一种从口腔采集茶汤酚类物质的纸喷雾质谱检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种从口腔采集茶汤酚类物质的纸喷雾质谱检测方法。

背景技术

口腔代谢研究是口腔医学、微生物和生物化学领域中的重要课题，口腔代谢涉及到化合物、口腔微生物群落和宿主细胞间的多种相互作用，当前依旧面临很多挑战。首先，常规的检测方法无法准确测定哪些成分进入口腔，也很难监测其在口腔中的实际代谢过程；其次，化合物进入口腔后会在口腔中停留一段时间，然后被吞咽、代谢或排出，研究这个动态过程则需要在不同的时间点从口腔采用并进行分析，其难度较大；然后口腔中的不同位置(如牙龈、舌头、两颊等)有不同的微生物群落，可能对实际口腔代谢产生影响。

口腔采样作为口腔代谢研究的关键难点，要确保采样是无菌的并且在在采样过程中口腔不被外部环境污染，同时还要避免采样操作对口腔组织造成伤害。采样后的样本在存储和处理过程中，其口腔微生物的活性和代谢可能会影响样品质量，需要采取适当的措施来保证样本的稳定性。口腔内有大量的生物分子，如血液、唾液、细菌代谢产物等，这些分子在疾病诊断、治疗监测以及生理状态评估中扮演着重要角色，口腔中唾液或细胞的数量是有限的，这也会影响后续的实验检测和分析。传统的口腔采样方法通常是借助棉签、吸管、刷子等工具进行，具有操作复杂、采集效率低、成本高和耗时长等问题，且唾液采集前需要对口腔进行刺激，采集过程容易受到个体差异的影响，从而导致采集样品的可重复性较差。血液采集比较繁琐且侵入性强，不适合大规模应用和频繁使用，而常规的检测方法往往需要耗时的样品处理和分析步骤，无法在实际环境中进行广泛应用。因此，开发一种快速、准确、非侵入性的口腔采样和分析方法显得尤为关键。

纸喷雾质谱法是一种新型的大气压下的电离检测方法，其原理是将三角形色谱纸基质作为样品分离和电离的载体，将待测样品涂抹到纸片上，在分析时将喷雾溶剂滴加到纸基质上，在外加电压的条件下，目标分析物被离子化，随着洗脱喷雾溶剂进入质谱仪进行检测，通过对检测结果进一步分析可以确定化合物的分子量、结构和纯度等。纸喷雾质谱法近年来已广泛应用于样品的检测和分析，其操作简单、成本低、效率高且无需对产品进行复杂的预处理过程，在现场即时诊断中上具有较大的市场潜力。

申请号为202010398556.6的中国发明专利公开了一种有机污染物的吸附材料、纸喷雾质谱检测装置及检测方法。该发明将纸喷雾质谱法与共价有机骨架相结合，实现环境样品中痕量四溴双酚A的有效监测，提供一种检测有机污染物的新型纸基喷雾质谱检测方法。但是该发明提供的技术方案由于吸附材料、质谱运行条件等差异，并不适用于从口腔采集茶汤酚类物质并进行检测。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种从口腔采集茶汤酚类物质的纸喷雾质谱检测方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

提供一种从口腔采集茶汤酚类物质的纸喷雾质谱检测方法，其包括以下步骤：

(1)将色谱纸放置在口腔内，使其与口腔表面充分接触，将色谱纸从口腔中取出后进行真空干燥；

(2)将干燥后的色谱纸、金属夹和电压箱组装成纸喷雾装置，连接纸喷雾装置、离子源和质谱检测装置，调整纸喷雾装置的位置，使色谱纸三角尖端正对质谱进样口；

(3)在洗脱喷雾溶剂中加入参比混合液和内标溶液；

(4)在色谱纸底部滴加洗脱喷雾溶剂使色谱纸湿润，并在色谱纸底部直接施加脉冲高压，使待测茶汤酚类物质被离子化并随喷雾溶剂进入质谱进行检测。

进一步地，步骤(2)中，将色谱纸裁为等腰三角形，色谱纸的尖端对准质谱仪的进样口，色谱纸的尖端与质谱仪进样口的距离为5mm～10mm。

进一步地，步骤(2)中，电压箱的输出电压：0.5～6kV，50Hz。

进一步地，步骤(3)中，选取甲醇作为洗脱喷雾溶剂，甲醇中参比混合溶液和内标溶液的浓度分别为2.5×10

进一步地，步骤(4)中，质谱检测条件为：毛细管温度，325℃；干燥气体流速，3L/min；雾化气体压力，1psi；内部毛细管电压，0V；外部电压，-4000V；扫描范围，m/z 50-1000。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种从口腔精准采样的纸喷雾质谱检测方法，通过纸基质实现从口腔精准实时采样，纸三角样品灵活地安装于纸喷雾装置上，便于更换样品和调节纸三角样品相对于进样口的位置，从而提高了质谱检测的效率和准确性。该方法采样快速，只需几秒到几十秒；无需复杂的样本预处理步骤；减少了交叉污染的风险；适合于实时、在线、现场检测；成本低廉，便于大规模应用。

附图说明

图1为本发明方法的流程图；

图2为实施例1中纸喷雾质谱法负离子模式检测口腔唾液的总离子流图；

图3为实施例2中纸喷雾质谱法负离子模式检测喝茶后口腔唾液的总离子流图(a)和对应的全扫描质谱图(b)；

图4为对比例1中液质联用法负离子模式检测喝茶后口腔唾液的色谱图；

图5为对比例1中液质联用法正离子模式检测喝茶后口腔唾液的色谱图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1采用纸喷雾质谱法检测口腔唾液

参照图1，一种从口腔采集茶汤酚类物质的纸喷雾质谱检测方法，具体包括以下步骤：

(1)将色谱纸剪裁成1cm×1cm的正方形，用镊子夹取正方形色谱纸放置在口腔内，使其与口腔表面充分接触，将色谱纸从口腔中取出后进行真空干燥5min；

(2)将干燥后的色谱纸剪裁成6mm底宽×6mm高的三角形，将三角形色谱纸、金属夹和电压箱组装成纸喷雾装置，连接纸喷雾装置、离子源和质谱检测装置，调整装置位置，使纸三角尖端正对质谱进样口；

(3)选取甲醇作为洗脱喷雾溶剂，将参比混合溶液以2.5×10

(4)一次性滴加20μL洗脱喷雾溶剂到纸三角底部，确保纸三角湿润，启动纸喷雾装置，确保离子源能够产生足够的离子并进入质谱检测；

(5)选择负离子模式，进一步对纸三角上的唾液进行检测和分析，质谱运行条件为：毛细管温度，325℃；干燥气体流速，3L/min；雾化气体压力，1psi；内部毛细管电压，0V；外部电压，-4000V；扫描范围，m/z 50-1000。

所得总离子流图如图2所示，纸喷雾离子源信号稳定，喷雾持续时间长。检测时间可以自由决定，可选取较长时间离子谱图进行平均，以取得更准确的结果，从而保证测定化合物的质荷比不会有较大偏移。

本发明实施例中使用的色谱纸为专用的微孔色谱纸，具有纯度高、均匀性好、吸附能力强和耐性高等特点，可以有效吸附唾液样品中的茶汤酚类物质、提供稳定的分离效果并确保分析结果的准确性和可靠性，还可以在不同的溶剂和条件下使用，不易变形或破裂。

实施例2采用纸喷雾质谱法检测喝茶后口腔唾液中的茶汤酚类物质

同实施例1，用镊子夹取正方形色谱纸采集喝茶后口腔中的唾液，然后取出色谱纸，真空干燥5min后进行检测，选取甲醇作为洗脱喷雾溶剂，没食子酸乙酯作为内标加入到甲醇中，最终配制的甲醇洗脱喷雾溶剂中，参比混合溶液和内标没食子酸乙酯的浓度分别为2.5×10

重复制备三个平行样品进行检测，纸喷雾质谱负离子模式检测喝茶后口腔唾液的总离子流图和对应的全扫描质谱图，如图3所示，本实施例采集的质谱信号的时间为10s，检测速度较快。检测结果如表1所示，列出了用上述方法检测出的喝茶后口腔唾液中19种主要茶汤酚类物质及内标没食子酸乙酯的理论质荷比、三个平行检测的实际质荷比的平均值和标准偏差。样本检测数据中内标的实际质荷比可精确至小数点前四位，三个平行样本检测数据中茶汤酚类物质的实际质荷比的标准偏差较小，实际质荷比可精确至小数点前两位，表明该检测方法的准确度较高。

表1唾液中残留的19种主要茶汤酚类物质及内标的理论m/z和实际m/z

该实施例中色谱纸(12mm×18mm，1ET，UK)从Whatman公司购买并直接使用，该色谱纸能够减少唾液基质对样品中小分子酚类物质离子信号的抑制作用，使茶汤酚类物质检出限降低，质谱信号强度增加，便于在实际检测中对化合物进行定性及定量分析。

实施例3采用纸喷雾质谱法检测喝茶后不同时间口腔唾液中的茶汤酚类物质

同实施例1，用镊子夹取正方形色谱纸后采集喝茶后0.5min、2min和4min口腔中的唾液，取出色谱纸，真空干燥5min后进行检测，喷雾溶剂和质谱检测条件同实施例2。0.5min、2min和4min唾液样品中内标检测的峰高分别为12396.89，12180.81和12111.05，三个样品中内标检测的峰高相对稳定，表明该检测方法信号稳定，对检测数据进行处理与分析进一步确定和喝茶后不同时间口腔唾液中茶汤酚类物质的种类和相对含量，结果如表2所示。

表2喝茶后不同时间唾液中残留的19种茶汤酚类物质的相对含量

表2中列出了用上述方法检测出的喝茶后0.5min、2min和4min时口腔唾液中残留的19种主要茶汤酚类物质的相对含量，结果表明喝茶后0.5min和2min口腔中大部分茶汤酚类物质均可检测到，酚酸类(没食子酸、莽草酸、咖啡酸、奎宁酸等)和黄酮醇苷类物质(槲皮素-芸香糖苷、槲皮素-葡萄糖苷、山奈酚-葡萄糖苷等)在口腔的代谢时间较长，在4min仍可检测到。

该例中每次实验所用唾液样品体积仅为5μL左右，使得采样操作不会影响茶汤酚类物质在口腔的整体代谢过程，实现了样品的微量检测，且在不同的时间点进行采样和分析，为研究茶汤酚类物质在口腔中的动态代谢过程提供了可能。

实施例4采用纸喷雾质谱法检测喝茶后不同部位口腔唾液中的茶汤酚类物质

同实施例3，用镊子夹取正方形色谱纸后采集喝茶0.5min后两颊、喉咙、舌根和舌面等4个口腔部位的唾液，然后取出色谱纸，真空干燥5min后进行检测，喷雾溶剂和质谱检测条件同实施例2。对检测数据进行处理与分析进一步确定喝茶后口腔不同部位唾液中茶汤酚类物质的种类和相对含量，结果如表3所示。

表3喝茶后不同部位唾液中残留的19种茶汤酚类物质的相对含量

表3列出了用上述方法检测出的喝茶后不同部位口腔唾液中残留的19种主要茶汤酚类物质的相对含量，结果表明喝茶后茶汤酚类物质主要残留在舌根和舌面，在两颊和喉咙的残留量较低。

对比例1通过吸管采集喝茶后不同时间口腔中的唾液

通过吸管采集唾液是一种简单、快速和非侵入性的传统方法，采样方便，但口腔唾液必须分泌到一定的体积才能通过吸管吸出，口腔各部位分泌的唾液体积较少，传统的吸管采集方法无法准确采集口腔各部位的唾液，只能采集喝茶后不同时间的唾液，且采集唾液的相邻时间点需间隔稍微大一点，确保口腔能分泌足够的唾液量。用吸管采集喝茶后口腔唾液的最短时间是0.5min，本案例用吸管分别采集了喝茶后0-10min内不同时间点的口腔唾液，如表4所示。

表4通过吸管采集的喝茶后不同时间口腔唾液的体积

表4中列出了用上述方法采集的喝茶后不同时间点口腔唾液的体积。表中不同时间采集的唾液体积相差较大，主要是在采集过程中人员的主观影响较大，且喝茶后茶汤酚类物质对口腔的刺激也会影响口腔唾液的分泌，从而导致相同间隔时间内唾液分泌的体积可能不一样。通过吸管采集唾液的方法不稳定，可能会进一步影响检测结果。

对比例2采用纸喷雾质谱法检测吸管采集的喝茶后不同时间唾液中的茶汤酚类物质

采样方法同对比例1，用吸管采集喝茶后0.5min、2min、4min的唾液，然后用将各时间点采集的唾液分别滴加到正方形色谱纸上，使色谱纸充分湿润，然后真空干燥5min后进行检测，喷雾溶剂和质谱检测条件同实施例2。对检测数据进行处理与分析进一步确定喝茶后口腔不同部位唾液中茶汤酚类物质的种类和相对含量，结果如表5所示。

表5采用纸喷雾质谱法检测吸管采集的喝茶后不同时间口腔唾液中残留的19种茶汤酚类物质的相对含量

表5列出了用上述方法检测的吸管采集的喝茶后0.5min、2min和4min口腔唾液中残留的19种主要茶汤酚类物质及对应内标的相对含量，结果表明4min时大部分茶汤酚类物质在口腔唾液中仍可检测到，与实施案例3的检测结果不符，主要是由于该方法需要采集的唾液量较多，而唾液的分泌需要时间，该检测结果无法代表真实时间点口腔唾液中残留的茶汤酚类物质含量，且该方法只可用于检测喝茶后不同时间的唾液，无法检测口腔不同部位的唾液，具有一定的局限性。

对比例3采用液质联用法检测吸管采集的喝茶后不同时间唾液中的茶汤酚类物质

采样方法同对比例1，用吸管采集喝茶后0.5min、2min、4min的唾液，然后将采集的唾液过膜(0.45μm)，每990μL唾液中加10μL没食子酸乙酯溶液(1000ppm)作为内标。采用液质联用法对唾液样品中的茶汤酚类物质进行检测，正离子模式和负离子模式检测喝茶后0.5min口腔唾液的色谱图如图4、图5所示，在正离子模式下样品的分离效果较差，该方法检测一个样品的时间是40min，而纸喷雾方法检测一个样品仅需10s，液质联用法检测样品需要的时间较长，在检测过程中样品可能发生变化。对检测数据进行处理与分析确定喝茶后口腔不同部位唾液中茶汤酚类物质的种类和相对含量，结果如表6所示。

表6采用液质联用法检测吸管采集的喝茶后不同时间口腔唾液中残留的13种茶汤酚类物质的相对含量

表6中列出了用上述方法检测的喝茶0.5min、2min和4min后口腔唾液中残留的13种主要茶汤酚类物质的相对含量，在喝茶后0.5min、2min和4min的口腔唾液中仅检测到13种、7种和4种茶汤酚类物质，唾液中检测到的茶汤酚类物质的种类数相对于实施案例3中明显较少，该检测方法对样品中茶汤酚类物质的检出限含量要求较高且检测时间较长，可能导致样品中的茶汤酚类物质在检测过程中发生氧化变质。

通过对比上述实施例和对比例，该发明提供了一种从口腔精准采集茶汤酚类物质的纸喷雾质谱检测方法，在实际应用中明显具有优势，能够快速、准确地检测口腔内残留的茶汤酚类物质，可进一步广泛应用于口腔医学和食品安全等领域。

于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。