们与磷脂膜相互作用的效力和对蛋白水解的抗性。

普通林蛙素

在一些实施例中，部分A包含来自普通林蛙素家族的蛋白质。普通林蛙素家族中的蛋白质的长度通常在约10至约14个氨基酸的范围内。表现出在每个位置可发现最丰富的氨基酸的普通林蛙素家族蛋白质的共有序列是：FLP(I/L)IASLL(S/G)KLL(SEQ ID NO:8)。表现出在每个位置可发现通用氨基酸类型的普通林蛙素家族蛋白质的共有序列是：X

如上所述，可以通过消除或取代氨基酸残基中的一个或多个来改变抗微生物肽序列。例如，在一些实施例中，膜相互作用肽包含普通林蛙素-L，其氨基酸序列是FVQWFSKFLGRIL(SEQ ID NO:1)。在其它实施例中，膜相互作用肽包含具有氨基酸序列FVQWFSKFLGKLL(SEQ ID NO:2)的普通林蛙素-L衍生物，其中普通林蛙素-L序列的位置11和12处的氨基酸残基R和I已分别被氨基酸残基K和L替换。在一些实施例中，膜相互作用肽包含具有氨基酸序列FVQWFSKFLGK(SEQ ID NO:3)的普通林蛙素-L衍生物，其中普通林蛙素-L序列的位置11处的氨基酸残基R已被氨基酸残基K替换，并且不存在普通林蛙素-L序列的位置12和13处的氨基酸残基I和L。

表1：长度为13个氨基酸的普通林蛙素和普通林蛙素样肽的氨基酸序列。该家族的较长和较短成员也已描述，但不包含在此表中。

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在本公开的一些实施例中，膜相互作用肽包含表1中列出的普通林蛙素或普通林蛙素样肽或其保守氨基酸取代。在本公开的一些实施例中，膜相互作用肽包含普通林蛙素-L的序列(FVQWFSKFLGRIL：SEQ ID NO:1)或其保守氨基酸取代。

原连接素(Protonectin)

在本公开的一些实施例中，膜相互作用肽包含具有氨基酸序列ILGTILGLLKGL(SEQID NO:5)或其保守氨基酸取代的原连接素。

日本林蛙素

在一些实施例中，膜相互作用肽可以包含表2中列出的日本林蛙素或日本林蛙素样肽或其保守氨基酸取代。在本公开的一些实施例中，膜相互作用肽包含日本林蛙素-1的序列(FFPIGVFCKIFKTC：SEQ ID NO:38)或其保守氨基酸取代。日本林蛙素可从日本林蛙的皮肤天然获得，其长度范围为约14至约21个氨基酸残基。下表示出了可用于本公开的前分子和方法中的几种日本林蛙素和日本林蛙素样肽的氨基酸序列。

表2：日本林蛙素和日本林蛙素样肽的氨基酸序列。

在本公开的一些实施例中，膜相互作用肽包含表2中列出的日本林蛙素或日本林蛙素样肽或其保守氨基酸取代。

另外的肽

除了上述肽之外，本公开的前分子可以包含下表中列出的膜相互作用肽或其保守氨基酸取代。在一些实施例中，下表中列出的肽包含可以调节其活性的N端和/或C端修饰。

表3.适用于部分A的肽。

部分Z–膜相互作用抑制肽

本公开的化合物通常包含部分Z，当通过部分X

部分Z通常是长度包含约2至约15个氨基酸残基的多肽。在一些实施例中，部分Z的长度为至多约5、至多约10、至多约15、至多约20、至多约25、至多约30、至多约35、至多约40、至多约45或至多约50个氨基酸。在一些实施例中，部分Z的长度范围为约2至约5、约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约35、约35至约40、约40至约45或约45至约50个氨基酸。部分Z的长度不超过约55个氨基酸。

部分Z可以包含任何类型的氨基酸残基。在一些实施例中，部分Z可以任选地包含可检测部分，以促进在X

识别结构域

部分Z可以被设计成有助于调节X

在一些实施例中，部分Z包含衍生自酶促颗粒酶活化剂的天然存在的生理底物的氨基酸序列。在一些实施例中，部分Z包含衍生自组合肽文库筛选分析的氨基酸序列，所述组合肽文库可能与酶促颗粒酶活化剂的生理底物相似或不相似。

在一些实施例中，部分Z包含蛋白酶活化受体-1(PAR-1)的序列，其具有氨基酸序列SFLLRNPNDKYEPFW(SEQ ID NO:55)或其保守氨基酸取代。在其它实施例中，部分Z包含氨基酸序列SFLLQDPNDQYEPFW(SEQ ID NO:56)或其保守氨基酸取代。在一些实施例中，部分Z包含氨基酸序列QDPNDQYEPF(SEQ ID NO:7)或其保守氨基酸取代。

X

在本公开的前分子中，部分A通过可切割的接头X

X

X

X

可酶促切割的接头

通过特定条件(如在存在颗粒酶活性的情况下)切割的X

X

可被颗粒酶切割的接头

在一些实施例中，X

在一些实施例中，X

在一些实施例中，X

在一些实施例中，X

多个接头的组合

在一些实施例中，X

嵌合X

在一些实施例中，嵌合X

在一些实施例中，嵌合X

在一些实施例中，嵌合X

例如，为了检测颗粒酶或缺氧的存在(即，在存在颗粒酶活性或缺氧的情况下切割X

可替代地，为了检测颗粒酶活性和缺氧两者的存在(即，在存在颗粒酶活性和缺氧的情况下，而不在仅单独存在这些条件中的一种的情况下切割X

在某些实施例中，本公开的前分子可以具有下式(I)，其中部分X

其中X

式(I)的分子的合成可以用标准肽偶联化学进行。例如，作为式(I)的化合物的前体，可以使用标准肽偶联化学来制备下式(II)的化合物，其中X

肽偶联反应通常采用常规的肽偶联试剂，并且在常规的偶联反应条件下进行，通常在存在三烷基胺(如乙基二异丙基胺或二异丙基乙基胺(DIEA))的情况下进行。举例来说，适用的偶联剂包含碳二亚胺，如乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)等，以及其它熟知的偶联剂，如N,N'-羰基二咪唑、2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)等。任选地，在该反应中，可以采用熟知的偶联促进剂，如N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)、N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)等。通常，该偶联反应在惰性稀释剂(如THF或DMF)中在约0℃至约60℃的温度下进行约1至约72小时。

在制备化合物的任何过程期间，可能需要和/或期望保护任何相关分子上的灵敏性或反应性基团。这可以通过标准著作(如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,"有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)",第四版,Wiley,New York 2006)中描述的常规保护基团来实现。保护基团可以在方便的后续阶段使用本领域已知的方法去除。例如，在合成过程期间，天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸残基可以用各种保护基团保护。取决于所使用的保护基团的类型，可以在合成过程期间有利地使用去保护的选择性。本领域普通技术人员将能够选择适合合成方案的保护基团类型。

具有环状结构的上述双接头可以通过使用天冬氨酸或谷氨酸的羧基侧链作为肽主链的羧基手柄并使用赖氨酸的氨基侧链作为肽主链的氨基手柄来合成。式(I)的合成可以使用标准肽偶联化学进行。肽偶联反应通常采用常规的肽偶联剂，并且在如上所讨论的常规偶联反应条件下进行。

部分X

本公开的前分子可以包含任选的部分X

货物部分可以是例如可检测部分，其可以通过各种成像模式促进前分子的检测；或者可以是例如治疗剂，其可以促进疾病或病状的治疗。

可检测部分的非限制性实例包含荧光染料和放射性同位素。在一些实施例中，两个或更多个货物部分可以连接到相同的前分子(例如，荧光染料和放射性同位素连接到相同的前分子)。不同的货物部分可以配对，以使用多种模式进行同时检测。例如，使用核成像剂的非侵入性检测可以与荧光相结合，以能够进行增强的但具侵入性的(例如，外科手术)检测的后续研究。

在一些实施例中，可检测部分可以包含荧光染料。可以缀合到本公开的前分子的荧光染料的非限制性实例包含花青染料，如荧光素、四甲氧基罗丹明、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5或Cy7、IRdye 800cw或ATTO-TEC

在一些实施例中，可检测部分可以包含金属螯合部分。金属螯合部分的非限制性实例包含1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4-双(羧甲基)-6-[双(羧甲基)]氨基-6-甲基-全氢-1,4-二氮杂卓(AAZTA)、去铁胺(DFO)、3,4,3-(LI-1,2-HOPO)(HOPO)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、4,11-双-(羧甲基)-1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]-十六烷(CB-TE2A)、N,N’-双(2-羟基苄基)-乙二胺-N,N’-二乙酸(HBED)。

在一些实施例中，可检测部分可以包含放射性同位素，例如通过金属结合部分螯合的放射性同位素。放射性同位素的非限制性实例包含锕-225、砹-211、铋-212、铋-213、溴-76、溴-77、钙-47、碳-11、碳-14、铬-51、钴-57、钴-58、铜-64、铒-169、氟-18、镓-67、镓-68、氢-3、铟-111、碘-123、碘-125、碘-131、铁-59、氪-81m、铅-212、镥-177、氮-13、氧-15、磷-32、镭-223、镭-224、钐-153、硒-75、钠-22、钠-24、锶-89、锝-99m、铊-201、钍-226、钍-227、氙-133或钇-9。在一些实施例中，可检测部分是铜-64。

在一些实施例中，可检测部分是缀合到金属螯合部分DOTA的放射性同位素铜-64。

在一些实施例中，货物部分是放射性同位素。在此类实施例中，可以使用X射线、荧光透视、血管造影术、正电子发射断层扫描(PET)或单正电子发射计算机断层扫描(SPECT)来检测货物部分，其中将细胞、组织或整个受试者置于成像模式的视野中并将其可视化。

在一些实施例中，切割产物的检测以生物体水平进行。在一些实施例中，检测在靶区域内进行。在一些实施例中，检测发生在施用后(例如，注射后，如静脉内施用后)的延长时间点，如注射后0.5至24小时。在一些实施例中，检测发生在施用后，例如注射后的多个时间点。

在一些实施例中，具有本公开的特征的单个前分子可以包含多于一个货物部分，使得部分A可以连接到多个可检测部分，或者连接到可检测部分和治疗剂，或者连接到多个治疗剂。这种多个可检测部分可以包含不同类型的标志物，并且可以允许例如放射性同位素和造影剂或荧光染料的连接，从而允许通过不同模式进行成像。

包含通过部分X

可以缀合到本公开的前分子的治疗剂的非限制性实例包含放射性同位素，如锕-225、砹-211、铋-212、铋-213、溴-76、溴-77、钙-47、碳-11、碳-14、铬-51、钴-57、钴-58、铜-64、铒-169、氟-18、镓-67、镓-68、氢-3、铟-111、碘-123、碘-125、碘-131、铁-59、氪-81m、铅-212、镥-177、氮-13、氧-15、磷-32、镭-223、镭-224、钐-153、硒-75、钠-22、钠-24、锶-89、锝-99m、铊-201、钍-226、钍-227、氙-133或钇-9。

在一些实施例中，特定部分可以既作为可检测部分又作为治疗剂。

制备方法

本公开的前分子可以通过任何合适的方法制备，包含但不限于重组和非重组(例如，化学合成)方法。货物部分可以通过任何合适的方法缀合到前分子，包含但不限于亲核加成反应。

前分子的产生

本公开的前分子可以通过任何合适的方法产生，包含重组和非重组方法(例如，化学合成)。

在多肽被化学合成的情况下，合成可以经由液相或固相进行。固相合成(SPPS)允许非天然氨基酸、肽/蛋白质主链修饰的掺入。各种形式的SPPS，如Fmoc和Boc，可用于合成本公开的肽。化学合成的细节是本领域已知的(例如，Ganesan A.2006Mini Rev.MedChem.6:3-10和Camarero JA等人2005Protein Pept Lett.12:723-8)。简而言之，用其上构建肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在重复的偶联/去保护循环之后，固相连接的肽或氨基酸的游离N端胺偶联到单个N保护的氨基酸单元。然后，将该单元去保护，从而呈现出一个新的N端胺，其上可以连接另一个氨基酸。肽保持固定在固相上，并且在被切割之前经历过滤过程。

在使用重组技术生产多肽的情况下，使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞，可以将蛋白质生产为细胞内蛋白质或分泌蛋白质，所述宿主细胞可以是原核或真核细胞，分别如细菌(例如，大肠埃希氏杆菌)或酵母宿主细胞。

可以用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包含昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞的情况下，细胞可以包含以下中的一种或多种：人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，X3、NIH3T3、胰腺导管腺癌2.1、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如，Cos 1、Cos 7和CV1)和仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。

根据本领域已知的标准程序，可以采用适合于主题多肽的表达的多种宿主-载体系统。参见例如Sambrook等人1989《分子生物学中的当前协议(Current Protocols inMolecular Biology)》纽约冷泉港出版社和Ausubel等人1995《分子生物学中的当前协议(Current Protocols in Molecular Biology)》,Wiley and Sons编。用于将遗传材料引入宿主细胞的方法包含例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙法等。可以选择转移方法，以便稳定表达引入的多肽编码核酸。多肽编码核酸可以作为可遗传的附加型元件(例如，质粒)提供，或者可以是基因组整合的。用于产生感兴趣的多肽的多种适当的载体是可商购的。

载体可以允许宿主细胞中的染色体外维持，或者可以允许整合到宿主细胞基因组中。表达载体提供转录和翻译调控序列，并且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区和转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。一般来说，转录和翻译调控序列可以包含但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化剂序列。启动子可以是组成型或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如，T7等)。表达构建体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码感兴趣的蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中可操作的选择性标志物，以促进含有载体的细胞的选择。此外，表达构建体可以包含另外的元件。例如，表达载体可以具有一个或两个复制系统，从而允许其在生物体中维持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中用于表达，以及在原核宿主中用于克隆和扩增。此外，表达构建体可以含有选择性标志物基因，以允许转化的宿主细胞的选择。选择性基因在本领域是熟知的，并且将随着所使用的宿主细胞而有所不同。

蛋白质和/或抗体的分离和纯化可意根据本领域已知的方法来完成。例如，可以通过免疫亲和纯化，从经遗传修饰以组成型地和/或在诱导时表达蛋白质的细胞裂解物，或从合成反应混合物分离蛋白质，所述免疫亲和纯化通常涉及将样本与抗蛋白质抗体接触，洗涤以去除非特异性结合的材料，并且洗脱特异性结合的蛋白质。分离的蛋白质可以通过透析和蛋白质纯化方法中通常采用的其它方法进一步纯化。在一个实施例中，可以使用金属螯合物色谱法分离蛋白质。本公开的蛋白质可以含有促进分离的修饰。

主题多肽可以以基本上纯的或分离的形式制备(例如，不含其它多肽)。蛋白质可以存在于相对于可能存在的其它组分(例如，其它多肽或其它宿主细胞组分)富含多肽的组合物中。可以提供纯化的蛋白质，使得该蛋白质存在于基本上不含其它表达的蛋白质的组合物中，例如组合物的少于98％、少于95％、少于90％、少于80％、少于60％或少于50％由其它表达的蛋白质构成。

货物部分与多肽的缀合

可以使用任何合适的技术，包含但不限于利用亲核部分的亲核加成反应，将货物部分缀合到本公开的前分子。这种反应的非限制性实例包含硫亲核试剂、氧亲核试剂、碳亲核试剂或氮亲核试剂与合适的亲电试剂反应形成共价键。

任选的修饰

本公开的前分子可以进一步被修饰以通常提供例如更长的循环半衰期、将前分子限制在某些解剖区室(例如，限制到心血管系统)、防止非特异性降解和/或增强对某些成像模式的灵敏度。

在一些实施例中，可以使用本领域已知的技术将两个或更多个前分子连接到中心分子，例如聚乙二醇(PEG)分子，以形成树枝状聚合物。合适的PEG分子可以具有至多约1,000、至多约5,000、至多约10,000、至多约20,000、至多约30,000或至多约40,000道尔顿的分子量。两个或更多个前分子与中心PEG分子的缀合可以通过例如用一个或多个末端处的官能团活化PEG分子，然后将活化的PEG分子与本公开的一个或多个前分子反应来实现。官能团的选择取决于前分子上可用的反应性基团，如N端胺、C端羧酸或残基，如赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸或其它特异性反应位点。可以使用这种技术产生线性单臂PEG结构以及支化PEG结构。

在一些实施例中，形成具有以下通式的线性单臂PEG结构：X

组合物

还提供了包含本公开的任何前分子的组合物。该组合物可以包含本公开的任何前分子，包含上文和下文实验部分中描述的任何前分子。

在某些实施例中，本公开的组合物包含存在于液体介质中的本公开的任何前分子。液体介质可以是水性液体介质，如水、缓冲溶液等。一种或多种添加剂，例如盐(例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4)、缓冲剂(Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟基甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等)、增溶剂、去污剂(例如非离子型去污剂，如吐温-20等)、核糖核酸酶抑制剂、甘油、螯合剂等可以存在于这种组合物中。

本公开的各方面进一步包含药物组合物。本公开的前分子可以被调配在适于向受试者施用(例如，通过期望途径)的多种药物组合物中。包含本公开的前分子的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，多种赋形剂是本领域已知的，并且无需在本文中详细讨论。

在一些实施例中，本公开的前分子被调配成用于向受试者肠胃外施用，例如静脉内施用。药学上可接受的赋形剂在各种出版物中有详细描述，包含例如“《雷明顿：制药科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》”,第19版(1995)或最新版,麦克出版公司(Mack Publishing Co；A.Gennaro(2000))“《雷明顿：制药科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》”,第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；《药物剂型和药物输送系统(Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems)》(1999)H.C.Ansel等人编,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；以及《药用辅料手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》(2000)A.H.Kibbe等人编,第3版Amer.Pharmaceutical Assoc。

在一些情况下，主题药物组合物将适合于注射到受试者体内，例如将是无菌的。例如，在一些实施例中，主题药物组合物将适于注射到人受试者体内，例如其中组合物是无菌的并且不含可检测的热原和/或其它毒素。

主题药物组合物可以包含其它组分，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。所述组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、盐酸盐、硫酸盐、溶剂化物(例如，混合离子盐、水、有机物)、水合物(例如，水)等。

本公开的前分子可以被调配成含有预定量的本文公开的前分子的单位剂型。适于注射或静脉内施用的单位剂型可以包含本公开的前分子，其在组合物中为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体中的溶液。

如本文所使用，术语“单位剂型”是指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的本公开的前分子，其以足以与药学上可接受的稀释剂、载体或媒剂结合产生期望效果的量计算。本公开的单位剂型的规格取决于所采用的特定前分子和待达到的效果，以及受试者中的与每个前分子相关联的药效学。

公众可容易地获得药学上可接受的赋形剂，如媒剂、佐剂、载体或稀释剂。此外，公众可容易地获得药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等。

本公开的前分子也可以被调配成用于向患者口服施用。对于口服制剂，缀合物可单独使用或与适当的添加剂组合使用，以制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合使用。

本公开的前分子可以用于待经由吸入施用的气雾剂调配物中，或者可以被调配成可接受的加压抛射剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

此外，本公开的前分子可以通过与各种基质，如乳化基质或水溶性基质混合制成栓剂。本发明的前分子可以经由栓剂直肠施用。栓剂可以包含媒剂，如可可脂、碳蜡和聚乙二醇，它们在体温下熔化，但在室温下固化。

可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型，如糖浆剂、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单位，例如茶匙、汤匙、片剂或栓剂，含有预定量的本公开的前分子。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可以在组合物中包含一种或多种前分子，作为在无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体中的溶液。

在一些实施例中，本公开的前分子被调配成用于向受试者局部施用，例如在期望作用部位处或其附近。在一些实施例中，本公开的前分子被调配成缓释剂型，该剂型被设计成在特定时间段内以预定速率释放前分子。

本公开的前分子也可以与影响前分子在施用于受试者时的药代动力学特征的试剂一起调配。这类试剂包含维拉帕米或其它等同物。

施用途径

在实践本公开的方法时，可以根据多种因素中的任一种来选择施用途径，例如待递送的前分子的性质、所诊断、检测或治疗的病状的类型(例如，凝块的检测)等。本公开的前分子可以通过将前分子递送到血流(例如，通过肠胃外施用，如静脉内施用、肌内施用和/或皮下施用)或递送到特定组织或器官(例如，肌肉组织、心脏组织、血管组织等)的施用途径来递送。可以使用注射来完成肠胃外施用。在一些实施例中，前分子通过将前分子直接递送到受影响组织中的施用途径(例如，通过直接注射到靶组织或器官中)来递送。

本公开的前分子可以通过呼吸道施用。这种剂型可以是发烟装置、干粉吸入器、加压定量吸入器、喷雾器、汽化器等。

本公开的前分子可以通过让受试者吞咽合适的剂型，如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等口服施用。本公开的前分子也可以以栓剂的形式直肠施用。

本公开的前分子可以通过直接注射到靶组织或血流中来施用，包含皮内、皮下、静脉内、心内、肌内、骨内或腹膜内注射。本公开的前分子可以通过海绵体内或玻璃体内递送到器官或组织来施用，或者通过脑内、鞘内或硬膜外递送到中枢神经系统组织来施用。

本公开的前分子可以局部(locally/topically)施用。这种施用可以通过将合适的调配物直接局部应用于靶组织来实现。前述施用途径、调配物和剂型仅仅是示例性的，决不是限制性的。

剂量

在本公开的方法中，向受试者施用有效实现期望诊断、检测或治疗的量的前分子。

施用量取决于施用目的、待治疗个体的健康和身体状况、年龄、期望的消退程度、主题组合物的配方、所采用的主体组合物的活性、治疗临床医生对医疗状况的评估、受试者的病状、受试者的体重以及所诊断、检测和/或治疗的疾病、病症或病状的严重程度和其它相关因素而有所不同。剂量的大小也将由可能伴随特定组合物的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定。

预计该量将在相对较宽的范围内，该范围可以通过常规试验确定。例如，用于检测受试者中的颗粒酶活性或颗粒酶分泌免疫细胞的活化的本公开前分子的量不超过可能对受试者有不可逆毒性的量(即，最大耐受剂量)。在其它情况下，该量大约为或甚至远低于毒性阈值，但仍在有效浓度范围内，或甚至低至阈值剂量。在一些实施例中，向受试者施用1至200μg、50至150μg或75至125μg(例如，约100μg)的剂量，以检测颗粒酶活化或颗粒酶分泌免疫细胞的活化。

在某些实施例中，前分子静脉内施用，并且在FDA针对PET微剂量给药研究定义的质量剂量限制内。根据一些实施例，限制为最小药理活性剂量的1/100或小于100μg。在一些情况下，应用于人的剂量通过动物(例如，小鼠)剂量测定数据决定。在某些实施例中，前分子以1mCi/注射至20mCi/注射的剂量施用，例如5mCi/注射至15mCi/注射。有效量的前分子可以在一次或多次施用(例如，一次或多次、两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次或五次或更多次施用)中施用。

使用方法

本公开提供了使用可活化和可检测的膜相互作用肽来诊断和/或治疗通常涉及局部生物学过程(如蛋白水解)的疾病或病状的方法。例如，在某些情况下，本公开的前分子可用作指导和/或监测疗法(例如，免疫调节疗法，如基于细胞的疗法，例如CAR T细胞疗法等)的诊断工具。这些方法通常涉及检测可能与特定疾病、病状和/或免疫反应相关联的生物过程，如蛋白水解。本公开的前分子还可用于治疗特定的疾病或病状，以及用于涉及将治疗剂递送到患者体内的特定部位或位置的方法。

一般来说，本公开的方法涉及选择含有可切割接头X

当前分子在受试者体内遇到颗粒酶切割促进条件(例如，活化的颗粒酶分泌免疫细胞释放颗粒酶)时，前分子被颗粒酶切割，并且含有膜相互作用肽的切割产物插入到切割促进环境附近的膜中并将其可检测地标记。这种切割产物的检测标识了标记区域中的颗粒酶活性的存在。在诊断用途和方法中，受试者体内存在颗粒酶切割促进条件的区域的标识促进疾病或病状的诊断，并且然后可以为施用和/或监测合适的疗法提供指导。在治疗用途和方法中，将治疗剂递送到患者体内的靶部位促进疾病或病状的治疗。

根据一些实施例，本公开提供了在存在颗粒酶活性的情况下可检测地标记细胞的磷脂双层的方法。这些方法包含将本公开的前分子与有助于颗粒酶活性的颗粒酶接触，其中该分子的可切割接头被颗粒酶切割以释放包含可检测部分和膜相互作用多肽部分的切割产物，使得膜相互作用多肽部分与细胞的磷脂双层相互作用，并且在存在颗粒酶活性的情况下可检测地标记细胞的磷脂双层。在一些实施例中，该接触是体外、体内或离体的。

根据一些实施例，本公开提供了评估细胞样本中的颗粒酶活性的方法。这些方法包含将该样本与本公开的前分子接触，其中在存在颗粒酶活性的情况下，该前分子被切割以释放包含可检测部分和膜相互作用多肽部分的切割产物，并且其中在存在颗粒酶活性的情况下，切割产物与细胞的磷脂双层相互作用。这些方法进一步包含评估是否存在切割产物的可检测部分，其中可检测部分的存在指示细胞样本中的颗粒酶活性。

诊断用途和方法

本公开的方法通常涉及涉及局部生物学过程(如蛋白水解)的疾病或病状的诊断和检测。在一些实施例中，本公开的方法涉及检测由与特定病状相关联的一种或多种颗粒酶的活性导致的蛋白水解。这种颗粒酶可以例如结合到位于特定组织或器官中的细胞或与其相关联，并且这种细胞的标识可以用于指导和/或监测疗法。例如，颗粒酶与颗粒酶分泌免疫细胞的活化相关联，并且这种位点的标识可以用于确定免疫调节疗法后的免疫细胞活化位点。

本公开的方法可以适于提供监测疗法的方法。例如，本公开的前分子可以在疗法之前、期间(例如，剂量之间)和/或之后施用于受试者，并且可以检测与前分子相关联的信号以促进对所治疗的病状的疗法效果。下文提供了本公开的非限制性示例性方法。

评估受试者中的颗粒酶活性

根据一些实施例，本公开提供了评估受试者中的颗粒酶活性的方法。这些方法包含施用本公开的前分子，其中在受试者中的颗粒酶活性位点处，该前分子被有助于颗粒酶活性的颗粒酶切割，以释放包含可检测部分和膜相互作用多肽部分的切割产物，并且其中切割产物在受试者中的颗粒酶活性位点处与细胞的磷脂双层相互作用。这些方法进一步包含评估是否存在用切割产物标记的细胞，其中用切割产物标记的细胞的存在指示受试者中的颗粒酶活性。

在一些实施例中，向受试者施用前分子以评估受试者中的颗粒酶活性。例如，向受试者静脉内施用具有颗粒酶可切割的X

评估受试者中的颗粒酶分泌免疫细胞活化

根据一些实施例，本公开提供了评估受试者中的免疫细胞的活化的方法，其中免疫细胞在受试者中活化时分泌颗粒酶。这些方法包含向受试者施用本公开的前分子，其中在受试者中的活化的免疫细胞分泌的颗粒酶的位点处，该前分子被活化的免疫细胞分泌的颗粒酶切割以释放包含可检测部分和膜相互作用多肽部分的切割产物，并且其中切割产物在受试者中的活化的免疫细胞分泌的颗粒酶的位点处与细胞的磷脂双层相互作用。这些方法进一步包含评估是否存在用切割产物标记的细胞，其中用切割产物标记的细胞的存在指示受试者中的免疫细胞的活化。

在某些实施例中，向受试者施用前分子以评估颗粒酶分泌免疫细胞活化。在一些实施例中，颗粒酶分泌免疫细胞是NK细胞或CTL。在一些实施例中，由CTL分泌的颗粒酶是颗粒酶B或颗粒酶K。

例如，向受试者静脉内施用具有颗粒酶可切割的X2接头并且具有与其缀合的放射性同位素部分的前分子。当前分子在活化的免疫细胞的颗粒酶分泌位点处与颗粒酶接触时，X

根据一些实施例，连接到前分子的货物部分是放射性同位素。如上所述，一旦含有部分A的切割产物插入到颗粒酶活性区域中的细胞质膜中，使用适当的成像模式，例如荧光透视、X射线、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、磁共振(MR)或正电子发射断层扫描(PET)来检测放射性同位素，以区分受试者中正在发生颗粒酶分泌免疫细胞活化的位置和/或组织。

在某些实施例中，颗粒酶分泌免疫细胞活化的评估以生物体水平进行。在一些实施例中，评估在靶区域内进行。在一些实施例中，检测发生在施用后(例如，注射后，如静脉内施用后)的延长时间点，如注射后0.5至24小时。在一些实施例中，检测发生在施用后，例如注射后的多个时间点。

根据一些实施例，评估颗粒酶分泌免疫细胞活化包含评估作为对病原体的免疫反应的一部分而被活化的免疫细胞。在某些实施例中，病原体是可能在受试者中引起疾病的微生物。根据一些实施例，受试者患有或疑似患有病原体感染。

在一些实施例中，评估颗粒酶分泌免疫细胞活化包含评估作为对病毒感染的免疫反应的一部分而被活化的免疫细胞。这种病毒感染的实例包含但不限于由腺病毒科(例如，腺病毒)、沙粒病毒科(例如，马丘波病毒)、布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒或裂谷热病毒)、冠状病毒科、正粘病毒科(例如，流感病毒)、丝状病毒科(例如，埃博拉病毒和马尔堡病毒)、黄病毒科(例如，日本脑炎病毒和黄热病病毒)、肝脱氧核糖核酸病毒科(例如，乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒)、乳多空病毒科(例如，乳头瘤病毒)、副粘病毒科(例如，呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒或副流感病毒)、细小病毒科、小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒)、痘病毒科(例如，天花病毒)、呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒)、逆转录病毒科(例如，人嗜T细胞淋巴病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV))、弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)和披膜病毒科(例如，脑炎病毒、黄热病毒和风疹病毒)引起的感染。在某些实施例中，病毒引起肺炎。

根据一些实施例，评估颗粒酶分泌免疫细胞活化包含评估作为对细菌感染的免疫反应的一部分而被活化的免疫细胞。这种细菌感染的示例包含但不限于由芽孢杆菌属(例如，炭疽芽孢杆菌)、肠杆菌科(例如，沙门氏菌、大肠埃希氏杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、克雷伯氏菌和志贺氏菌)、耶尔森氏菌属(例如，鼠疫杆菌或小肠结肠炎杆菌)、葡萄球菌属(例如，金黄色葡萄球菌)、链球菌属、淋球菌、肠球菌属(例如，屎肠球菌)、李斯特菌属(例如，单核细胞增多性李斯特菌)、布鲁氏菌属(例如，流产布鲁氏菌、羊布鲁氏菌或猪布鲁氏菌)、弧菌属(例如，霍乱弧菌)、白喉棒状杆菌、假单胞菌属(例如，伪鼻疽假单胞菌或铜绿假单胞菌)、伯克氏菌属(例如，鼻疽伯克氏菌或伪鼻疽伯克氏菌)、志贺氏菌属(例如，痢疾志贺氏菌)、立克次体(例如，立氏立克次体、普氏立克次体或斑疹伤寒立克次氏体)、土拉弗朗西斯菌、鹦鹉热衣原体、贝氏柯克斯体和支原体(例如，丝状支原体)引起的感染。在某些实施例中，细菌是大肠埃希氏杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)或肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)。根据一些实施例，细菌是大肠埃希氏杆菌。在某些实施例中，细菌是金黄色葡萄球菌。在某些实施例中，细菌是铜绿假单胞菌。根据一些实施例，细菌是肺炎克雷伯氏菌。

在一些实施例中，评估颗粒酶分泌免疫细胞活化包含评估是否存在受试者中的T细胞衰竭。T细胞衰竭的特征在于T细胞功能(例如，颗粒酶分泌)的退化和丧失，从而最终导致T细胞的丧失。例如，可以在一个或多个时间点(例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个时间点)向受试者施用本公开的前分子，以便通过评估颗粒酶分泌免疫细胞的活化随时间的变化来标识是否存在T细胞衰竭。如上所述，向受试者施用具有可被颗粒酶切割的可切割X

在一些实施例中，评估颗粒酶分泌免疫细胞活化包含评估受试者中的免疫反应。在另一个实施例中，评估免疫反应包含评估受试者是否处于发生免疫相关不利作用的风险中。例如，向受试者施用本公开的前分子，以便确定颗粒酶分泌免疫细胞活化的位置。如上所述，向受试者施用具有可被颗粒酶切割的可切割X2接头并且具有与其缀合的荧光货物部分或放射性同位素货物部分的前分子。如果存在颗粒酶分泌的免疫细胞活化，则前分子将被颗粒酶切割，部分A将经历构象变化以形成α-螺旋结构并插入到颗粒酶分泌免疫细胞活化区域中的细胞膜中，并且颗粒酶分泌免疫细胞活化区域可以通过可视化荧光部分或放射性同位素来检测。根据本公开的方法检测正常(例如，非肿瘤)组织中的系统性颗粒酶分泌免疫细胞活化可以用于标识受试者处于发生免疫相关不利作用的风险中。

监测受试者中的疗法

在一些实施例中，在疗法期间或之后向受试者施用本公开的前分子，以便监测疗法的进展。例如，在对受试者进行免疫调节疗法之后，可以向受试者施用本公开的前分子，以便确定是否发生颗粒酶分泌免疫细胞的活化以及所述活化的免疫细胞的位置。如上所述，向受试者施用具有可被颗粒酶切割的可切割X2接头并且具有与其缀合的荧光货物部分或放射性同位素货物部分的前分子。如果存在颗粒酶分泌免疫细胞活化，则前分子将在免疫细胞活化位点处被颗粒酶切割，部分A将经历构象变化以形成α-螺旋结构并插入到附近的细胞膜中，并且颗粒酶分泌免疫细胞的活化可以通过可视化荧光部分或放射性同位素来检测。如果颗粒酶分泌免疫细胞的活化不存在或已经降低，则将在治疗部位处分别检测不到信号或信号减弱。然后，治疗医生可以使用该信息来监测治疗工作的进展。

在一些实施例中，监测疗法的进展包含监测受试者中的免疫调节疗法的进展。在一些实施例中，免疫调节疗法包含基于细胞的疗法(即，出于医疗目的将自体或同种异体细胞材料转移到受试者体内)、干扰素基因刺激因子(STING)通路调节、免疫检查点抑制、化学疗法、电离辐射或其任何组合。在一些实施例中，免疫调节疗法包含基于细胞的疗法。在一些实施例中，基于细胞的疗法包含嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)疗法或包含经工程改造的T细胞受体的T细胞的施用。在一些实施例中，免疫调节疗法用于治疗受试者中的癌症。

在某些实施例中，基于细胞的治疗包含施用被工程改造成表达受体(例如，嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，如重组TCR)的细胞(例如，T细胞、NK细胞等)。根据一些实施例，当细胞被工程改造成在表达其表面上的受体时，受体的细胞外结合结构域特异性结合癌细胞的表面上表达的肿瘤抗原。受体的细胞外结合结构域可以特异性结合的肿瘤抗原的非限制性实例包含5T4、AXL受体酪氨酸激酶(AXL)、B细胞成熟抗原(BCMA)、c-MET、C4.4a、碳酸酐酶6(CA6)、碳酸酐酶9(CA9)、钙粘蛋白-6、CD19、CD20、CD22、CD25、CD27L、CD30、CD33、CD37、CD44、CD44v6、CD56、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD138、癌胚抗原(CEA)、cKit、Cripto蛋白、CS1、δ样经典Notch配体3(DLL3)、B型内皮素受体(EDNRB)、蝶素A4(EFNA4)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(ENPP3)、EPH受体A2(EPHA2)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、叶酸盐受体1(FOLR1)、GD2神经节苷脂、糖蛋白非转移B(GPNMB)、鸟苷酸环化酶2C(GUCY2C)、人表皮生长因子受体2(HER2)、人表皮生长因子受体3(HER3)、整合素α、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)、Lewis Y、LIV-1、富含亮氨酸的重复序列15(LRRC15)、间皮素(MSLN)、粘蛋白1(MUC1)、粘蛋白16(MUC16)、钠依赖性磷酸盐转运蛋白2B(NaPi2b)、粘连蛋白-4、NMB、NOTCH3、P-钙粘蛋白(p-CAD)、程序性细胞死亡受体配体1(PD-L1)、程序性细胞死亡受体配体2(PD-L2)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、溶质载体家族44成员4(SLC44A4)、SLIT样家族成员6(SLITRK6)、STEAP家族成员1(STEAP1)、组织因子(TF)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-1(TIM-1)、Tn抗原、滋养层细胞表面抗原(TROP-2)、维尔姆斯氏瘤1(WT1)和VEGF-A。

在一些实施例中，监测用于治疗癌症的免疫调节疗法的进展包含评估受试者中的肿瘤对免疫调节疗法的反应性。例如，当受试者正在经历癌症的免疫调节疗法时，向受试者施用本公开的前分子，以便确定肿瘤附近是否发生了颗粒酶分泌免疫细胞的活化。如上所述，向受试者施用具有可被颗粒酶切割的可切割X2接头并且具有与其缀合的荧光货物部分或放射性同位素货物部分的前分子。如果肿瘤附近存在颗粒酶分泌的免疫细胞活化，则前分子将被颗粒酶切割，部分A将经历构象变化以形成α-螺旋结构并插入到肿瘤附近的细胞膜中，并且肿瘤附近的颗粒酶分泌免疫细胞的活化位置可以通过可视化荧光部分或放射性同位素来检测。

在一些实施例中，监测免疫调节疗法的进展包含评估是否存在受试者中的T细胞衰竭，如上所述。例如，当受试者正在经历包含向受试者施用治疗性T细胞的免疫调节疗法时，可以在一个或多个时间点向受试者施用本公开的前分子，以便通过在一个或多个时间点评估颗粒酶分泌治疗性T细胞的活化来评估T细胞衰竭(例如，标识是否存在T细胞衰竭或标识其程度)。颗粒酶分泌免疫细胞活化的程度的降低指示T细胞功能的降低和T细胞衰竭的存在。

在一些实施例中，监测免疫调节疗法的进展包含监测受试者中的免疫反应，如上所述。在另一个实施例中，监测免疫反应包含评估受试者是否处于发生免疫相关不利作用的风险中，如上所述。例如，向受试者施用本公开的前分子，以便确定颗粒酶分泌免疫细胞活化的位置，如上所述。正常组织(例如，非肿瘤组织)中的系统性颗粒酶分泌免疫细胞活化的检测指示受试者处于发生免疫相关不利作用的风险中。

在诊断应用中检测切割产物A和Z的方法

切割产物A和Z可以通过多种成像和检测模式来检测，包含但不限于荧光显微术、X射线、荧光透视、血管造影术、正电子发射断层扫描(PET)等。检测可以通过以下完成：直接对切割产物所在的细胞或组织成像，或将切割产物所在的细胞或组织与第二分子或试剂(如抗体)接触，然后对第二分子或试剂成像或检测。

在一些实施例中，切割产物中的一种或多种缀合到便于检测的货物部分。在一些实施例中，货物部分是荧光染料。在此类实施例中，可以使用荧光显微术直接检测货物部分，其中将细胞、组织或整个受试者置于荧光显微镜的视野中并直接可视化。

在一些实施例中，货物部分是放射性同位素。在此类实施例中，可以使用X射线、荧光透视、血管造影术、正电子发射断层扫描(PET)或单正电子发射计算机断层扫描(SPECT)来检测货物部分，其中将细胞、组织或整个受试者置于成像模式的视野中并将其可视化。

在一些实施例中，使用第二分子或试剂检测切割产物，该第二分子或试剂例如特异性结合切割产物或与其相互作用的抗体，例如特异性结合切割产物中氨基酸序列的抗体。在此类实施例中，将含有切割产物的细胞或组织与第二分子或试剂接触，随后成像或检测第二分子或试剂。

在一些实施例中，切割产物的存在的检测和评估以生物体水平进行。在一些实施例中，检测和评估在靶区域内进行。在一些实施例中，检测发生在施用后(例如，注射后，如静脉内施用后)的延长时间点，如注射后0.5至24小时。在一些实施例中，检测发生在施用后，例如注射后的多个时间点。

筛选方法

本公开的前分子可用于筛选方法，例如，在体外或体内筛选具有期望活性的候选试剂。在一些实施例中，本公开涉及体外筛选细胞的方法，例如以评估细胞表达的颗粒酶的活性，或筛选调节细胞中的颗粒酶活性的候选试剂。在其它实施例中，本公开涉及体内筛选方法，其可以用于例如在疾病的转基因动物模型中筛选候选试剂的期望颗粒酶活性。

在一些实施例中，本公开的筛选方法涉及在体外将细胞与具有被设计成被颗粒酶切割的X

本公开的方法还涉及可以用于标识具有期望活性的候选试剂或测试化合物(例如，调节颗粒酶活性或颗粒酶分泌免疫细胞的活化的候选试剂)的筛选方法。在一些实施例中，筛选方法涉及体外培养细胞并将细胞与候选试剂或测试化合物接触。然后，将培养细胞与包含被感兴趣的颗粒酶切割的可切割接头的本公开的前分子接触。在培养细胞中引发期望颗粒酶活性的候选试剂或测试化合物促进产生导致X

本公开的方法还涉及体内筛选细胞的方法，例如以标识具有期望活性的候选试剂或测试化合物，例如调节颗粒酶活性或颗粒酶分泌免疫细胞的活化的候选试剂。例如，上面讨论的筛选方法可以在动物模型(例如，疾病的转基因动物模型)中体内进行，以标识表达(或无法表达)感兴趣的特定颗粒酶的感兴趣的细胞或组织，或标识响应于候选试剂或测试化合物调节颗粒酶表达或活性的细胞或组织。

试剂盒

本公开还提供了用于使用本文公开的前分子和实践如上所述的方法的试剂盒。可以提供试剂盒来向待诊断疾病或病状的受试者施用前分子。该试剂盒可以包含如本文公开的前分子和/或货物部分中的一种或多种，它们可以在无菌容器中提供，并且可以与合适的药学上可接受的赋形剂一起以调配物的形式提供，用于向受试者施用。前分子可以以调配物的形式提供，该调配物可直接使用，或者可以被重构以具有期望浓度。在提供前分子以由使用者重构的的情况下，试剂盒也可以提供缓冲液、药学上可接受的赋形剂等，这些与主题前分子分开包装。

除了上述组分，试剂盒可以进一步包含使用试剂盒的组分实践本公开方法的说明。用于实施本主题的方法的说明书通常被记录在合适的记录介质上。例如，说明可以印刷在基材上，例如纸或塑料等。因此，说明可以作为包装说明书存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组件(即，与包装或分包装相关)的容器的标签中。在其它实施例中，说明作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，所述计算机可读存储介质为例如便携式闪存驱动器、DVD、CD-ROM、软盘等。在又其它实施例中，实际说明不存在于试剂盒中，而是提供了例如通过互联网从远程源获得说明的方法。该实施例的示例是包含网址的试剂盒，在该网址中可以查看说明书和/或可以从该网址下载说明书。与说明一样，用于获得说明的方法记录在合适的基板上。

以下实例是为了说明而不是为了限制而提供。

实验

实施例1—颗粒酶可切割的限制性相互作用肽(GRIP)的设计和合成

进行使用针对重组人GZMB的质谱(MSP-MS)的多重底物谱分析，以标识安装在靶向GZMB的RIP中的最佳切割序列。MSP-MS文库含有228个十四聚肽；具有最大序列多样性的合理设计的底物的物理化学多样性群体(图1，图B)。基于大多数蛋白酶需要两个最佳定位的氨基酸来进行底物识别和切割的观察，通过掺入所有邻近(XY)和近邻近(X*Y、X**Y)氨基酸配对，在肽文库中生成物理化学多样性。在不同时间点温育天然GZMB后，经由液相色谱串联质谱(LCMS-MS)进行肽测序来标识切割。随后进行考虑肽文库中的切割和未切割位置的统计分析，以构建跨越颗粒酶B P4–P4′位点的优选底物序列的iceLogo表示(图1，图C)。

iceLogo结果表明，具有P2＝P、P1＝D和P2’＝S(即，XXPDXSXX)的保守位点的四个序列是具有相等特异性和有效性的GZMB底物。序列IEPDVSQV(SEQ ID NO:57)的命名有两个原因。首先，使用正交方法，即位置扫描合成组合文库，先前发现P4-P1序列对GZMB是具有特异性，并且相较于其它人颗粒酶，该序列被示出为由GZMB特异性识别。其次，IEPD四肽已经作为靶向GZMB的共价可逆醛放射性示踪剂的一部分在体内进行了研究，并且四肽-醛似乎在标记GZMB方面是有效的并且在体内是稳定的。

使用荧光淬灭的肽底物在体外测定GZMB切割IEPDVSQV(SEQ ID NO:57)的动力学，并且与先前报道的单独IEPD的值(～3300M

与60μM底物、37℃、PBS缓冲液、1mM DTT和pH 7.4条件下的浓度为5nM的凝血酶、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8、颗粒酶K、MMP9和C1S相比，评估底物序列FVQWFSKFLGK(SEQ IDNO:3)对颗粒酶B的特异性。如图1的图F所示，与测试的其它蛋白酶相比，底物序列对颗粒酶B具有高度特异性。

实施例2—

GRIP B的蛋白水解切割的版本被证实能有效地结合膜。合成GRIP B的N端5FAM标记形式，并与细胞和重组人颗粒酶B或媒剂一起温育。流式细胞术表明，完整的GRIP B与细胞膜的相互作用较低，而将GRIP B与细胞和20nM重组GZMB共温育会产生荧光标记的细胞膜(图2，图A)。通过测量色氨酸荧光进一步证实切割的GRIP B肽插入到脂质胶束中。最后，全长或蛋白水解切割的GRIP B被示出为未在体外表现出对人红细胞的毒性(图2，图B)。

为了将GRIP B偶联到用于放射性标记的螯合剂，将该肽与固相载体上的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DOTA-NHS-酯)反应，其连接到N端苯丙氨酸上的氨基。随后将DOTA-GRIP B去保护，从树脂上切割，并且用半制备型HPLC纯化。

接下来，用铜-64对DOTA-GRIP B进行放射性标记，因为其半衰期(t

实施例3—免疫调节疗法在小鼠肿瘤模型中诱导

为了理解示踪剂药代动力学和正常组织生物分布，首先在C57Bl6/J小鼠中静脉注射

接下来，在携带皮下CT26肿瘤(其是一种对免疫调节疗法有反应的小鼠结肠直肠癌细胞系)的小鼠中评价免疫调节疗法对

在注射后2小时进行生物分布研究，以确定媒剂组和治疗组中的组织之间的示踪剂摄取的相对变化。这些数据示出了相较于对照小鼠的来自治疗小鼠的肿瘤中的放射性示踪剂摄取的～50％诱导(图3，图D)。观察到脾内的示踪剂摄取的显著增加，这与我们和其它人记录的系统性免疫检查点抑制剂对T细胞的刺激相一致。数字放射自显影(DAR)表明，与对照肿瘤相比，

实施例4—

64

接下来，在携带MC38(小鼠结肠直肠癌)或EMT6(小鼠乳腺癌)异种移植物的小鼠中比较

最后，为了证实GZMB是造成

实施例5—

与GZMB缺乏的肿瘤相比，富含相对较高水平的GZMB活性的肿瘤可以预期更显著地减瘤。为了证实这一点，评估了

实施例6—

虽然未明确定义，但已有人提出，分泌的GZMB在一些生理过程(例如，炎症)中具有非细胞毒性功能。为了测试

实施例7—通过

使用

此外，使用

外周血单核细胞从正常献血者白细胞减少过滤器(Vitalant血液服务)获得。经由磁珠选择分离CD4+和CD8+T细胞，用抗CD3/CD28珠活化，用经验证的抗CD19 CAR构建体进行慢病毒转导(Wiita lan，UCSF)，并且用IL-2体外扩增。皮下移植Raji细胞一周后，将5e6个CAR表达T细胞IV移植到每只小鼠中。小鼠接受抗CD19 CAR T细胞或空CAR T。2或6天后，小鼠接受

实施例8—通过

接下来，评价

实施例9—通过

还对

为了证实脓肿中的放射性示踪剂摄取是由于颗粒酶B，在种系GZMB敲除小鼠中进行成像研究。小鼠接受活大肠埃希氏杆菌和热灭活大肠埃希氏杆菌，并且按照与野生型小鼠相同的方案进行注射和成像。PET/CT和生物分布数据表明，与野生型相比，GZMB敲除小鼠的感染肌肉中的

接下来，将颗粒酶B对活大肠埃希氏杆菌的反应以及对内毒素LPS团注治疗的反应进行比较。植入后三到四小时，小鼠接受

还测试了颗粒酶B对其它细菌菌株的反应。将活金黄色葡萄球菌或热灭活金黄色葡萄球菌植入到小鼠的三角肌中，以理解PET上的免疫反应。经发现，

对其它细菌菌株进行的另外的肌炎研究在PET上产生了意料之外的和可变的颗粒酶“反应”。例如，铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌表现出与大肠埃希氏杆菌和金黄色葡萄球菌感染定性相似的发现(图14)。三角肌中的活细菌感染中的

两个细菌物种不影响

方法

一般方法

所有试剂均购自商业来源，并且无需进一步纯化即可使用。

通过质谱进行多重底物谱分析

将人GZMB(100nM)与含有228个合成十四肽(500nM)的文库一起温育。以三个时间间隔取出等分试样(10μL)，随后用10μL 8M盐酸胍淬灭。然后，将等分试样快速冷冻，直到所有时间点均已采集。在质谱之前，使用C18吸头(Rainin)对样本进行脱盐。然后，使用与10,000psi nanoACQUITY超高效液相色谱(UPLC)系统(Waters)联接的四极杆轨道阱质谱仪(LTQ Orbitrap XL)通过LC-MS/MS测序分析等分试样，以通过反相液相色谱(RPLC)进行肽分离。在与EASY-Spray

Fmoc-固相肽合成

由序列NH2-K(MCA)IEPDVSQVK(DNP)-COOH(SEQ ID NO:62)合成的淬灭荧光肽在环境温度下通过Fmoc固相合成在Biotage SyroII肽合成仪上合成。使用预先装载的赖氨酸(2-二硝基苯基)王树脂，合成规模为12.5μM，其中DNP淬灭剂连接到赖氨酸的ε氮。在振荡的同时，在500μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，用4.9当量的HCTU(O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、5当量的Fmoc-氨基酸-OH和20当量的N-甲基吗啉(NMM)进行偶联反应8分钟。每个氨基酸位置被双偶联，随后用500μL的40％4-甲基哌啶的DMF溶液进行Fmoc去保护10分钟，然后用500μL DMF在3分钟内洗涤6次。最终的氨基酸偶联含有荧光团赖氨酸(7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA))，其中MCA连接到赖氨酸的ε氮。在振荡的同时，用500μL的由95％三氟乙酸、2.5％水和2.5％三异丙基硅烷构成的溶液从王树脂切割肽，持续1小时。然后，将粗肽产物在30mL冷1:1二乙基醚:己烷中沉淀，然后溶解在DMSO水:乙腈的1:1:1混合物中。使用Agilent Pursuit 5C18柱(5mm珠尺寸，150x21.2mm)在Agilent PrepStar 218系列制备型HPLC上通过高效液相色谱(HPLC)纯化溶解的粗产物。流动相A和B分别是水+0.1％TFA以及乙腈+0.1％TFA。将纯化的肽产物在减压气氛下去除溶剂，并溶解在DMSO原液中，最终浓度为10mM。纯度通过液相色谱-质谱进行确认，并且将原液在-20℃下储存。荧光标记的5FAM-GRIP B购自CPC Scientific，纯度为95-98％。

DOTA-GRIP B的合成

DOTA-GRIP B(DOTA-己酸-FVQWFSKFLGKIEPDVSQVQDPNDQYEPF-COOH；SEQ ID NO:63)首先使用如上所述的标准固相肽合成条件合成。将具有N端己酸的树脂结合肽与2当量dota-NHS、5当量HCTU和20当量N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)三重偶联，持续12小时。然后，如针对荧光肽所述对DOTA-GRIP B探针进行切割、纯化并分析。

体外动力学

在Corning黑色384孔平底板中进行动力学测量，并且在BioTek H4多模式读板仪上读取。GZMB对淬灭的荧光肽(NH2-K(MCA)IEPDVSQVK(DNP)-COOH；SEQ ID NO:62)的蛋白水解在PBS中以40nM的最终酶浓度进行。在37℃下进行动力学分析，并且监测活性，持续1小时。在1分钟和30分钟时以RFU/s计算Vo。然后，使用切割底物的标准曲线将初始速度转换为M/s。

测量脂质插入的固有色氨酸荧光光谱

在BioTek H4多模式读板仪上，在存在或不存在脂质胶束的情况下，监测全长和活化的GRIP B内的色氨酸的荧光。将十二烷基硫酸钠(SDS)溶解为5mg mL

测量人红细胞的溶血的毒性测定

从Trima白细胞减少室(Vitalant，加利福尼亚州圣弗朗西斯科)获取来自健康匿名献血者的血液。从匿名血液样本分离红细胞。针对健康人红细胞的溶血活性，对全长GRIPB和活化GRIP B进行三次测量。将人红细胞的等分试样悬浮在PBS(pH7.4)中，并且与最初溶解在DMSO中的两种肽的系列稀释液一起温育。将DMSO和1％Triton X-100平行温育，分别作为阴性和阳性对照。温育在37℃下进行，持续1小时。温育后，将样本以2,000x g离心5分钟，随后收集上清液。使用BioTek H4多模式读板仪测量上清液中的红细胞的血红蛋白释放，在540nm波长处监测上清液的光密度。

使用5FAM-GRIP B的流式细胞术

将MC38细胞(2x10

64

向1.5mL反应小瓶中加入5mCi的

动物研究

所有动物实验都得到UCSF的机构动物照顾和使用委员会的批准。四至六周龄雄性或雌性balb/c小鼠和C57BL6/J小鼠购自杰克逊实验室，并以自由饮水和进食方式圈养。所有小鼠均在左肩皮下接种含5×10

小动物PET/CT

经由尾静脉注射含

针对列表模式PET数据绘制直方图以生成正弦图，该正弦图使用扫描仪制造商提供的2D有序子集期望最大化算法重建。使用PET数据采集后立即采集的共配准CT数据进行衰减校正。使用以下设置采集CT：220度角度覆盖，120步长，x射线管以80kVp和0.5mA操作，每个角度步长曝光时间设置为175ms。使用预先校准的量化因子将所有重建的3D PET体积图像体素校准到Bq/ml。使用AMIDE软件来进行PET/CT数据重建和图像分析。

生物分布研究

在放射性示踪剂注射后的特定时间点，用CO2(g)窒息对小鼠实施安乐死，并通过直接心脏穿刺收集血液。收获组织，称重，并在γ计数器(Hidex)上计数。通过与已知活性的标准进行比较来确定组织中的放射量。对样本进行衰变校正，并将其表达为注射剂量/收获组织重量的百分比(％ID/g)。

数字放射自显影

将肿瘤或指定组织在OCT中在干冰中快速冷冻。用切片机(Leica)将组织切成10-20um厚的切片，并直接安装在载玻片(VWR)上。将GE储存磷光屏用这种带有放射性组织的载玻片曝光。在铜-64的10个半衰期后，将屏在磷光成像仪(Typhoon 9400)上显影。通过使用Fiji软件进一步分析图像。

组织学

H&E染色和IF染色由UCSF和Acepix Biosciences(加利福尼亚州海沃德)的病理学核心实验室进行。对于免疫荧光研究，将肿瘤样本在-20℃的丙酮中浸泡20分钟，然后在4℃的MeOH中浸泡10分钟。用10mM pH＝6的柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，并用通用封闭缓冲液加5％山羊和驴血清封闭样本。将一抗：抗GZMB(ab4059，Abcam)(1:50)、抗CD3(MCA1477，Bio-Rad)(1:100)加入到样本中，并在4℃下温育过夜。通过AF488抗兔(A21206，Invitrogen)(1:200)；AF546 AF546抗小鼠(A111081，Invitrogen)(1:200)和AF633抗小鼠(A21052，Invitrogen)(1:200)检测这种一抗，通过与样本一起温育检测二抗。使用DAPI核酸染色剂(D1306，Life Technologies Corporation)通过与样本一起温育(室温下10分钟)对细胞核进行染色。免疫荧光结果由格莱斯顿研究所的组织学及光学显微镜术核心实验室完成。在配备有Andor Zyla 5.5sCMOS相机(Andor Technologies，英国贝尔法斯特)的VERSA自动载玻片扫描仪(Leica Biosystems，德国韦茨拉尔)上获得整个切片的图像。使用ImageScope软件(Aperio Technologies，加利福尼亚州维斯塔)创建单独的图像。

统计

使用PRISM v8.0或ORIGIN软件进行所有统计分析。通过非配对双尾学生T检验来确定统计学显著性差异。只有在95％置信水平(P<0.05)下的变化才被认为具有统计学显著性。

因此，上文仅说明了本公开的原理。将领会到，本领域的技术人员将能够设想各种布置方式，尽管本文中没有明确地描述或示出这些布置方式，但是它们体现了本发明的原理且被包含在本发明的精神和范围内。此外，本文中所列的所有示例和有条件的语言主要意图辅助阅读者理解本发明的原理和由发明人贡献于促进本领域的概念，且不应当被视为对这类具体所列的示例和条件的限制。此外，本文中列出本发明的原理、方面和实施方式的所有陈述及其具体示例意图涵盖其结构性等效物和功能性等效物。另外，意图使这类等效物包含当前已知的等效物和在未来开发的等效物，即，开发的执行相同功能的任何元件，不管结构如何。因此，本发明的范围不意图受限于本文中所示出和描述的示例性实施方式。

序列表

<110>加利福尼亚大学董事会

查尔斯·S·克雷克

康纳·巴丁

迈克尔·埃文斯

<120> 颗粒酶可活化的膜相互作用肽和使用方法

<130>UCSF-644WO

<150>US 63/216,890

<151>2021-06-30

<160>89

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>1

Phe Val Gln Trp Phe Ser Lys Phe Leu Gly Arg Ile Leu

1 5 10

<210>2

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>2

Phe Val Gln Trp Phe Ser Lys Phe Leu Gly Lys Leu Leu

1 5 10

<210>3

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>3

Phe Val Gln Trp Phe Ser Lys Phe Leu Gly Lys

1 5 10

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>4

Phe Phe Gln Trp Phe Ser Lys Phe Leu Gly Lys

1 5 10

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>5

Ile Leu Gly Thr Ile Leu Gly Leu Leu Lys Gly Leu

1 5 10

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(5)..(5)

<223>位置5处的氨基酸为Arg或Gln

<400>6

Ser Phe Leu Leu Xaa Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp

1 5 1015

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>7

Gln Asp Pro Asn Asp Gln Tyr Glu Pro Phe

1 5 10

<210>8

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(4)..(4)

<223>位置4处的氨基酸为Ile或Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>(10)..(10)

<223>位置10处的氨基酸为Ser或Gly

<400>8

Phe Leu Pro Xaa Ile Ala Ser Leu Leu Xaa Lys Leu Leu

1 5 10

<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>9

Phe Leu Pro Leu Ile Gly Arg Val Leu Ser Gly Ile Leu

1 5 10

<210>10

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>10

Leu Leu Pro Ile Val Gly Asn Leu Leu Lys Ser Leu Leu

1 5 10

<210>11

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>11

Leu Leu Pro Ile Leu Gly Asn Leu Leu Asn Gly Leu Leu

1 5 10

<210>12

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>12

Leu Leu Pro Ile Val Gly Asn Leu Leu Asn Ser Leu Leu

1 5 10

<210>13

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>13

Val Leu Pro Ile Ile Gly Asn Leu Leu Asn Ser Leu Leu

1 5 10

<210>14

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>14

Phe Leu Pro Leu Ile Gly Lys Val Leu Ser Gly Ile Leu

1 5 10

<210>15

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>15

Phe Phe Pro Val Ile Gly Arg Ile Leu Asn Gly Ile Leu

1 5 10

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>16

Leu Ser Pro Asn Leu Leu Lys Ser Leu Leu

1 5 10

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>17

Leu Leu Pro Asn Leu Leu Lys Ser Leu Leu

1 5 10

<210>18

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>18

Phe Leu Pro Phe Leu Ala Lys Ile Leu Thr Gly Val Leu

1 5 10

<210>19

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>19

Phe Leu Pro Leu Phe Ala Ser Leu Ile Gly Lys Leu Leu

1 5 10

<210>20

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>20

Phe Leu Pro Phe Leu Ala Ser Leu Leu Thr Lys Val Leu

1 5 10

<210>21

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>21

Phe Leu Pro Phe Leu Ala Ser Leu Leu Ser Lys Val Leu

1 5 10

<210>22

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>22

Phe Leu Pro Phe Leu Ala Thr Leu Leu Ser Lys Val Leu

1 5 10

<210>23

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>23

Ser Ile Leu Pro Thr Ile Val Ser Phe Leu Ser Lys Val Phe

1 5 10

<210>24

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>24

Ser Ile Leu Pro Thr Ile Val Ser Phe Leu Ser Lys Phe Leu

1 5 10

<210>25

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>25

Ser Ile Leu Pro Thr Ile Val Ser Phe Leu Thr Lys Phe Leu

1 5 10

<210>26

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>26

Phe Ile Leu Pro Leu Ile Ala Ser Phe Leu Ser Lys Phe Leu

1 5 10

<210>27

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>27

Val Leu Pro Leu Ile Ser Met Ala Leu Gly Lys Leu Leu

1 5 10

<210>28

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>28

Asn Phe Leu Gly Thr Leu Ile Asn Leu Ala Lys Lys Ile Met

1 5 10

<210>29

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>29

Phe Leu Pro Ile Leu Ile Asn Leu Ile His Lys Gly Leu Leu

1 5 10

<210>30

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>30

Phe Leu Pro Ile Val Gly Lys Leu Leu Ser Gly Leu Leu

1 5 10

<210>31

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>31

Phe Leu Pro Ile Ala Ser Leu Leu Gly Lys Tyr Leu

1 5 10

<210>32

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>32

Phe Ile Ser Ala Ile Ala Ser Met Leu Gly Lys Phe Leu

1 5 10

<210>33

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>33

Phe Leu Ser Ala Ile Ala Ser Met Leu Gly Lys Phe Leu

1 5 10

<210>34

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>34

Phe Ile Ser Ala Ile Ala Ser Phe Leu Gly Lys Phe Leu

1 5 10

<210>35

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>35

Phe Leu Phe Pro Leu Ile Thr Ser Phe Leu Ser Lys Val Leu

1 5 10

<210>36

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>36

Phe Leu Pro Ala Ile Ala Gly Ile Leu Ser Gln Leu Phe

1 5 10

<210>37

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>37

Phe Leu Pro Leu Ile Ala Gly Leu Leu Gly Lys Leu Phe

1 5 10

<210>38

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>38

Phe Phe Pro Ile Gly Val Phe Cys Lys Ile Phe Lys Thr Cys

1 5 10

<210>39

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>39

Phe Phe Pro Leu Ala Leu Leu Cys Lys Val Phe Lys Lys Cys

1 5 10

<210>40

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>40

Phe Leu Leu Phe Pro Leu Met Cys Lys Ile Gln Gly Lys Cys

1 5 10

<210>41

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>41

Phe Val Leu Pro Leu Val Met Cys Lys Ile Leu Arg Lys Cys

1 5 10

<210>42

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>42

Phe Gly Leu Pro Met Leu Ser Ile Leu Pro Lys Ala Leu Cys Ile Leu

1 5 1015

Leu Lys Arg Lys Cys

20

<210>43

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>43

Arg Arg Trp Trp Arg Phe

1 5

<210>44

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>44

Phe Arg Trp Trp His Arg

1 5

<210>45

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>45

Pro Phe Lys Leu Ser Leu His Leu

1 5

<210>46

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>46

Thr Pro Phe Lys Leu Ser Leu His Leu

1 5

<210>47

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>47

Phe Phe Phe Leu Ser Arg Ile Phe

1 5

<210>48

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>48

Phe Phe Trp Leu Ser Lys Ile Phe

1 5

<210>49

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>49

Lys Val Phe Leu Gly Leu Lys

1 5

<210>50

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>50

Gly Ile His Asp Ile Leu Lys Tyr Gly Lys Pro Ser

1 5 10

<210>51

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>51

Ile Leu Gly Lys Ile Trp Glu Gly Ile Lys Ser Leu Phe

1 5 10

<210>52

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>52

Leu Lys Leu Lys Ser Ile Val Ser Trp Ala Lys Lys Val Leu

1 5 10

<210>53

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>53

Lys Lys Lys Lys Pro Leu Phe Gly Leu Phe Phe Gly Leu Phe

1 5 10

<210>54

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>54

Ile Asn Trp Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Ile Asp Ala Leu

1 5 10

<210>55

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>55

Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp

1 5 1015

<210>56

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>56

Ser Phe Leu Leu Gln Asp Pro Asn Asp Gln Tyr Glu Pro Phe Trp

1 5 1015

<210>57

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>57

Ile Glu Pro Asp Val Ser Gln Val

1 5

<210>58

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>58

Trp Ala Phe Arg Ser Arg Tyr His

1 5

<210>59

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>59

Ala Ser Pro Arg Ala Gly Gly Lys

1 5

<210>60

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>60

Lys Glu Pro Leu Ser Ala Glu Ala

1 5

<210>61

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>SITE

<222>(4)..(4)

<223>位置4处的氨基酸为D-天冬氨酸

<400>61

Ile Glu Pro Asp Val Ser Gln Val

1 5

<210>62

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>SITE

<222>(1)..(2)

<223>位置1和2处的氨基酸包含7-甲氧基香豆素-4-乙酸（MCA）

<220>

<221>SITE

<222>(10)..(10)

<223>位置10处的氨基酸包含DNP淬灭剂

<400>62

Lys Ile Glu Pro Asp Val Ser Gln Val Lys

1 5 10

<210>63

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>SITE

<222>(1)..(1)

<223>位置1处的氨基酸包含dota-己酸

<400>63

Phe Val Gln Trp Phe Ser Lys Phe Leu Gly Lys Ile Glu Pro Asp Val

1 5 1015

Ser Gln Val Gln Asp Pro Asn Asp Gln Tyr Glu Pro Phe

2025

<210>64

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>64

Ile Glu Pro Asp Val Ser Val Gln

1 5

<210>65

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>65

Leu Thr Tyr Asp Phe Trp Ile Gln

1 5

<210>66

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>66

Pro Gln Val Asp Leu Tyr Asp Lys

1 5

<210>67

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>67

Val Val Gln Asp Lys His Glu Ile

1 5

<210>68

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>68

Val Tyr Ala Asp Ser Ser Glu Trp

1 5

<210>69

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>69

Thr Met Ala Asp Ser Gln Glu Ser

1 5

<210>70

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(7)..(8)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>70

Gly His Ile Asp His Met Xaa Xaa

1 5

<210>71

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>71

Leu Glu Gln Asp Val Trp Ile Ala

1 5

<210>72

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>72

Leu Asp Pro Asp Asn Phe Lys Arg

1 5

<210>73

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)..(2)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>73

Xaa Xaa Pro Asp Phe Tyr Leu Gly

1 5

<210>74

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>74

Met Gly Pro Asp Ala Phe Asn Leu

1 5

<210>75

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(7)..(8)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>75

Leu Lys Asp Asp Met Gly Xaa Xaa

1 5

<210>76

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>76

Ile Trp Phe Asp Tyr Thr Leu Lys

1 5

<210>77

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>77

Xaa Ile Gly Asp Asn Val Glu Trp

1 5

<210>78

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)..(3)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>78

Xaa Xaa Xaa Asp Gln Val Asn Leu

1 5

<210>79

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(7)..(8)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>79

Pro Gln Ala Asp Gln Trp Xaa Xaa

1 5

<210>80

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(6)..(8)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>80

Pro Ser Val Asp Met Xaa Xaa Xaa

1 5

<210>81

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>81

Xaa Asn Val Asp Trp Thr Ala Pro

1 5

<210>82

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>82

Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Thr Ala

1 5

<210>83

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>83

His Gly Phe Asp Glu Ala His Asn

1 5

<210>84

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>84

His Ser His Asp Ser Trp Lys Ala

1 5

<210>85

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>85

Lys Gln Asp Asp Leu Met Ser Glu

1 5

<210>86

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>86

Ser Phe Gly Asp Ile Met Glu Met

1 5

<210>87

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(7)..(8)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>87

Val Asn Asp Asp Val Lys Xaa Xaa

1 5

<210>88

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(1)..(3)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>88

Xaa Xaa Xaa Asp Lys Gln Phe Thr

1 5

<210>89

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>VARIANT

<222>(7)..(8)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>89

Asn Asp Val Asp Gly Gly Xaa Xaa

1 5