一种马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的检测方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的检测方法。

背景技术

聚乙二醇因为其低毒性，无免疫原性和无抗体性的特点，被广泛的应用在了生物医药、化工、材料领域，在聚乙二醇材料的应用中，端基(即聚乙二醇高分子链两端的功能化基团)起着决定性的作用，不同端基的聚乙二醇具有不同的用途。可以与特定的药物结合。如当其与小分子活性成分、多肽、蛋白质药物结合时，其能够有效地改善药物的稳定性、水溶性、存在免疫原性、肾清除速率快等问题，有利于药物的快速吸收和迅速起效，降低了药物在细胞外分解造成的毒性。

马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯(简称为MAL-PEG2-SPA)通常被用于蛋白药物的修饰，其能增强药物分子的水溶性，能使其更好地分散于血液中，避免了药物簇集效应，因而有利于药物的快速吸收和迅速起效，其结构如下：

为了保证马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的使用安全和质量，通常需要对其纯度检测，开发一种能够有效检出马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯有关物质的方法，对于马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯进一步质量控制具有十分重要的意义。

马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯为极性较大的化合物，其在C

在文献(Separation of polyethylene glycols and maleimide-terminatedpolyethylene lycols by reversed-phase liquid chromatography under criticalconditions)中公开了采用HPLC方法分离聚乙二醇和马来酰亚胺端接聚乙二醇，其方法采用了蒸发光散射探测器(ELSD)，色谱柱为C18柱，流动相为乙腈/水＝40：60，流速为0.5mL/min，其分离了聚乙二醇和马来酰亚胺取代聚乙二醇衍生物，并未公开马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的分离方法。

现有技术(Separation and detection ofbis-maleimide-polyethylene glycoland mono-maleimide-polyethylene glycol by reversed-phase high pressure liquidchromatography)中公开了采用反相高压液相色谱法分离和检测双马来酰亚胺聚乙二醇和单马来酰亚胺聚乙二醇，其检测过程中，将Mal-PEG与含有紫外发色团的肽进行衍生，再将衍生后的待测物在反相色谱中进行分离，采用C18色谱柱，360nm的紫外检测，其检测过程中需要衍生才能进行检测，操作不够简便。

现有技术(马来酰亚胺基聚乙二醇单甲醚的合成研究)对马来酰亚胺基聚乙二醇单甲醚(mPEG-MAL)进行RP-HPLC分析，检测波长为215nm，梯度洗脱A:0.05％TFA/H

由上述可知，现有技术鲜有兼顾操作简单，结果准确，稳定性高，精密度好的检测方法，对马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯进行质量控制。

发明内容

为了解决上述背景技术的问题，本发明的具体技术方案如下：

本发明第一方面提供一种马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯(MAL-PEG2-SPA)的检测方法，将马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯溶解，采用液相色谱法进行检测，所述液相色谱法采用以金刚烷为键合相的色谱柱；所述液相色谱法的流动相A相为：三氟乙酸-水，三氟乙酸与水的体积比为(0.1～0.3):100；所述液相色谱法的流动相B相为：三氟乙酸-乙腈，三氟乙酸与乙腈的体积比为(0.1～0.3):100。

本发明采用特定的金刚烷键合相柱，能够更好的分离产品及杂质，马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯属于极性较大的化合物，传统色谱柱在反相模式下很难对强极性化合物进行分析，金刚烷键合相柱的官能团结构虽然与常规色谱柱(比如C

进一步的，所述三氟乙酸与水的体积比包括不限于0.1:100、0.12:100、0.12:100、0.15:100、0.2:100、0.22:100、0.25:100或0.3：100；

和/或，所述三氟乙酸与乙腈的体积比包括不限于：0.1:100、0.12:100、0.12:100、0.15:100、0.2:100、0.22:100、0.25:100或0.3：100。

优选的，流动相A：采用0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相A。

优选的，流动相B：采用0.1％三氟乙酸乙腈作为流动相B。

进一步的，所述金刚烷键合相色谱柱的规格为：4.6×250mm，5μm。

进一步的，所述流动相的流速为：0.2mL/min～1mL/min，

比如，所述流动相的流速可以为0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min和1.0mL/min；

优选为0.5～1.0mL/min；更优选为0.5mL/min。

进一步的，所述色谱柱的柱温为：35～40℃，包括不限于：35℃、36℃、37℃、38℃、39℃和40℃。

优选柱温为40℃。

进一步的，所述液相色谱法的进样量为：1～25μL，包括不限于2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL或25μL。

优选进样量为2～10μL，更优选进样量为5μL。

进一步的，所述液相色谱法采用电化学喷雾检测器(CAD)。

进一步的，本发明采用高低浓度法计算马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的纯度。

本发明的高低浓度法具体为：杂质％＝杂质峰面积/(1％样品峰面积*100+所有杂质峰面积)*100％

主峰纯度＝1-所有杂质的％含量

电雾式检测器对结构相似的物质响应值几乎仅与物质的质量有关，能通过产品峰更好的定量未知杂质及没有对照品的已知杂质。本发明通过金刚烷键合相柱配合特定的色谱条件，能够很好的将马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯与杂质进行分离，在此基础上，配合CAD检测器，更好的定量未知杂质及没有对照品的已知杂质。从而更好的解决马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯纯度检测问题及杂质控制问题，从而更好的解决马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯纯度检测问题及杂质控制问题。

进一步的，所述液相色谱法采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序为：

流动相A和流动相B以体积百分数计，洗脱程序为：

0min，流动相A与流动相B体积比为90:10；

0～2min,流动相A与流动相B体积比按线性渐变为55:45；

2～15min，流动相A与流动相B体积比按线性渐变为45:55；

15～17min，流动相A与流动相B体积比按线性渐变为5:95；

17～19min，流动相A与流动相B体积比为5:95，保持等度洗脱；

19～20min，流动相A与流动相B体积比按照线性渐变为90:10；

20～30min,流动相A与流动相B体积比为90:10，进行等度洗脱。

进一步的，所述溶解采用极性溶剂溶解马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯，所述极性溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和水中的一种或多种的组合；优选的，所述极性溶剂为乙腈。

本发明还提供一种前述的检测方法在马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的质量控制中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明方法能快速便捷的分离并定量测定马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的杂质，从而有效的控制马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的质量，本发明的方法准确性高、特异性强、灵敏度高、重复性好，通过高低浓度计算方法，在线性范围内更准确的检测了产品的纯度。从而更好的解决马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯纯度检测问题及杂质控制问题。

附图说明

图1所示为采用实施例1方法检测的2mg/mLMAL-PEG2-SPA的液相色谱图；

图2所示为实施例1方法检测的空白溶液液相色谱图；

图3所示为实施例1方法的LOQ的液相色谱图；

图4所示为本发明MAL-PEG2-SPA在浓度为0.01mg/mL(0.5％)～0.5mg/mL范围内的线性关系图；

图5所示为对比例1的方法检测的2mg/mLMAL-PEG2-SPA的液相色谱图；

图6所示为对比例2采用C18柱的色谱图；

图7所示为对比例3采用UV检测器的谱图；

图8所示为对比例3采用CAD检测器的谱图；

图9所示为对比例4流速为0.8mL/min的图；

图10所示为对比例4流速为0.5mL/min的图。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

本发明中，术语“固定相”是将在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。

本发明中，术语“流动相”是指色谱过程中携带待测组分向前移动的物质称为流动相。与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。

本发明中，术语“反相模式”是指是分离大多数常规样品的首选分离模式，是指固定相(如C18，C8，C4等)极性比流动相(如水、乙腈等)极性小的一种液相色谱法。

本发明中，术语“HILIC”是指Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography(亲水作用液相色谱)的简称，在HILIC中，固定相是极性的，流动相中的水相部分表现为强洗脱溶剂，对极性大的化合物有很好的保留。

本发明中，术语“MAL-PEG2-SPA”是指“马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯”。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1马来酰亚胺-二聚乙二醇-丙烯酸琥珀酰亚胺酯的检测

1、供试品的配制：称取MAL-PEG2-SPA(北京北京键凯科技股份有限公司，纯度≥95％)样品20mg至10mL容量瓶中，加入乙腈使溶解，充分振摇后，定容至MAL-PEG2-SPA浓度为2mg/mL，作为供试品溶液待用；

2、流动相的配制：流动相A：量取1mL三氟乙酸加入到1000mL纯化水中配制成体积比为0.1％三氟乙酸水溶液；

流动相B：量取1mL三氟乙酸加入到1000mL乙腈中配制成体积比为0.1％三氟乙酸乙腈溶液。

3、仪器方法：

仪器：岛津LC-16高效液相色谱仪

检测器：Thermo Veo检测器，条件为：Range：500pA；filter：10sec；Tem:35℃

色谱柱：金刚烷为键合相(Osaka soda CAPCELL PAKADME-HR 4.6*250mm；5μm)；

流动相A：采用体积比0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相A。

流动相B：采用体积比0.1％三氟乙酸乙腈作为流动相B；

柱温：40℃

流速：0.5mL/min

进样量：5μL

工作站：LC-Solution

梯度洗脱程序见下表：

表1实施例1的洗脱程序

色谱图见图1，从图1中可以看出，本发明实施例1的方法峰型良好，能够有效的分离MAL-PEG2-SPA及其杂质。

对比例1洗脱条件的优化

供试品同实施例1

流动相的配制同实施例1

仪器方法如下：

仪器：岛津LC-16高效液相色谱仪

检测器：Thermo Veo检测器，条件为：Range：500pA；filter：10sec；Tem:35℃

色谱柱：金刚烷为键合相(Osaka soda CAPCELL PAKADME-HR 4.6*250mm；5μm)；

流动相A：采用体积分数为0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相A。

流动相B：采用体积分数为0.1％三氟乙酸乙腈作为流动相B；

柱温：40℃

流速：1.0mL/min

进样量：5μL

工作站：LC-Solution

梯度洗脱程序见下表：

表2对比例1的梯度洗脱程序

图5所示为对比例1的方法检测的MAL-PEG2-SPA及其杂质，从图5可以看出，主峰附件，在保留时间8.25min～8.5min附近出现杂峰，干扰准确定量，而图1的主峰附近没有杂峰，说明本发明的洗脱条件分离效果好，而其他洗脱条件无法达到好的分离效果。

对比例2色谱柱的优化

供试品、流动相、检测条件同对比例1，区别仅在于使用C18色谱柱(4.6*250mm；5μm)。

色谱图如图6所示，从图中可以看出，在保留时间为9.5～11min范围内，主峰与杂质峰有重叠，影响定量，图6说明了采用C18色谱柱的分离效果差于本发明的色谱柱，本发明的色谱柱能够更好的分离。

对比例3检测器的选择

供试品、流动相、检测条件同对比例1，区别仅在于使用的检测器不同，图7和图8所示为分别采用UV检测器和CAD检测器的谱图：

图7的主峰的响应在-135MV，图8的响应在730mv，图8响应明显高于图7，说明采用CAD检测器定量更方便。

对比例4流速的优化

供试品、流动相、检测条件同对比例1，区别仅在于，流速不同。

当流速为0.8mL/min时，色谱图如图9所示，图9的主峰的出峰时间为10.75～11.25min，当流速为0.5mL/min时，色谱图如图10所示，图10的出峰时间为16.5～17.2min，图5是对比例1的谱图，流速为1mL/min，图5的出峰时间为9～9.5min，通过将图5、9、10进行比较发现，流速为0.5mL/min主峰的出峰时间最合适，适合定量。

实施例2方法验证

(1)溶液配制：

空白溶液：乙腈，HPLC级别。

对照品储备液的制备：精密称定20mg的MAL-PEG2-SPA待测品，置于10mL容量瓶中，加入乙腈溶解，再加入乙腈定容至刻度，摇匀，得到2mg/mL储备液。

线性对照品溶液：

分别准确移取2mg/mL对照品储备液

1.对照品溶液1(约0.5mg/mL)

精密量取2.5mL前述2mg/mL的对照品储备液，置于10mL量瓶中，加入乙腈定容至刻度，摇匀。

2.对照品溶液2(约0.2mg/mL)

精密量取1mL前述2mg/mL的对照品储备液，置于10mL量瓶中，加入稀释剂定容至刻度，摇匀。

3.对照品溶液3(约0.1mg/mL)

精密量取0.5mL前述2mg/mL的对照品储备液，置于10mL量瓶中，加入稀释剂定容至刻度，摇匀。

4.对照品溶液4(约0.05mg/mL)

精密量取5mL前述2mg/mL的对照品储备液，置于10mL量瓶中，加入稀释剂定容至刻度，摇匀。

5.对照品溶液4(约0.02mg/mL)

精密量取2mL前述2mg/mL的对照品储备液，置于10mL量瓶中，加入稀释剂定容至刻度，摇匀。

6.对照品溶液5(约0.01mg/mL)

精密量取1mL前述2mg/mL的对照品储备液，置于10mL量瓶中，加入稀释剂定容至刻度，摇匀。

定量限(LOQ)溶液：上述0.01mg/mL即为定量限(LOQ)溶液。

(2)标准曲线的建立

将上述各浓度的线性溶液对照品按上述色谱条件进行检测，以浓度X(mg/mL)为横坐标,相应峰面积Y为纵坐标,进行线性回归,结果和线性方程如表2和图4所示，MAL-PEG2-SPA在0.01mg/mL(0.5％)～0.5mg/mL范围内，其线性方程的R

表3线性结果

(3)样品检测

精密称取待测样品(MAL-PEG2-SPA样品，纯度未知)，采用实施例1中方法，记录30分钟色谱图，按照高低浓度法计算供试品纯度。

结果如表4所示：

表4样品检测结果：

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。