一种EBV相关胃癌诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种EBV相关胃癌诊断标志物及其应用。

背景技术

EBV(Epstein-Barr virus)是一种人类疱疹病毒，1964年首次由Epstein与Barr团队在伯基特淋巴瘤中发现。EBV在自然人群中的既往感染率超过90％，其感染性强，根据国际癌症研究署对致癌因子的分类标准，EB病毒被列在第一组致癌因子中，与胃癌、鼻咽癌和淋巴瘤的发生发展密切相关，全球范围内每年大约有20万癌症是由EBV感染引起的，14万名患者因此而死亡。EBV相关胃癌(EBVaGC)是胃癌的主要分型之一，约占所有胃癌的10％。与其他胃癌类型相比，EBVaGC的基因组甲基化程度高，且免疫治疗靶点PD1等蛋白高表达，对肿瘤免疫治疗具有良好的响应。因此，检测和确诊EBVaGC有助于胃癌的精准治疗。

EBV相关胃癌的检测仍存在瓶颈。与其他胃癌类型相比，EBVaGC没有特异的临床表现和病理特征，目前EBVaGC的诊断依赖于EBER原位杂交检测，但该方法存在较大不足：EBER是确诊EBV感染的金标准，但该方法需要通过胃镜活检取样，其准确率与医生的操作经验和正确采样有关；且EBV在胃癌组织中呈异质性分布，因此其检测的假阴性率较高。此外，EBER原位杂交技术操作复杂、检测成本较高(300-500元/人次)，不仅增加患者的就医成本，也难以实现普遍筛查。因此，研发简便、准确、经济的EBV检测方法对EBVaGC的诊断至关重要。

发明内容

针对现存的技术问题，本发明的目的是提供一种EBV相关胃癌诊断标志物及其应用，旨在利用蛋白组芯片和噬菌体展示技术全局性筛选EBV胃癌相关蛋白，仅使用血清样本即可鉴定EBVaGC蛋白标志物，为EBVaGC的诊断提供简便、准确、经济的新方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种EBV相关胃癌诊断标志物，所述诊断标志物选自LF2蛋白和BFRF3蛋白中的至少一种。

第二方面，本发明提供了一种诊断标志物在制备诊断EBV相关胃癌的产品中的应用，所述诊断标志物选自LF2蛋白和BFRF3蛋白中的至少一种。

优选地，所述LF2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述BFRF3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述诊断标志物为LF2蛋白和BFRF3蛋白的组合。

优选地，所述LF2蛋白和BFRF3蛋白相关抗体在EBV相关胃癌患者中高表达。

优选地，所述产品为检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测待测样品中抗LF2蛋白和/或BFRF3蛋白的IgG抗体水平的试剂。

优选地，所述抗Omp20蛋白的IgG抗体单位值≥1.5且抗HcpA蛋白的IgG抗体单位值≥1.3时，可初步诊断为EBV相关胃癌患者。

优选地，所述待测样品为全血、血浆、血清中的任一种。

优选地，所述试剂包括标准品、抗原包被液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、显色试剂和洗涤液。

优选地，所述标准品为IgG抗体。

优选地，所述抗原包被液为TBST。

优选地，所述封闭液为含3％ BSA的TBST。

优选地，所述样品稀释液包括蛋白稀释液、血清稀释液；所述蛋白稀释液为含5％甘油的PBS；所述血清稀释液为含10％ BSA的TBST。

优选地，所述终止液为1M H

优选地，所述酶标试剂含有酶标抗体的PBST。

优选地，所述显色试剂为TMB。

优选地，所述洗涤液为PBST。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明首次基于蛋白组芯片和噬菌体展示技术，筛选获得了两个EBV相关胃癌(EBVaGC)的诊断标志物——LF2蛋白和BFRF3蛋白，能够高效准确诊断EBVaGC。尤其这两个蛋白联合诊断的AUC可达0.911，明显优于单独诊断的AUC。

2、本发明在诊断EBVaGC时无需组织样本，仅需血清样本，在进行血常规检查时即可检测。

3、本发明相对现有的诊断手段具备准确性高、局限性小、成本低廉的特点，降低患者就医成本，利于实现人群的普遍筛查，简化了EBVaGC的确诊流程，显著提高治疗效率。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1利用EBV蛋白质组芯片与EBVaGC患者血清反应的结果；其中图1A为EBV阳性胃癌芯片结果，图1B为EBV阴性胃癌芯片结果；

图2为实施例2中采用ROC曲线分析本发明的诊断标志物LF2蛋白单独诊断EBVaGC的AUC结果；

图3为实施例2中采用ROC曲线分析本发明的诊断标志物BFRF3蛋白单独诊断EBVaGC的AUC结果；

图4为实施例2中采用ROC曲线分析本发明的诊断标志物LF2蛋白和BFRF3蛋白联合诊断EBVaGC的AUC结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

EBV感染导致胃癌的发生和相关病例死亡是我省乃至我国需要解决的重大公共卫生问题。其感染的人数多、范围广且存在反复感染的风险，临床防治困难重重：1)现有的诊断方法局限性较大，并未起到指导用药的作用，难以实现个体化精准治疗；2)现有的诊断方法成本较高，操作难度较大，难以实现人群的普遍筛查；3)没有有效疫苗能预防EBV感染。而目前EBVaGC的诊断依赖于主要EBER原位杂交检测，但该方法存在较大不足：1)肠道黏膜活检取材时，病毒在黏膜组织中分布不均，溃疡处病毒负荷显著高于非溃疡黏膜，内镜活检取材与医生的操作经验和正确采样有关，不确定因素较大。2)EBER原位杂交的判读时，对照组织切片染色结果理想，才可对待检组织切片进行判读，当对照组织切片染色不理想时，待检组织切片的结果不可靠。3)EBER原位杂交技术操作复杂、检测成本较高，不仅增加患者的就医成本，也难以实现普遍筛查。其他EB病毒感染检测方法包括PCR和免疫组织化学技术：PCR可定量检测EB病毒DNA，但无法确定感染细胞及其在组织中的定位；免疫组织化学法仅能检测病毒蛋白质表达阶段，对于细胞内EB病毒低拷贝的检测灵敏性差。因而，建立更为特异的EBVaGC检测方法，并据此实现对EBVaGC的精准诊断为治疗方案的改进提供新的思路。

蛋白芯片技术和噬菌体展示技术为此提供了强大的工具。本发明利用的EBV全蛋白芯片技术可用于筛选与血清抗体相互作用的EBV蛋白，且具有全局性、高通量的筛选特点，能在蛋白组学水平上建立血清抗体与EBV蛋白相互作用的网络，为高通量筛选与血清抗体相互作用的靶蛋白提供实验基础。本专利前期已构建出EBV噬菌体展示库，其具有筛选容量大、灵敏度高的特点，利用噬菌体展示技术可以筛选出与血清抗体特异性结合的噬菌体，获得该抗体识别的抗原表位并进一步分析。

具体而言，本发明基于EBV蛋白质组芯片筛选获得了一种EBVaGC诊断标志物LF2和/或BFRF3其作为蛋白指标并应用于EBVaGC的诊断。本发明所述的EBV蛋白质组芯片涵盖EBV蛋白组85种蛋白，芯片组成包括85种EBV蛋白和芯片基片。

85种EBV蛋白为本发明特有资源，采用基因合成和高通量表达纯化方式获得。

基片为光学级环氧基片，购自北京博奥生物芯片有限责任公司。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、血清标志物的筛选

本实施例为了研究EBV相关蛋白与EBV相关胃癌(EBVaGC)的相关性，利用EBV蛋白质组芯片来筛选EBVaGC诊断标志物。具体步骤如下：

(一)胃癌患者样本收集

本项目在福建医科大学附属协和医院、福建医科大学附属第一医院、福建省肿瘤医院建立了胃癌专病队列，收集了近1000人份胃癌血清及组织样本；同时在福建胃癌高发地区长乐建立了胃病专病队列，入组了涵盖不同胃病阶段的1500例患者，组织用于EBER原位杂交明确EBV感染状态，血清用于标志物筛选。

从上述收集的胃癌专病队列中，进一步选择EBV阳性胃癌31例、EBV阴性胃癌33例(共64例胃癌患者)，进行下一步的EBVaGC诊断标志物筛选。

(二)利用蛋白组芯片筛选EBVaGC诊断标志物

1、EBV蛋白质组芯片的制备方法参考申请人前期的专利文献CN115125623A中说明书实施例1中的方法。该EBV蛋白质组芯片中包含表1所示的85个蛋白序列。

表1

2、EBV蛋白质芯片与筛选的64例胃癌患者血清样本相互作用

(1)封闭

在可放置4张芯片的芯片盒中准备30ml封闭液(1％ BSA in PBS buffer，表2所示)。将芯片从-80℃取出至4℃和室温复温(注意：针对PATH基片，不能单独取芯片，否则水气会聚集在芯片表面，影响样本点；要全程密封)。侧摆摇床20-30rpm，室温1h。倒弃封闭液，分别使用1xPBS和0.2xPBS清洗1次，5min/次；然后离心干燥(800rpm,1min)。安装围栏待用。

(2)样本孵育

将血清样本从-80℃取出，置于冰上或4℃融解，待完全融解。然后将血清样本4℃离心，10000rpm，10min，取上清进行样本检测(离心后常见表面附有一层白色物质，可能是脂类，尽量先吸除这些物质，再取清澈的淡黄色的血清；若血清样本珍贵，可直接吸取下层血清，但要注意尽量避免带出白色物质)。用孵育液(1％ BSA in PBST，0.25mg/mL大肠杆菌裂解液)按稀释比例为1：200稀释样本，即血清4ul、孵育液800ul，并加入芯片600ul体积，置于湿盒中，侧摆摇床20-30rpm，室温2h。

(3)清洗

该步骤很关键，因为很容易造成不同block间的样本污染。甩掉血清样本，加入1mLPBST洗涤液(表3所示)，摇床120rpm，洗5min。重复洗3次。拆除夹子后，放到大盒子，加入30mL PBST洗涤液，摇床70rpm，洗5min。重复洗3次。

(4)荧光标记IgG/IgM二抗孵育

提前准备含荧光标记IgG/IgM二抗(Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG；Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Human IgM)的孵育液(按1：1000比例将含荧光标记IgG/IgM二抗与孵育液混合,孵育液为1％BSA in PBST)。孵育液的体积根据芯片数而定。若一张芯片，可用芯片专用孵育盒，按照3mL体积配置；若3-4张，可放置清洗盒，准备15ml体积。侧摆摇床20-30rpm，避光，室温1h。

(5)清洗

将步骤(4)处理后的芯片置于加入有30ml清洗液(PBST)的芯片清洗盒，晃动10-15次，并更换清洗液，再次晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。清洗时避光。完成后用ddH

(6)干燥

将芯片置于芯片干燥机，离心干燥(800rpm,1min)。

(7)扫描

按照扫描仪的操作规范和使用说明操作，设置参数为：635nm，Power 100％，PMTvalue550；532nm，Power 100％，PMT value 550。

(8)数据提取

将对应GAL文件打开，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存GPR文件。

上述过程中所用到的试剂的组成见表2～表4。

表2封闭液(1％BSA in PBS buffer；pH 7.4)

表3洗涤液(PBST溶液；pH 7.4)

表4孵育液

(三)利用差异分析、T检验分析等挑选差异蛋白作为候选标志物。

利用R语言将蛋白质芯片信号进行芯片内和芯片间的归一化后，利用T检验、差异倍数分析、多元线性回归分析挑选候选标志物。

结果显示，利用EBV蛋白质组芯片筛选64例胃癌患者相关样本，芯片与患者血清反应结果如图1所示(图1A为EBV阳性胃癌芯片结果，图1B为EBV阴性胃癌芯片结果)，鉴定了诊断EBV相关胃癌的血清学标志物，其中LF2和BFRF3信号差异排名前2，两个蛋白的结果分析如如表5所示。

表5EBV蛋白质芯片筛选结果分析

实施例2、独立样本验证标志物诊断效力

为进一步验证LF2蛋白和BFRF3蛋白作为EBVaGC标志物的诊断效力，利用上述鉴定的血清学诊断标志物进一步验证345例胃癌样本，其中EBV阳性胃癌18例，EBV阴性胃癌327例。上述样本中，EBV阳性胃癌占总样本数约5％，该比例符合EBV胃癌真实发病率。

具体利用ELISA技术进行验证，步骤如下：

1.蛋白稀释：将LF2蛋白和BFRF3蛋白分别用TBST稀释。稀释倍数如下：

稀释0倍：100ul蛋白

稀释2倍：50ul蛋白+50ul稀释

稀释4倍：25ul蛋白+75ul稀释

稀释8倍：12.5ul蛋白+87.5ul稀释

2.标准品Human IgG(50ug/uL)的稀释：

①取1μL Human IgG，加入499μL蛋白稀释液，吹打混匀，得浓度为0.1ug/ul的标准品母液。

②稀释成50pg/ul：

取四管1.5mlEP管

标准品A的制备：取500ul标准品母液+500ul蛋白稀释液配制，浓度为50ng/ul

标准品B的制备：取100ul标准品A+900ul蛋白稀释液配制，浓度为5ng/ul

标准品C的制备：取100ul标准品B+900ul蛋白稀释液配制，浓度为500pg/μL

标准品D的制备：取100ul标准品C+900ul蛋白稀释液配制，浓度为50pg/μL

上述的蛋白稀释液为：含5％甘油的PBS(42.75mlPBS+2.25ml甘油)

取标准品D，然后按标准品D 100ul、标准品D 100ul+蛋白稀释液100ul、标准品D50ul+蛋白稀释液100ul、标准品D 25ul+蛋白稀释液100ul、标准品D 12.5ul+蛋白稀释液100ul、标准品D 6.25ul+蛋白稀释液100ul、标准品D3.125ul+蛋白稀释液100ul、标准品D1.5625ul+蛋白稀释液100ul依次稀释成8个梯度浓度的各标准品溶液。

3.抗原包被：每孔加入50μL相应的步骤1稀释后的蛋白或步骤2配制的8个梯度浓度的各标准品溶液，4℃静置过夜。

4.洗涤：倒掉孔中的液体，每孔用PBST洗1次，每次洗涤PBST加入量约孔位高度一半(约200ul)及以上即可。拍打干净。

5.封闭：每孔加入100μL的封闭液(3％ BSA in TBST)室温孵育1h。

6.洗涤：倒掉孔中的液体，每孔用PBST洗1次，倒掉孔中的液体，拍打干净。

7.加样：(标准曲线+PBST)

1)血清稀释液的配制如表6所示。

表6血清稀释液(45mL)：

2)血清处理：12000r，4℃，20min。

3)血清稀释：将步骤2)处理后的血清稀释，稀释倍数分别为25倍、50倍、

100倍、200倍。

4)对应的孔加入150ul的稀释后的血清。

稀释计算:每人4孔650ul

稀释25倍：26ul处理后的血清+624ul血清稀释液

稀释50倍：13ul处理后的血清+637ul血清稀释液

稀释100倍：6.5ul处理后的血清+643.5ul血清稀释液

稀释200倍：3.25ul处理后的血清+646.75ul血清稀释液

8.孵育：放入37℃培养箱孵育1.5h。

9.洗涤：倒掉孔中的液体，PBST洗5次，拍打干净。

10.酶标抗体孵育：每孔加入100μL按1:10000稀释于PBST中的酶标抗体(RabbitHRP-Anti Human IgG antibody)，37℃培养箱孵育35min。

11.洗涤：倒掉孔中的液体，每孔加入200μL PBST洗5次，拍打干净。

12.显色：每孔加入显色底物TMB 100μL，37℃避光显色15min(5分钟观察一次)。

13.终止：每孔加入100μL 1M H

14.酶标仪读数：用单通道酶标仪在450nm波长测量每孔的光密度(OD450)。

15.数据处理和分析

结果表明，利用LF2蛋白单指标，诊断AUC为0.873(如图2所示)；BFRF3蛋白单指标，诊断AUC为0.758(如图3所示)；联合LF2和BFRF3蛋白诊断AUC为0.911(如图4所示)。

应用实施例1

基于前述实施例的结果，采用LF2蛋白和BFRF3蛋白作为诊断标志物用于EB相关胃癌的检测与诊断，采用与实施例2相同的步骤进行，所得结果的诊断标准如下：

抗LF2蛋白的IgG抗体(LF2_IgG)的单位值≥1.5且抗BFRF3蛋白的IgG抗体(BFRF3_IgG)的单位值≥1.3：可初步诊断该患者为EB相关胃癌患者

上述应用实施例证明了本发明方法的可行性。

需要说明的是，本发明所述的LF2蛋白,具有如SEQ DI NO.1所示的氨基酸序列。所述的BFRF3蛋白，具有如SEQ DI NO.2所示的氨基酸序列。LF2蛋白和BFRF3蛋白目前均已被报道在鼻咽癌诊断中的应用；在本申请人前期的研究中，如专利文献CN115125623A中说明书实施例2的结果可见，在利用EBV蛋白质组芯片筛选与胃癌病人血清相互作用的蛋白中，LF2蛋白是与健康对照相关的蛋白，且在健康对照中低表达，但尚未阐述LF2在EBV阳性和EBV阴性胃癌中的作用和表达水平。可见LF2蛋白和BFRF3蛋白在EB相关胃癌中的致病过程和筛查意义的机制均尚未明确，也未见有相关报道。因此，本发明是首次发现并验证了这两个蛋白可作为EB相关胃癌的诊断标准物，为EB相关胃癌的前期诊断提供了新的方向。

LF2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1):

MAEAYPGGAHAALASRRSSFRNSLRRLRPTEKPDTSFMRGVWKYEIFPSYVRVTNKQVLQLDAQCQELPPCPSVGQILSFKLPSFSFNTTTYGSRYFTVAFLFFGAEDNEVFLKPFFVMHSDQDIVLSVLNPRSLFIEKGKFTWYIVPIRLVKNPYLYLQILPGQSDIQLTRSCTQSGDKLNTSEPQIFLSGSPVTSQDECLPYLLAQHTPPFLKSYARIHTFPGKVCPVNAIRRGKGYVRVSVDTPDLKREGPLNVKVGMTLLDDVIIAFRYNPYPKSHWRWDGESTDIRYFGSPVIIPPNFITELEYNNTYEAPLSSKITAVVVSHSSNPVFYVYPQEWKPGQTLKLTVRNISNNPITIVTGQSMAQAFFIYAGDPSISTIMRRYIQRQGCALTLPGNIVVESSSLPTFERINKTFNGNIVASEGTL

BFRF3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2):

MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。