胶原IV生物墨水

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本申请要求2021年3月18日提交的第2021900794号澳大利亚临时专利申请的优先权，该申请的全部内容通过交叉引用并入本文。

技术领域

本发明大体上涉及生物学和医学领域。更具体地说，本发明涉及适用于向组织和细胞等生物靶标递送药剂和/或能够促进细胞生长和/或增殖的组合物及其产生方法。

背景技术

在生物组织受到创伤的情况下或在疾病导致组织退化的情况下，传统方法尝试用来自合适供体的移植物来重建所述组织。最近，生物工程为生物组织的置换提供了可选方式。生物工程允许在移植前产生合成替代组织。此外或可选地，细胞基疗法包括注射具有适当生长因子的培养细胞，从而允许原位组织再生。后一种方法的优点是技术简单，尤其适用于在修复的生物组织(例如角膜组织)的形状至关重要时恢复功能。

角膜是眼睛保护层的透明部分。它允许光通过瞳孔，是眼睛光学系统的主要屈光元件。角膜由五层组成：外部上皮层(outer epithelium)、鲍曼层(Bowman’s layer)、基质层、德塞梅膜(Descemet's membrane)和内部内皮层。角膜基质层约占角膜总厚度的90％，主要由胶原构成。

角膜盲是全球第二大失明原因。角膜盲的原因包括沙眼、盘尾丝虫病、麻风病、新生儿眼炎和干眼病等疾病，以及眼外伤、角膜溃疡和使用传统眼药引起的并发症等其他过程。

角膜损伤在澳大利亚是最常见的眼科急诊病症，全部病例的约75％都是由于角膜上出现异物或擦伤所致。据估计，仅这些损伤每年就会给澳大利亚人口造成超过1.55亿美元的损失，而且如果得不到有效治疗，还可能导致感染和疤痕，造成视力永久受损。

在轻微的情况下，受损角膜能够通过正常的愈合途径再生。但在其他情况下，角膜的正常愈合机制不足，导致形成不愈合的缺陷，该缺陷导致角膜融化、角膜新生血管形成、透明度丧失、感染、疤痕和视力下降，直至失明。

角膜内皮病是影响角膜的疾病状况的一个实例，用于组织修复和/或再生的改进的组合物和方法会使其受益。尽管近年来，角膜内皮病的手术治疗已通过使用薄层移植物得到了发展，但这种手术在技术上仍然很困难，而且使用珍贵的供体角膜组织。公认的并发症包括供体组织半脱位。

目前角膜损伤的医药治疗包括抗生素、眼罩(eye pad)、缝合和手术黏合剂，它们可有助于小问题。然而，它们不能充分解决较严重(advanced)情况下出现的问题，包括减轻疼痛、感染和/或疤痕组织的发展。感染是一种严重的并发症，通常需要住院治疗。瘢痕形成在严重的角膜损伤中很常见，可导致永久性视力丧失。在这种情况下，角膜移植是视力康复的唯一选择，但全世界都存在供体角膜短缺的问题。

上述问题中有许多问题并不局限于角膜损伤和疾病，在其他身体组织受损和/或退化的情况下也常见。

因此，需要用于组织修复和/或再生，和/或向组织和细胞等生物靶标有效递送药剂的改进的组合物和方法。

发明概述

本发明缓解了与目前用于组织修复和/或再生以及向生物靶标递送药剂的组合物和/或方法相关的至少一个问题。在角膜的情况下，本发明人出人意料地发现，包含IV型胶原的生物墨水与细胞(例如晶状体上皮细胞)相容，和/或者支持角膜内皮细胞的生长和/或增殖。此外，本发明的生物墨水是透明的、可交联的和/或可打印的，并且由于机械强度和柔韧性等特性，可用于生成各种尺寸的凝胶和/或支架。

此外，本发明的生物墨水可以支持向组织和细胞等生物靶标递送一系列药剂，从而将其应用扩展到与角膜相关的靶标之外的更广泛范围的靶标。

在不受限制的情况下，本文所述的组合物和方法通常可以用于向生物靶标(例如组织、膜、细胞)递送药剂(例如细胞、药物和/或其他物质)，并可以应用于例如组织(包括角膜组织)修复和/或再生。

本发明至少部分涉及以下实施方案：

实施方案1

-6-24mg/ml IV型胶原；

-0.04-0.15M钠离子和/或0.008-0.4M钙离子；以及

-一种或多种交联剂。

实施方案2.

实施方案3

实施方案4

实施方案5

实施方案6

实施方案7

实施方案8

实施方案9

实施方案10

实施方案11

实施方案12

实施方案13

实施方案14

(i)生长因子包含血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和/或成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)；和/或

(ii)维生素包含核黄素；和/或

(iii)基质蛋白包含I型胶原；和/或

(iv)基质蛋白包含层粘连蛋白。

实施方案15

实施方案16

实施方案17

(i)6-24mg/ml IV型胶原、0.06-0.1M钠离子和0.01-0.05M钙离子；或

(ii)3-15mg/ml IV型胶原、0.06-0.08M钠离子和0.015-0.03M钙离子；或

(iii)4-12mg/ml IV型胶原、0.06-0.07M钠离子和0.018-0.02M钙离子。

实施方案18

(i)小于24mg/ml IV型胶原；

(ii)多于0.04M钠离子；和

(iii)多于0.008M钙离子。

实施方案19

(i)提供包含以下的溶液：

-6-24mg/ml IV型胶原；

-一种或多种交联剂；和

-0.04-0.15M钠离子；和/或0.008-0.4M钙离子；

(ii)将该溶液应用于表面；和

(iii)激活该一种或多种交联剂。

实施方案20.

实施方案21

实施方案22

实施方案23

实施方案24

(i)提供包含以下的溶液：

-6-24mg/ml IV型胶原；

-一种或多种交联剂；以及

-0.04-0.15M钠离子；和/或0.008-0.4M钙离子；以及

(ii)将该溶液应用于表面，其中在应用于表面之前将该溶液分成至少两部分。

实施方案

(iii)向至少一个部分中添加纤维蛋白原，以形成制剂(a)；

(iv)向至少一个部分中添加凝血酶，以形成制剂(b)；以及

(v)将制剂(a)和(b)混合，以形成凝胶。

实施方案26

实施方案27

实施方案28

实施方案29

实施方案30

实施方案31

实施方案32

实施方案33

实施方案34

(i)生长因子包含血管内皮生长因子(VEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)；和/或

(ii)维生素包含核黄素；和/或

(iii)基质蛋白包含I型胶原；和/或

(iv)基质蛋白包含层粘连蛋白。

实施方案35

实施方案36

实施方案37

实施方案38

实施方案39

实施方案40

实施方案41

实施方案42

实施方案43

实施方案44

实施方案45

实施方案46

实施方案47

实施方案48

实施方案49

实施方案50

-6-24mg/ml IV型胶原；

-0.04-0.15M钠离子和/或0.008-0.4M钙离子；以及

-一种或多种交联剂。

实施方案51

-6-24mg/ml IV型胶原；

-0.04-0.15M钠离子和/或0.008-0.4M钙离子；以及

-一种或多种交联剂。

实施方案52

实施方案53

实施方案54

实施方案55

实施方案56

实施方案57

实施方案58

定义

在本申请中使用的单数形式"一个/一种(a)"、"一个/一种(an)"和"该/所述(the)"包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语"成分"也包括多种成分。

本文所用术语"包含/含有(comprising)"的意思是"包括"。"包含/含有"一词的变体，例如"包含/含有(comprise和comprises)"，具有相应的不同含义。因此，例如，“包含”成分‘A’的组合物可以完全由成分‘A’组成，或可以包括一种或多种附加成分(如成分‘B’和/或成分‘C’)。

本文所用术语"受试者"包括任何具有经济、社会或研究重要性的动物，包括牛科动物、马、绵羊、灵长类动物、鸟类和啮齿类动物。因此，"受试者"可以是哺乳动物，例如人类，或者是非人类哺乳动物。

本文所用术语"组织"应理解为包括作为组织成分的细胞和由组织形成的器官。

本文所用术语"试剂盒"是指用于递送材料的任何递送系统。此类递送系统包括允许将反应试剂(例如适当容器中的标签、参考样品、支持材料等)和/或支持材料(例如缓冲液、用于进行测定的书面说明等)从一个位置储存、运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒可以包括一个或多个装有相关反应试剂和/或支持材料的外壳，例如盒子。

本文所用的术语"约"，在涉及所陈述的数值时，包括所陈述的数值和所陈述数值的正负百分之十以内的数值。

本文所用术语"多个"指一个以上。在某些具体方面或实施方案中，多个可以表示2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多，以及由此可推导出的任何数值，和由此可推导出的任何范围。

本文所用术语"介于……之间"，在涉及数值范围时，包括该范围每个端点的数值。例如，浓度在0.008M和0.4M之间的钙离子包括浓度为0.008M的钙离子和浓度为0.4M的钙离子。

本文所用术语"大于"，在涉及数值时，应理解为"大于或等于"。例如，大于0.018M的钙离子包括0.018M的钙离子浓度和所有大于0.018M的钙离子浓度。

本文所用术语"小于"，在涉及数值时，应理解为"小于或等于"。例如，小于15mg/ml的IV型胶原包括15mg/ml的IV型胶原浓度和所有小于15mg/ml的IV型胶原浓度。

本文所用术语"中和的(neutralised)"，在描述IV型胶原时，应理解为表示胶原溶液的pH为6.7-7.6。例如，"中和的"IV型胶原的pH可以为6.8-7.5，或6.9-7.4，或7.0-7.3，或6.9-7.2，等等。

本文所用的"培养(culturing)"一词，当用于细胞的语境时，应理解为表示促进细胞的生长和/或增殖。培养"一词的变体，例如"培养/培养物(culture和cultures)"，具有相应的不同含义。因此，例如，"培养"细胞的方法应理解为促进细胞大小和数量增加的方法。

本文所用术语"交联(crosslink)"，在涉及胶原时，应理解为表示分子内和分子间共价键的增加。交联"一词的变体，例如"交联的(crosslinked)"和"交联(crosslinking)"，具有相应的不同含义。在某些情况下，胶原"交联"应理解为表示胶原原纤维中纤维内和纤维间共价键的增加。

本文中对现有技术文献的任何描述，或本文中由这些文献衍生或基于这些文献的陈述，并不是承认该文献或衍生的陈述是相关技术公知常识的一部分。

为便于说明，除非另有说明，本文提及的所有文件均通过引用全文并入。

附图简要描述

现在仅以举例的方式，参照附图描述本发明的优选实施方案，其中：

图1提供的图展示了暴露于UV光(1A)或蓝光(1B)3分钟的col-4溶液的流变测试数据，从3分钟的点开始。图1A提供了col-4溶液(12mg/mL)的UV流变测试结果，显示了由G`和G``确定的凝胶化点。图1B提供了col-4溶液(12mg/mL)暴露于蓝光(400-500nm)时的流变测试结果，显示了由G`和G``确定的凝胶化点。

图2提供了使用优化打印参数(例如温度、速度、流速和吸头(tip)直径)打印的col-4网格的代表性图像。

图3提供了用于在盖玻片上生成平的col-4膜的代表性过程示图。图3C提供了用纸代替图3B中用作基座(stand)的盖玻片的设置实例，展示了另一种改变高度的方法。

图4提供了不同类型col-4支架的代表性图像。图4A显示了在玻璃盖玻片上制作的薄膜(50μm)，该薄膜可用于培养细胞和制作角膜内皮片。图4B显示的是厚凝胶(5mm)。

图5提供了从宏观(上)和微观(下)观察到的col-1与col-4生物材料之间的透明度差异的代表性图像。

图6提供的代表性图像证明了暴露1周后col-1和col-4厚(1mm)凝胶和薄(50μm)膜对晶状体上皮细胞形态的影响。α-SMA(红色)是肌纤维母细胞特有的伸长的肌动蛋白应力纤维的标志物，这些细胞经历了从上皮细胞开始的上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。这些伸长的肌纤维母细胞似乎主要存在于col-1条件下，而col-4条件则保留了它们由β-联蛋白(绿色)突出显示的上皮表型，β-联蛋白是在较高浓度(最小12mg/mL)和厚度(最小1mm)的col-4条件下观察到的细胞边界和鹅卵石形态的标志物。所有图像均在40X放大率下拍摄。

图7提供了，与对照图像中所示的标准培养方法(在涂覆的塑料孔上)相比，在col-4膜上培养的角膜内皮细胞(永生细胞系)的代表性图像。监测扩增一周，所示的图像代表了接种后第一天即第0天(D0)、第4天(D4)和观察的最后一天即第6天(D6)的细胞。与对照组图像相比，Col-4表现出细胞扩增和正常形态。所有图像均在10X放大率下拍摄。

图8提供了在对照条件(B、D、F)下和在col-4膜上生长时(A、C、E)用3种不同细胞标志物即ZO-1、Ki-67和Na

图9提供了与标准培养方法(在col-1涂覆的孔上)相比，在col-4膜上培养的原代内皮细胞的代表性图像。图像是在一周内拍摄的，显示了第0天(D0)、第3天(D3)和第6天(D6)的代表性图像。所有图像均在10X放大率下拍摄。

图10提供的代表性图像描述了col-4/层粘连蛋白膜的机械强度，这由使用镊子可以轻松夹起并四处移动所证明。

发明详述

本发明人利用IV型胶原开发出了可打印胶原生物墨水，其具有可以促进以结构化形式应用于组织的机械和结构特性。本发明的生物墨水可以与细胞，例如晶状体上皮细胞相容，和/或可以支持角膜内皮细胞的生长和/或增殖。本发明的组合物可用于使用二维或三维(挤出)生物打印技术将胶原凝胶应用于组织(例如眼)。该组合物可以提供向生物靶标(例如器官、组织、细胞)递送药剂的手段。虽然适用于角膜，但本文所述的组合物为组织修复和/或再生领域的多种应用以及通过提供结构支持、活细胞和其他因子等方式递送药剂提供了平台。

本领域需要通过提供置换组织和/或置换细胞来帮助组织修复和/或再生的有效胶原衍生生物墨水。本文所述组合物基于IV型胶原。本发明的组合物也是用于递送各种生长因子和其他药剂的理想药剂。本文所述组合物可以利用生物材料，所述生物材料模拟体内组织，充当细胞定殖的支架，和/或通过操作条件激励细胞本身再生其周围基质。在其应用于眼组织的适用性方面，本发明人已经例如解决了产生基质的困难，该基质既能体现处理的组织(例如角膜)的结构完整性，又能保持透明度，同时还具有足够的多孔性和生物相容性以允许角膜细胞和生长因子的渗透、迁移和/或增殖。

满足受损组织(例如角膜等眼组织)的结构、机械和物理要求与提供受损组织的营养需要之间的平衡是本发明产生时就存在的问题。本发明提供了向各种各样的生物靶标递送药剂的改进的组合物和方法。在不限于任何具体应用的情况下，该组合物可用于组织修复和/或再生。

用于递送生物药剂的组合物

本发明提供了适用于向生物靶标(例如组织和细胞)递送药剂的组合物。该组合物还可用于组织修复和/或再生。

该组合物在应用于生物靶标(例如组织、膜、细胞、器官)时可以利用基底支架材料提供结构支撑，以促进向生物靶标递送药剂。

支架可以是胶原支架。例如，这些支架可以通过使用组合物中的IV型胶原生成。所用的IV型胶原与其天然存在的对应物相比可以是未修饰的。也可以使用经过修饰的IV型胶原。在一些实施方案中，修饰位于胶原纤维的末端。

本发明的组合物还可以任选地包含离子和/或一种或多种离子源。合适离子的非限制性实例包括钙离子和钠离子。合适离子源的非限制性实例包括含钙的化合物(例如氯化钙)和含钠的化合物(例如氯化钠)。钙离子和钠离子可以一起或单独存在于本发明的组合物中。

本发明人已经确定了用于本发明组合物的IV型胶原、钠离子和/或钙离子的优化的相对浓度，其中的一些描述于本申请的实施例和权利要求中。应当理解，所披露的IV型胶原、钠离子和/或钙离子的相对浓度仅仅是示例性的。

组合物可以包含6-24mg/ml IV型胶原、0.04-0.15M钠离子和/或0.008-0.4M钙离子。组合物可以包含1-20mg/ml IV型胶原、0.07-0.5M钠离子和/或0.008-0.4M钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含1-20mg/ml IV型胶原、0.06-0.25M钠离子和/或0.008-0.1M钙离子。组合物可以包含3-15mg/ml IV型胶原、0.06-0.25M钠离子和/或0.008-0.4M钙离子。组合物成分的其他可能范围包括3-15mg/ml IV型胶原、0.06-0.1M钠离子和/或0.01-0.05M钙离子。在某些实施方案中，组合物可以包含4-12mg/ml IV型胶原、0.06-0.08M钠离子和/或0.015-0.03M钙离子。或者，组合物可以包含5-10mg/ml IV型胶原、0.06-0.07M钠离子和/或0.018-0.02M钙离子。在一些实施方案中，组合物可以包含小于15mg/ml IV型胶原和大于0.06M的钠离子和/或大于0.018M的钙离子。

本发明的组合物还可以包含一种或多种交联剂。合适的交联剂的一个非限制性实例是核黄素。核黄素可以以0.01-0.5％(w/v)的浓度存在。核黄素可以以约0.01-0.1mg的量存在。在一些实施方案中，存在的核黄素的量为0.01、0.1mg或介于这些值之间的任何量。可以使用UV光或蓝光等光来激活核黄素，从而使组合物交联。本领域技术人员应当知道其他合适的交联剂和/或光源，例如玫瑰红染料(Rose Bengal dye)和绿光，两者都已被批准用于针对角膜的若干应用。在一些实施方案中，玫瑰红用作光交联剂，并由绿光激活。或者，玫瑰红用作光交联剂，并由白光激活。在一些实施方案中，0.01-0.5％(w/v)的玫瑰红用于光交联。在其他实施方案中，通过用玫瑰红和合适的光源交联胶原生物墨水而提供的组合物将会被着色。在一些实施方案中，颜色会是粉色的。这些着色的组合物可以用于监测组织中胶原的新陈代谢，或用于其他需要跟踪胶原活性的用途。在其他实施方案中，交联剂可以包含纤维蛋白原和/或凝血酶。

组合物还可以包含细胞。例如，细胞可以是哺乳动物细胞(例如人细胞、犬细胞、猫科动物细胞、牛科动物细胞、猪细胞、马细胞、羊细胞(caprine cell)、山羊细胞(hircinecell)、鼠科动物细胞、野兔细胞(leporine cell)、仓鼠细胞(cricetine cell)、鼬鼠科动物细胞或其任何组合)。使用的细胞类型通常会取决于待使用组合物的具体目的。例如，细胞的类型可以与要被施用组合物的组织相同(例如眼表细胞，包括中央和/或外周角膜上皮、球和/或睑板结膜上皮、睑板结膜基质和/或睑缘的细胞；皮肤细胞，包括但不限于角化细胞、黑素细胞、梅克尔细胞和朗格汉斯细胞；以及神经组织细胞，包括但不限于神经元和神经胶质细胞)。其他实例包括上皮细胞、角膜细胞、神经元细胞、感光细胞、米勒细胞和内皮细胞。内皮细胞可以是原代内皮细胞。在一些实施方案中，细胞可以是造血干细胞、骨髓干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或其任何组合。在一些实施方案中，细胞可以是神经元细胞。适合的上皮细胞的一个非限制性实例是晶状体上皮细胞。合适的内皮细胞的一个非限制性实例是角膜内皮细胞。组合物的细胞可以是自体的(即从意图接受组合物的既定受试者自身来源的)，也可以是异体的(即供体来源的)。

本发明的组合物可以包含必需氨基酸和/或非必需氨基酸。适合的必需氨基酸的非限制性实例包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸。

本发明的组合物可以包含另外的成分(例如一种/多种药剂)，包括但不限于纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、激素(例如胰岛素)、生长因子(例如人表皮生长因子(hEGF)、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)、上皮生长因子、转化生长因子[包括β]和结缔组织生长因子)、纤维蛋白稳定因子(例如因子XIII)、基质蛋白(例如胶原[例如I型胶原]、层粘连蛋白、整联蛋白)、维生素(例如维生素C、核黄素)、糖蛋白(例如运铁蛋白)、胎牛血清(FBS)、胎牛血清(FCS)、人血清、血小板裂解物、人血小板裂解物、治疗药物及其任意组合。在一些实施方案中，组合物包含含离子和氨基酸的培养基。合适的生长因子的非限制性实例包括血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。维生素可以是抗坏血酸(维生素C)和/或核黄素。基质蛋白可以包括但不限于I型胶原和/或层粘连蛋白。

本发明的组合物可以包括其他合适的组分，包括水和/或培养基(例如DMEM、DMEM/F-12、MEM、CnT-PR)。培养基可以包含例如以下中的任一种或多种：甘氨酸、L-丙氨酸、L-盐酸精氨酸、L-天冬酰胺-H

组合物的非限制性特性包括以下中的一种或多种：

-非牛顿剪切稀化流体特性，由此，组合物的黏度可随剪切速率的增加而降低。在一些实施方案中，组合物在室温下的黏度范围可以为0.01-1000Pa.s。

-光学清晰度，不会因透光率(例如，在400-700nm的视觉颜色范围内，超过90％)而妨碍或严重妨碍视觉。

-适合2D和/或3D打印(例如生物打印/挤出式打印)，具备打印后保持或基本上保持形状/结构的能力。

-适合打印，同时在打印过程中保持组合物中细胞的活力。

-在包括或不包括活细胞的情况下，以二维或三维结构被提供的能力。

-维持和/或促进细胞生长(例如维持和/或促进人原代细胞的扩增生长，所述人原代细胞例如上皮细胞(例如晶状体上皮细胞)、角膜细胞、神经元细胞和内皮细胞(例如角膜内皮细胞))的能力。

-促进球状体类器官(spheroid organoid)形成的能力。

-随时间(例如2-7天)被细胞降解的能力。

-随时间(例如34℃，7天)保持细胞活力。

-黏附于各种表面，包括组织、器官、膜(例如哺乳动物和人类组织、器官、膜)的能力。

组合物的制备

通常，本发明的组合物可以通过组合多种不同的制剂来制备。冻干牛IV型胶原可用于制备组合物。另外或可选地，也可以使用人胶原。在添加离子和组合物的其他成分之前，可以先中和IV型胶原。本领域技术人员会认识到，可以使用各种缓冲溶液将胶原保持在生理pH并保持可溶性。

在一些实施方案中，本发明提供了用于制备组合物的装置和/或试剂盒。装置和/或试剂盒可有助于将形成本发明组合物所需的不同制剂隔开直至使用。

装置和试剂盒还可以包括这样一个部件，该部件提供促进两个分隔开的制剂的混合的手段，例如，所述混合通过移除隔开第一隔室和第二隔室的屏障，和/或通过刺穿其中一个或两个隔室的密封或壁。本领域技术人员应当容易地理解，可以为此做出各种安排。

另外或可选地，可以以确保在两个分隔的制剂从装置或试剂盒中释放时或释放后的制剂混合的方式，配置装置和试剂盒。

在一些实施方案中，装置和试剂盒可包括另外的隔室，所述另外的隔室包含用于生成组合物的另外的成分(例如血小板裂解物、离子、氨基酸、细胞、抗生素、生长因子、纤维蛋白稳定因子、麻醉剂等)。装置或试剂盒可以以促进这些另外的成分相互混合和/或与组合物的其他成分混合的方式配置。

这些装置和试剂盒可以在将隔开的成分从装置或试剂盒中释放之前、释放期间或释放后立即促进成分的混合。

在一些实施方案中，组合物是生物墨水，装置是三维(3D)打印机(例如挤出式打印机)。

在本发明的一些实施方案中，交联剂是核黄素。在其他实施方案中，核黄素可以被UV光或蓝光激活。可将溶液(其可含有IV型胶原和钠离子和/或钙离子)以线的形式挤出，并且可以应用UV光或蓝光。可在第一条线上应用另外的线，以形成会通过交联剂和光的应用而交联的结构。

在一些实施方案中，交联发生在15分钟以内、14分钟以内、13分钟以内、12分钟以内、11分钟以内、10分钟以内、9分钟以内、8分钟以内、7分钟以内、6分钟以内、5分钟以内、4分钟以内、3分钟以内、2分钟以内或1分钟以内。所用的光源可以是3mW/cm

交联剂可以是玫瑰红。在一些实施方案中，玫瑰红由绿光激活。在另外的实施方案中，玫瑰红由白光激活。还再另外的实施方案中，交联发生在15分钟以内、14分钟以内、13分钟以内、12分钟以内、11分钟以内、10分钟以内、9分钟以内、8分钟以内、7分钟以内、6分钟以内、5分钟以内、4分钟以内、3分钟以内、2分钟以内或1分钟以内。所用的光源可以是100mw/cm

本发明的胶原凝胶可以根据应用而具有不同的厚度，例如，凝胶的厚度可以为50μm到3mm。

组合物的应用

本发明人已开发出用于向靶组织和细胞递送药剂以及用于组织修复和/或再生的组合物，其特性使其非常适合生物打印。本发明的组合物可用于需要递送药剂(例如天然生长因子、药物、纳米颗粒和/或细胞)和/或固定各生物表面的应用和/或组织培养方法中。

在一些实施方案中，组合物可以充当组织密封剂和/或生物结构的固定剂。它们可以为组织提供结构和/或营养支持。另外或可选地，组合物可以促进靶细胞类型的生长，包括可以作为组合物成分提供的细胞和/或靶组织中存在的细胞。组合物可用于培养细胞。

在一些实施方案中，通过用玫瑰红和适当的光源交联胶原生物墨水而提供的组合物将会被着色。在一些实施方案中，胶原组合物可以是粉色的。这些着色的组合物可用于监测组织中的胶原代谢，或其他需要跟踪胶原活性的用途。

尽管对于可以应用组合物的组织类型没有限制，但是本发明人已经证明，组合物与细胞(例如晶状体上皮细胞)相容，和/或可以支持角膜内皮细胞的生长和/或增殖。

例如，本文证明组合物有效支持角膜内皮细胞的生长和/或增殖。在这些实施方案中，组合物可用z于促进角膜内皮细胞的增殖和/或迁移。例如，组合物可以支持角膜上皮细胞的多向生长和/或分层，一旦形成细胞单层，角膜上皮细胞就会部分或完全生物降解组合物。

因此，本发明提供了向生物靶标递送各种药剂的方法。例如，靶标可以位于眼组织内或周围，包括中央和/或外周角膜上皮组织、球和/或睑板结膜上皮组织、睑板结膜基质、德塞梅膜和/或睑缘。

本领域普通技术人员应当认识到，在不背离广义描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案公开的本发明进行大量的变化和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面都应被视为说明性的而非限制性的。

实施例

现在将参考具体的实施例来描述本发明，实施例不应解释为以任何方式进行限制。

实施例一：室温(RT)下能够交联的可溶性IV型胶原(col-4)溶液的制备和表征

将Col-4粉末(最低浓度为6mg/mL)溶于0.1M乙酸中，然后用5M NaOH和27.4mg/mLCaCl

如表1所示，与使用I型胶原(col-1)相比，col-4方法仅使用了所需5M NaOH的一半多。

表1：使用12mg/mL胶原的col-1和col-4光交联溶液所需数量的比较。

添加钙离子后，就生成了透明的中和col-4溶液。所得的液体可以立即进行光交联，或储存在-30℃，供至少一周后使用。可以将溶液储存在RT下，供至少1小时后使用。可将不含核黄素的中和col-4储存在30℃，供至少一周后使用，其中交联特性没有变化。测试了从6mg/mL到24mg/mL的一系列Col-4溶液。光交联和漂洗后，6-18mg/mL的col-4溶液仍为透明结构。然而，24mg/mL的col-4溶液在交联和漂洗后溶解成碎片(pieces)，因此无法保持其三维结构。

光交联和流变测试

在流变测试中，用移液器从中心吸取100μL col-4溶液至流变仪的底板上。用平行板将液滴凝聚(condense)并铺展开，以完全覆盖底板区域。允许流变仪稳定3分钟。将液体暴露于UVA或蓝光(400-500nm)下3分钟。当G'>G”时确定凝胶点，表明溶液的黏度已超过弹性。

流变测试表明，最初的G'(黏度的度量)低于G”(弹性的度量)，表明溶液最初更加液体/水状。使用了针对365nm(UV波长)和400-500nm(蓝光)的滤光片。在365nm(UV)下，凝胶化起始点发生在溶液暴露于光的10.24秒内；完全交联时间为约3分钟(图1A)。在400-500nm(蓝光)下，凝胶化起点几乎立即发生，表明在蓝光下交联时间更快，因为完全交联发生于暴露1分钟后(图1B)。图1A和1B中的虚线表示完全交联时间。所用的UV光和蓝光的功率均为3mW/cm

印刷适性测试

为了评估col-4的印刷适性，在University of Wollongong的TRICEP设施处，使用Edu3D打印机进行了孔径测试。在暴露于蓝光(波长为405nm)下，通过注射器吸头挤出col-4溶液并打印成9x9 mm的2层网格(lattice)。对包括温度、墨水流速和打印速度在内的多个参数进行调整，以确定将col-4打印为生物墨水的最佳设置。通过计算网格中可见的6个孔的内部周长(L)和面积(A)来确定印刷适性。然后将L和A的平均值输入以下公式：Pr＝L

在Edu3D打印机上测试了不同的参数，包括温度、速度、流速和吸头直径。经确定优化参数为：温度22℃(RT)、流速0.8mm/min(表示挤出的生物墨水的量)、打印速度150mm/min以及通过直径0.26mm的25GA吸头挤出。在这些条件下，印刷适性经确定为0.99。该值非常接近于1，表明该结构很好地保持了形状，可以认为是可打印的(图2A/B)。

不同厚度的col-4支架的产生

交联能力允许生成不同厚度的col-4支架。使用不同量的溶液产生不同的形状/模具(mould)。

生成胶原凝胶

为了生成厚度为5mm的凝胶，如上所述产生了col-4溶液。通过将吸头从1mL注射器(直径5mm)切掉，制成模具。注射器内的活塞也被切成扁平，并用石蜡膜覆盖。改进后的注射器通过蓝丁胶(blu-tack)保持直立，直接置于UV光或蓝光下。注射器的活塞设置在顶部下方5mm处，以使添加的溶液交联成5mm厚的凝胶。需要90μL col-4溶液来填充注射器中的空间。将注射器中的col-4溶液暴露于UV光/蓝光10分钟，以确保整个厚度的交联。这种使用不同直径注射器的方法可用于产生具有不同厚度和尺寸的凝胶。

生成胶原膜

为了生成厚度约为50μm、直径为13mm的col-4膜，将25μL col-4溶液(图3A)用移液器吸取到13mm的圆形玻璃盖玻片上。玻璃盖玻片充当col-4溶液的支撑基底。也可以在塑料如聚苯乙烯或石蜡膜上交联col-4，石蜡膜是蜡和聚烯烃的混合物。如图3B/C所示，当使用玻璃盖玻片作为支撑基底时，然后在液滴顶部上放置石蜡膜包裹的透明聚苯乙烯板。将溶液铺展开，以填充区域，并使用UVA光(3mW/cm

上述方法允许生成薄膜，该薄膜在培养实验中可以用于产生角膜内皮片和厚凝胶。上述产生胶原凝胶的模塑方法可以用于生成厚col-4支架，例如可以生成5mm厚的col-4圆柱形支架(图4A)。使用上述生成膜的方法，可以生成不同的膜厚度，一个实例是50μm的膜(图4B)。所得的膜结构附着于基底支撑材料，例如玻璃盖玻片(图4B)。这些结果表明，col-4光交联溶液可用于生成各种形状和形式的结构。

col-4膜的透明度测试

在University of Wollongong的AIIM设施处，使用ColorQuest XE进行透明度测试。该机器通过测量透过黑色平板的透光率而标准化。将黏附于透明盖玻片的Col-4膜(厚度约50μm)装入机器，然后测量总透光率。

3个样品的平均透光率为90.4％，其与自然角膜的透光率相符。发现从盖玻片上取下的一个样品的透光率为91.13％，这表明盖玻片并没有明显改变材料的透光率。相比之下，用同样方法制备和测试的3个col-1样品的平均透光率为86.2％。在比较col-1和col-4生物材料时，还可以从宏观和微观上看出这些透明度差异(图5)。

细胞相容性

通过在col-4膜的上面培养晶状体细胞和角膜内皮细胞，用这些细胞评估col-4溶液的细胞相容性。

col-4膜上的晶状体上皮细胞

通过采集出生后大鼠的原代晶状体上皮(附着于其原生膜--晶状体囊上)作为外植体，获得晶状体上皮细胞。在此程序中，从安乐死的大鼠取出眼，经视神经从后方撕开，取出晶状体。确定晶状体的后侧，然后撕开晶状体囊并剥离至晶状体赤道。可以看到含有晶状体上皮的晶状体囊前侧为较厚的组织片，在移除并丢弃晶状体纤维细胞团时将其分离出来。然后通过用镊子在边缘施加压力，将这种晶状体上皮片固定在皿(dish)上(以形成外植体)，并培养于M99培养基中(M199浓缩液，含Earle盐、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，调至pH 7.2，补充有两性霉素B(250μg/mL)、牛血清白蛋白(1mg/mL)、Pen/Strep(10,000U/mL青霉素和10,000μg/mL链霉素)和L-谷氨酰胺(68.4mM)。为了测试胶原量对晶状体细胞的不同影响，制作了col-4薄膜和厚凝胶。如上所述，制作了50μm薄膜和1mm厚凝胶。通过将这些胶原薄膜/凝胶钉在外植体顶部，使晶状体上皮细胞暴露于col-4，从而上皮细胞直接暴露于胶原。对照条件定义为晶状体上皮外植体未暴露于任何胶原的条件。

还生成了col-1薄膜和厚凝胶，并用作对比组。以与如上所述将晶状体上皮细胞暴露于col-4相同的方法，将其暴露于col-1。

观察一周后，去除胶原，用10％中性缓冲福尔马林(NBF)固定晶状体外植体(10分钟)，冲洗(3x 5min)，然后储存在70％的乙醇中，直至进行免疫染色。用β-联蛋白(上皮细胞膜标志物)和α-SMA(间充质细胞标志物)对晶状体上皮外植体进行染色。与角膜内皮片染色相比，以不同的方式进行这种免疫染色。在RT下，在PBS/BSA中以3x5 min洗涤使角膜水合，然后在PBS/BSA/Tween-20中透化(3x5 min)。将外植体在PBS/BSA中冲洗2x50 min。去除过量的缓冲液，以在外植体上制作液体薄膜。将60μL 3％的正常山羊血清(NGS)施加于外植体，并在RT下放置30分钟，以进行阻断。将在3％ NGS中稀释的一抗施加于外植体。将外植体在4℃加湿室中孵育过夜。在PBS/BSA中冲洗外植体3x5 min。在PBS/BSA中稀释二抗并添加到外植体中。将外植体在黑暗的加湿室中孵育2小时。将外植体在PBS/BSA中漂洗3x5 min，然后向皿中添加1mL Hoechst(在PBS/BSA中稀释)，持续5分钟。在用10％的PBS/甘油将外植体和盖玻片封固之前，进行最后2x5 min的PBS/BSA的洗涤。

与col-1相比，暴露于col-4时，晶状体上皮细胞的生物相容性存在明显差异。暴露于col-1的晶状体上皮细胞转化为肌纤维母细胞。这些肌纤维母细胞是伸长的细胞，用α-SMA染色时，它们显示出明显的肌动蛋白应力纤维，这是间充质细胞(白内障中发现的典型病理细胞)的标志物。相比之下，被β-联蛋白(晶状体上皮细胞完整性的标志物)染色的、暴露于col-4(晶状体囊的正常成分)的细胞，在上皮细胞边界周围显示出强的膜染色(图6)。这种染色在细胞暴露于较高浓度的col-4的条件下尤为突出，即12mg/mL和18mg/mL条件下。使用Hoechst对细胞核进行反标记(蓝色；图6)。当细胞暴露于更多量的col-4时，即应用厚(1mm)凝胶的条件下，该效果也更明显。

总之，维持晶状体上皮细胞要求col-4的最低浓度为12mg/mL，而相同浓度的col-1导致晶状体上皮细胞转化为肌纤维母细胞(白内障)细胞。

在col-4膜上培养角膜内皮细胞

使用上述生成胶原膜的方法，生成了50μm厚的透明col-4膜。在5％ FCS培养基(Nutrient Mixture Ham's F12和Medium 199的1:1混合物，5％ FCS、20μg/mL抗坏血酸、10ng/mL FGF-2和10,000U/mL青霉素以及10,000μg/mL链霉素)和5％的hPL培养基(成分相同，但用5％的hPL代替5％的FCS)中，在col-4膜上培养永生角膜内皮细胞系(B4G12)(细胞密度为1x10

还在col-4膜上培养了从供体角膜缘获得的原代内皮细胞。将剩余的德塞梅膜从角膜边缘切下，并将碎块放入500μL的胶原酶A(2mg/mL)中4小时，以消化。消化后，在20℃以190g将试管离心5min。除去胶原酶，并用100μL的TrypLE(胰蛋白酶溶液)替代。将样品管在37℃水浴中放置10分钟，中途彻底搅拌。添加400μL M5(维持培养基--人内皮SFM、5％ FCS和1％Pen/Strep)培养基，以使TrypLE失活。如前所述离心溶液。在不干扰细胞团块的情况下去除上清液，然后添加75μL M5培养基。重悬浮细胞并用移液管吸取到col-4膜上(之前置于12孔板中)，并使其在37℃黏附45分钟。细胞黏附后，向孔中添加500μL M5培养基。第二天，用M4培养基(增殖培养基--与5％FCS培养基相同的混合物)替换M5培养基。

在比较时，使用标准方法培养细胞，标准方法包括用col-1溶液(在20mM乙酸中1:20稀释的col-1溶液)涂覆12孔板的塑料孔。消化后，然后在对照条件下将细胞接种到这些涂覆的孔上。

一旦角膜内皮细胞(细胞系和原代细胞二者)达到完全融合，就针对角膜内皮细胞标志物对细胞进行免疫染色：Zonula occuldins-1(ZO-1)和Na

在col-4膜上培养的角膜内皮细胞系所达到的平均密度为3784个细胞/mm

免疫染色结果表明，col-4上的细胞表达了强的内皮标志物ZO-1(紧密连接的细胞边界标志物)和Na+K-ATP酶(钠-钾泵的标志物)(图8)。检测到Ki-67的强染色，这表明细胞增殖(图8)。

如图9所示，与使细胞在col-1涂覆的孔上生长的标准培养方法(对照)相比，原代内皮细胞在col-4膜上也很好地增殖。在col-4上生长的细胞似乎扩增成具有六边形形态的较好的内皮细胞斑块(patch)，相比之下，对照组中的成纤维细胞样细胞则保留了更加干细胞样的特征。因此，col-4膜似乎促进具有有限增殖活性的患者的原代内皮细胞的生长。

Col-4溶液作为其他分子的载体

可以通过添加其他分子对col-4生物墨水进行修饰。使用层粘连蛋白(另一种细胞外基质蛋白)作为实例。添加的层粘连蛋白来自小鼠肉瘤基底膜，并且也用作使角膜内皮细胞生长的培养孔所使用的涂覆溶液的成分。向90μL col-4溶液(12mg/mL)中添加10μL层粘连蛋白(原液：10μg/mL)，使得层粘连蛋白的最终浓度为1μg/mL。在正常的涂覆溶液中，层粘连蛋白在硫酸软骨素溶液中的浓度约为1μg/mL。如上所述，使溶液交联。添加核黄素后，将90μL col-4溶液转移到新eppendorf管中。向col-4溶液中添加10μL先前解冻的层粘连蛋白(最初储存在-20℃)。将新溶液涡旋20秒并离心5秒。使用上文所述方法制作胶原-层粘连蛋白膜。洗涤后，将制作的透明膜储存在4℃，直至使用。

掺入层粘连蛋白后，col-4溶液保持可交联，所得的膜保持了人眼观察到的正常透明度。与只有col-4的膜相比，对于col-4/层粘连蛋白膜也观察到类似的机械强度(图10)。通过使用镊子轻松处理膜，这种强度是可以观察到的，这也是针对只有col-4的膜所观察到的特征。这表明开发的col-4墨水具有携带其他分子并仍保持可交联的潜力。