一种双粒径磁珠化学发光试剂改进方法及应用

技术领域

本发明涉及磁珠化学发光试剂，具体为一种双粒径磁珠化学发光试剂改进方法及应用。

背景技术

现有专利名称为β2-GP1包被磁珠的制备方法及其制备的磁珠与应用，本发明提供了β2-GP1磁珠的制备方法，其包括：对甲苯磺酰基磁珠活化后，将磁珠与β2-GP1溶液混合，用浓度为0.05～1.0M，pH值为9～11.5的碱性缓冲液定容，震荡反应包被30～120min，分离磁珠。

本发明所述的方法中，所述磁珠包被前还包括磁珠活化的步骤。所述包被后，还包括以磁微粒缓冲液定容的步骤。所述活化是指活化磁珠表面的基团即用适宜的缓冲液将磁珠洗涤、震荡后磁分离。

所述磁珠悬液中磁珠的密度为1mg/mL；所述磁微粒缓冲液包括：水、Tris、NaCl、HCl、牛血清白蛋白、Proclin300和甘油。一些实施例中，所述磁珠悬液中包括水和如下浓度的：6.05g/L的Tris、8.20g/L的NaCl、1wt％～3wt％牛血清白蛋白、0.05wt％～0.2wt％Proclin300和1vol％～10vol％甘油。

本实施例中，说明了磁珠含有对甲苯磺酰基活性基团，是均一粒子，粒子直径是0.05-5um。

从上述专利描述是可得知，其磁珠含有对甲苯磺酰基活性基团的直径是0.05-5μm，且其应用范围在β2-GP1。

发明内容

本发明为克服现有技术弊端，提出一种双粒径磁珠化学发光试剂改进方法及应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双粒径磁珠化学发光试剂改进方法，包括小粒径磁珠包被和大粒径磁珠包被，其过程为：取小磁珠200ul，用反应缓冲液洗涤三次，除去上清后加入1ml反应缓冲液，在Vortex混匀器上35～45℃混匀2～5分钟后加入4.8ug/ml，单克隆抗体20.83ul，再次利用Vortex混匀器上35～45℃混匀1～2分钟，加入500ul的硫酸铵溶液，继续在Vortex混匀器上35～45℃混匀12～24小时后加入40ul的封闭剂，反应0.5～1小时后除去上清，用清洗缓冲液清洗三次，加入1ml反应缓冲液，并保存在2-8℃条件下。所述反应缓冲液为0.1M PH＝9.97硼酸缓冲液，封闭剂为10％BSA溶液。所述反应缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro950 0.53g。另取大磁珠按上述方法同等制备。大小磁珠通过实验最终选择按照2：1的比例混匀后放入2-8℃条件下保存。

上述小粒径磁珠包被和大粒径磁珠包被，小粒径磁珠包被的粒径为0.05～1.5um的磁珠，大粒径磁珠包被的粒径为1.5～5um。

本发明化学发光试剂均采用双抗体夹心法，以双粒径磁珠作为抗体载体，两种粒径不同的磁珠各自发挥优势。磁珠粒径越小饱和磁性越小,吸附效率则越大,具有小尺寸效应和表面效应,即小粒径(0.05-1.5um)磁珠比表面积大，其表面结合的羧基数量增加，提供更多的抗原结合位点与抗原氨基发生缩合反应，在固定的反应体系中，对应的固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物增多，发光值升高，检测上限增大。大粒径(1.5-5um)磁珠虽然表面覆盖的羧基数量少，但空间位阻小，在相同条件下与抗原结合亲和力更高，即能更好捕捉较低分析物浓度的抗原，且磁珠粒径越大体积越大，磁含量增加，磁分离效率提高，检测灵敏度与准确度更高。两者联用，具有协同效应，降低试剂用量，节约成本，提高了反应体系的灵敏度与线性范围等。

应用双粒径磁珠化学发光的试剂盒，试剂盒包括吖啶酯标记单抗溶液、标准品溶液、偶联单抗双磁珠混悬液和发光底物。

上述吖啶酯标记单抗溶液，其包括单抗溶液、吖啶酯溶液、甘氨酸、标记透析液，其配比是单抗溶液7.79ng/ml、吖啶酯溶液16ul、10％甘氨酸13.35ul、标记透析液2L。

上述单抗溶液是7.79ng/ml的PCT单抗溶液、5.00ng/ml的MYO单抗溶液、3.42ng/ml的IL6单抗溶液中的一种。

上述发光试剂盒中所述吖啶酯标记单抗溶液制备方法是：步骤一，取单抗溶液128.4-292.4ul，以0.02M、PH＝7.0的PB为稀释液，加入稀释液206.51-371.6ul，步骤二，再加入吖啶酯溶液16ul，混匀后放入Vortex混匀器上22℃标记30-60分钟；步骤三，加入标记终止缓冲液(包括10％甘氨酸0.01M NaHCO3(pH＝9.0)溶液)13.35ul，继续在Vortex混匀器上22℃混匀30分钟；步骤四，而后将标记好的吖啶酯抗体复合物转移至透析袋中，将此透析袋放入2L的标记透析液中，在4℃，磁力搅拌的环境下透析；步骤五，每隔2h更换透析液，共更换5次。

所述标记透析液包括0.2M磷酸二氢钠95ml、0.2M磷酸氢二钠405ml、氯化钠87.66g及0.25M EDTA 40ml。

上述发光试剂盒所述标准溶液由可溯源的蛋白经过校准品稀释液稀释而成，所述校准品稀释液为0.05M,Ph＝7.52的Tris-HCL缓冲液，包括1M,Ph＝8的Tris-HCL溶液54g，氯化钠11.7g、BSA20g、吐温-20 1.01g、pro950 1.01g。

上述发光试剂盒所述发光底物包括激发液(A液)与预激发液(B液)，所述A液制备过程为：取5g氢氧化钠溶解于498.5g的纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。所述B液制备过程为：取3.14g硝酸，1.6g过氧化氢溶于498.6g纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。

上述发光试剂盒所述双抗夹心法具体操作如下：以0.01M，ph＝8.0的吖啶酯保存液为AE稀释液，稀释比例为3000。以缓冲液为偶联单抗双磁珠混悬液的稀释液，将浓度稀释至0.1mg/ml加入反应体系。整个反应为一步法，即依次加入样本，偶联单抗双磁珠混悬液，吖啶酯标记单抗溶液，三者混匀反应18分钟后用强化清洗液洗涤4次，再加入预激发液与激发液激发发光，仪器接受并处理光信号。所述吖啶酯保存液包括0.2M磷酸二氢钠9.5ml、0.2M磷酸氢二钠40.5ml、氯化钠8.77g、吐温-20 1.01g、曲拉通X-100 1.06g、BSA10g、蔗糖50g、0.25M EDTA 4ml及防腐剂1ml。所述缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro950 0.53g。所述强化清洗液包括0.2M磷酸二氢钠47.5ml、0.2M磷酸氢二钠202.5ml、氯化钠46g、吐温-20 5.8g、pro3005.3g。

本发明化学发光试剂采用双抗体夹心法，以双粒径磁珠作为抗体载体，两种粒径不同的磁珠各自发挥优势。磁珠粒径越小饱和磁性越小,吸附效率则越大,具有小尺寸效应和表面效应,即小粒径(0.05-1.5um)磁珠比表面积大，其表面结合的羧基数量增加，提供更多的抗原结合位点与抗原氨基发生缩合反应，在固定的反应体系中，对应的固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物增多，发光值升高，检测上限增大。大粒径(1.5-5um)磁珠虽然表面覆盖的羧基数量少，但空间位阻小，在相同条件下与抗原结合亲和力更高，即能更好捕捉较低分析物浓度的抗原，且磁珠粒径越大体积越大，磁含量增加，磁分离效率提高，检测灵敏度与准确度更高。两者联用，具有协同效应，降低试剂用量，节约成本，提高了反应体系的灵敏度与线性范围等。

附图说明

图1为小粒径磁珠下PCT化学发光测试反应曲线发光测试反应曲线；

图2为大粒径磁珠下PCT化学发光测试反应曲线发光测试反应曲线；

图3为大小粒径磁珠不同比例作用下PCT化学发光测试反应曲线；

图4为改进前实际MYO化学发光测试反应曲线发光测试反应曲线；

图5五为大小粒径磁珠不同比例作用下MYO化学发光测试反应曲线；

图6为改进前后MYO化学发光测试反应曲线；

图7为小粒径磁珠下IL6化学发光测试反应曲线发光测试反应曲线；

图8为大粒径磁珠下IL6化学发光测试反应曲线发光测试反应曲线；

图9为大小粒径磁珠不同比例作用下IL6化学发光测试反应曲线。

附图说明：所有附图的水平方向为浓度，垂直方向为发光值，图3，大小粒径磁珠不同比例下PCT反应曲线，实线为大小粒径比为4：1，虚实线为大小粒径比为1：2，虚线为大小粒径比为1：1，图5，大小粒径磁珠不同比例的MYO反应曲线，实线为大小粒径比为1：3，虚实线为大小粒径比为1：1，虚线为大小粒径比为1：1，，图6，改进前后MYO反应曲线，改进前为实线，改进后为虚线，图9，大小粒径磁珠不同比例的IL6反应曲线，实线为大小粒径比为1：1，虚实线为大小粒径比为2：1，虚线为大小粒径比为2：3。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应用实例1---PCT试剂盒

实际应用中发现PCT的反应性较低，灵敏度不高，应用效率低，本发明应用上述原理，制备一种能提高PCT化学发光检测灵敏度与线性范围的技术与试剂盒。

所述试剂盒采用双抗体夹心法，试剂盒包括吖啶酯标记单抗溶液、标准品溶液、偶联单抗双磁珠混悬液和发光底物。

上述发光试剂盒所述吖啶酯标记单抗溶液制备过程为：取7.79ng/ml的PCT单抗溶液128.4ul，以0.02M、PH＝7.0的PB为稀释液，加入稀释液371.6ul，再加入吖啶酯溶液16ul，混匀后放入Vortex混匀器上22℃标记60分钟。加入标记终止缓冲液(包括10％甘氨酸0.01MNaHCO3(pH＝9.0)溶液)13.35ul，继续在Vortex混匀器上22℃混匀30分钟。而后将标记好的吖啶酯抗体复合物转移至透析袋中，将此透析袋放入2L的标记透析液中，在4℃，磁力搅拌的环境下透析。每隔2h更换透析液，共更换5次。所述标记透析液包括0.2M磷酸二氢钠95ml、0.2M磷酸氢二钠405ml、氯化钠87.66g及0.25M EDTA 40ml。

上述发光试剂盒所述标准溶液由可溯源的PCT蛋白经过校准品稀释液稀释而成，所述校准品稀释液为0.05M,Ph＝7.52的Tris-HCL缓冲液，包括1M,Ph＝8的Tris-HCL溶液54g，氯化钠11.7g、BSA20g、吐温-20 1.01g、pro950 1.01g。

上述发光试剂盒所述偶联单抗双磁珠混悬液制备包括小粒径磁珠包被和大粒径磁珠包被，所述小粒径本试剂盒通过实验最终选择粒径为0.3um的磁珠，大粒径选择1.6um。过程为：取粒径为0.3um的小磁珠200ul，用反应缓冲液洗涤三次，除去上清后加入1ml反应缓冲液，在Vortex混匀器上37℃混匀5分钟后加入4.8ug/ml，单克隆抗体20.83ul，再次利用Vortex混匀器上37℃混匀1分钟，加入500ul的硫酸铵溶液，继续在Vortex混匀器上37℃混匀24小时后加入40ul的封闭剂，反应1小时后除去上清，用清洗缓冲液清洗三次，加入1mlPCT反应缓冲液，并保存在2-8℃条件下。所述反应缓冲液为0.1M PH＝9.97硼酸缓冲液，封闭剂为10％BSA溶液。所述PCT反应缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro950 0.53g。另取粒径为1.6um的大磁珠按上述方法同等制备。大小磁珠通过实验最终选择按照2：1的比例混匀后放入2-8℃条件下保存。

上述发光试剂盒所述发光底物包括激发液(A液)与预激发液(B液)，所述A液制备过程为：取5g氢氧化钠溶解于498.5g的纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。所述B液制备过程为：取3.14g硝酸，1.6g过氧化氢溶于498.6g纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。

上述发光试剂盒所述双抗夹心法具体操作如下：以0.01M，ph＝8.0的吖啶酯保存液为AE稀释液，稀释比例为3000。以PCT反应缓冲液为偶联单抗双磁珠混悬液的稀释液，将浓度稀释至0.1mg/ml加入反应体系。整个反应为一步法，即依次加入样本，偶联单抗双磁珠混悬液，吖啶酯标记单抗溶液，三者混匀反应18分钟后用强化清洗液洗涤4次，再加入预激发液与激发液激发发光，仪器接受并处理光信号。所述吖啶酯保存液包括0.2M磷酸二氢钠9.5ml、0.2M磷酸氢二钠40.5ml、氯化钠8.77g、吐温-20 1.01g、曲拉通X-100 1.06g、BSA10g、蔗糖50g、0.25M EDTA 4ml及防腐剂1ml。所述PCT反应缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro9500.53g。所述强化清洗液包括0.2M磷酸二氢钠47.5ml、0.2M磷酸氢二钠202.5ml、氯化钠46g、吐温-20 5.8g、pro300 5.3g。

图片解析：

图一显示仅用小粒径磁珠下PCT化学发光测试反应曲线，该曲线线性良好，检测上限信号值较高，但低值较低；

图二显示大粒径磁珠下PCT化学发光测试反应曲线，该曲线低值信号良好，但高值趋于平缓。

图三为大小粒径磁珠不同比例作用下PCT化学发光测试反应曲线，其中大小粒径比例为1：1时信号明显比单用小粒径或大粒径时的高，显示双粒径联用的可行性。由于2：1时小粒径占比相较于4：1时高，故三组中其高值信号最高，4：1时大粒径占比最高，故在三组中低值最高。综合考虑下，本次试剂盒选用大小粒径2：1作为实际应用比例。

实验数据：

应用实例2---MYO试剂盒

实际应用中发现MYO的检测范围窄，测试时通常需要将样本稀释后才能进行测试，增加误差来源，且最终测试值为数学层面的数值，即测试值乘以相应稀释倍数，这种测试值与实际值之间误差几何未有明确定论。本发明应用上述原理，制备一种能提高MYO化学发光检测线性范围的技术与试剂盒，应用时无需稀释，测试值即实际浓度对应的数值。

所述试剂盒采用双抗体夹心法，试剂盒包括吖啶酯标记单抗溶液、标准品溶液、偶联单抗双磁珠混悬液和发光底物。

上述发光试剂盒所述吖啶酯标记单抗溶液制备过程为：取5.00ng/ml的MYO单抗溶液232.56ul，以0.02M、PH＝7.0的PB为稀释液，加入稀释液267.44ul，再加入吖啶酯溶液31.5ul，混匀后放入Vortex混匀器上22℃标记60分钟。加入标记终止缓冲液(包括10％甘氨酸0.01M NaHCO3(pH＝9.0)溶液)26.67ul，继续在Vortex混匀器上22℃混匀30分钟。而后将标记好的吖啶酯抗体复合物转移至透析袋中，将此透析袋放入2L的标记透析液中，在4℃，磁力搅拌的环境下透析。每隔2h更换透析液，共更换5次。所述标记透析液包括0.2M磷酸二氢钠95ml、0.2M磷酸氢二钠405ml、氯化钠87.66g及0.25M EDTA 40ml。

上述发光试剂盒所述标准溶液由可溯源的MYO蛋白经过校准品稀释液稀释而成，所述校准品稀释液为0.05M,Ph＝7.52的Tris-HCL缓冲液，包括1M,Ph＝8的Tris-HCL溶液54g，氯化钠10g、BSA 10g、吐温-20 1.01g、pro950 1.01g。

上述发光试剂盒所述偶联单抗双磁珠混悬液制备包括小粒径磁珠包被和大粒径磁珠包被，所述小粒径本试剂盒通过实验最终选择粒径为0.2um的磁珠，大粒径选择3.0um。过程为：取粒径为0.2um的小磁珠200ul，用反应缓冲液洗涤三次，除去上清后加入1ml反应缓冲液，在Vortex混匀器上37℃混匀5分钟后加入4.3ug/ml，单克隆抗体23.26ul，再次利用Vortex混匀器上37℃混匀1分钟，加入500ul的硫酸铵溶液，继续在Vortex混匀器上37℃混匀24小时后加入40ul的封闭剂，反应1小时后除去上清，用清洗缓冲液清洗三次，加入1mlMYO反应缓冲液，并保存在2-8℃条件下。所述反应缓冲液为0.1M PH＝6.01MES缓冲液，封闭剂为10％BSA溶液。所述MYO反应缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro950 0.53g。另取粒径为3.0um的大磁珠按上述方法同等制备。大小磁珠通过实验最终选择按照1：3的比例混匀后放入2-8℃条件下保存。

上述发光试剂盒所述发光底物包括激发液(A液)与预激发液(B液)，所述A液制备过程为：取5g氢氧化钠溶解于498.5g的纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。所述B液制备过程为：取3.14g硝酸，1.6g过氧化氢溶于498.6g纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。

上述发光试剂盒所述双抗夹心法具体操作如下：以0.01M，ph＝7.0的吖啶酯保存液为AE稀释液，稀释比例为2000。以MYO反应缓冲液为偶联单抗双磁珠混悬液的稀释液，将浓度稀释至0.3mg/ml加入反应体系。整个反应为一步法，即依次加入样本，偶联单抗双磁珠混悬液，吖啶酯标记单抗溶液，三者混匀反应18分钟后用强化清洗液洗涤4次，再加入预激发液与激发液激发发光，仪器接受并处理光信号。所述吖啶酯保存液包括0.2M磷酸二氢钠19.5ml、0.2M磷酸氢二钠30.5ml、氯化钠8.77g、吐温-20 1.01g、曲拉通X-100 1.06g、BSA10g、蔗糖50g、0.25M EDTA 4ml及防腐剂1ml。所述MYO反应缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro9500.53g。所述强化清洗液包括0.2M磷酸二氢钠47.5ml、0.2M磷酸氢二钠202.5ml、氯化钠46g、吐温-20 5.8g、pro300 5.3g。

图四显示目前实际应用条件即样本稀释20倍下利用大粒径包被的测试反应曲线。该曲线线性良好，但检测上限信号值较低，高浓度样本需要进行稀释后方可进行测试。

图五为大小粒径磁珠不同比例作用下MYO化学发光测试反应曲线，其中大小粒径比例为1：1时信号明显比实际应用时的高，显示双粒径联用的可行性。1：1时大粒径占比最高，故在三组中低值最高。1：3时小粒径占比相较于1：2时高，故三组中其高值信号最高，检测上限大幅度增加，高浓度样本无需进行稀释即可进行测试。

综合考虑下，本次试剂盒选用大小粒径1：3作为实际应用比例。

实验数据：

应用实例3---IL6试剂盒

实际应用中发现IL6的线性范围窄，整体信号值低，灵敏度差。本发明应用上述原理，制备一种能提高IL6化学发光灵敏度与信号值的技术与试剂盒。

所述试剂盒采用双抗体夹心法，试剂盒包括吖啶酯标记单抗溶液、标准品溶液、偶联单抗双磁珠混悬液和发光底物。

上述发光试剂盒所述吖啶酯标记单抗溶液制备过程为：取3.42ng/ml的IL6单抗溶液292.4ul，以0.02M、PH＝7.0的PB为稀释液，加入稀释液207.6ul，再加入吖啶酯溶液31.5ul，混匀后放入Vortex混匀器上22℃标记60分钟。加入标记终止缓冲液(包括10％甘氨酸0.01M NaHCO3(pH＝9.0)溶液)26.67ul，继续在Vortex混匀器上22℃混匀30分钟。而后将标记好的吖啶酯抗体复合物转移至透析袋中，将此透析袋放入2L的标记透析液中，在4℃，磁力搅拌的环境下透析。每隔2h更换透析液，共更换5次。所述标记透析液包括0.2M磷酸二氢钠95ml、0.2M磷酸氢二钠405ml、氯化钠87.66g及0.25M EDTA 40ml。

上述发光试剂盒所述标准溶液由可溯源的IL6蛋白经过校准品稀释液稀释而成，所述校准品稀释液为0.05M,Ph＝7.52的Tris-HCL缓冲液，包括1M,Ph＝8的Tris-HCL溶液54g，氯化钠10g、BSA10g、吐温-20 1.01g、pro950 1.01g。

上述发光试剂盒所述偶联单抗双磁珠混悬液制备包括小粒径磁珠包被和大粒径磁珠包被，所述小粒径本试剂盒通过实验最终选择粒径为0.5um的磁珠，大粒径选择3.0um。过程为：取粒径为0.5um的小磁珠200ul，用反应缓冲液洗涤三次，除去上清后加入1ml反应缓冲液，在Vortex混匀器上37℃混匀5分钟后加入2.31ug/ml，单克隆抗体43.29ul，再次利用Vortex混匀器上37℃混匀1分钟，加入500ul的硫酸铵溶液，继续在Vortex混匀器上37℃混匀24小时后加入40ul的封闭剂，反应1小时后除去上清，用清洗缓冲液清洗三次，加入1MIL6反应缓冲液，并保存在2-8℃条件下。所述反应缓冲液为0.1M PH＝6.01MES缓冲液，封闭剂为10％BSA溶液。所述IL6反应缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro950 0.53g。另取粒径为3.0um的大磁珠按上述方法同等制备。大小磁珠通过实验最终选择按照2:3的比例混匀后放入2-8℃条件下保存。

上述发光试剂盒所述发光底物包括激发液(A液)与预激发液(B液)，所述A液制备过程为：取5g氢氧化钠溶解于498.5g的纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。所述B液制备过程为：取3.14g硝酸，1.6g过氧化氢溶于498.6g纯水中，充分溶解混匀后4℃避光保存。

上述发光试剂盒所述双抗夹心法具体操作如下：以0.01M，ph＝7.0的吖啶酯保存液为AE稀释液，稀释比例为2000。以IL6反应缓冲液为偶联单抗双磁珠混悬液的稀释液，将浓度稀释至0.2mg/ml加入反应体系。整个反应为一步法，即依次加入样本，偶联单抗双磁珠混悬液，吖啶酯标记单抗溶液，三者混匀反应18分钟后用强化清洗液洗涤4次，再加入预激发液与激发液激发发光，仪器接受并处理光信号。所述吖啶酯保存液包括0.2M磷酸二氢钠19.5ml、0.2M磷酸氢二钠30.5ml、氯化钠8.77g、吐温-20 1.01g、曲拉通X-100 1.06g、BSA10g、蔗糖50g、0.25M EDTA 4ml及防腐剂1ml。所述MYO反应缓冲液包括1M,Ph＝7.8的HEPLE溶液26.4ml，氯化钠10.56g、AEE44.49g、EKK26.4g、EDTA0.53g、BSA0.0528g及pro9500.53g。所述强化清洗液包括0.2M磷酸二氢钠47.5ml、0.2M磷酸氢二钠202.5ml、氯化钠46g、吐温-20 5.8g、pro300 5.3g。

图七显示目前实际应用条件即小粒径磁珠下测试反应曲线。该曲线线性良好，但整体信号值较低，灵敏度不高；

图八为大粒径磁珠下的测试反应曲线。该曲线低值较图一高，但高值下将。

图九为大小粒径磁珠不同比例作用下IL6化学发光测试反应曲线，其中大小粒径比例为1：1时信号明显比实际应用时的高，显示双粒径联用的可行性。2：1时大粒径占比最高，故在三组中低值最高，但高值较低。2：3时小粒径占比最高，故三组中其高值信号最高，检测上限大幅度增加。

综合考虑下，本次试剂盒选用大小粒径2：3作为实际应用比例，灵敏度升高且检测上限增加。

实验数据：

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。