一种检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒及其应用。

背景技术

CD161，又称自然杀伤细胞受体（NKR-P1A），由位于12号染色体上的自然杀伤细胞复合体中的基因KLRB1编码，是一种II型跨膜糖蛋白，具有C型凝集素超家族的特征性质。两种晶体结构中的CD161都遵循C型凝集素样（CTL）结构域的一般折叠特征：两个α-螺旋和两个在核心内具有保守疏水WIGL基序的反平行折叠，分子内还有稳定结构域的二硫键。CD161也被认为是一种共刺激分子，可以抑制NK细胞的细胞毒作用，但在T细胞中起到激活作用，促进T细胞增殖和细胞因子的分泌。与配体LLT1结合后可以激活下游信号通路，发挥抑制作用，与肿瘤中免疫逃逸等过程相关。CD161在肿瘤、自身免疫病和感染性疾病的发生发展中都具有重要的生物学意义，与患者的预后密切相关。目前尚无可溶性CD161的相关研究，因为还没有检测可溶性CD161的相关试剂盒可供使用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒；

本发明的目的之二在于提供如上限定的检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒的用途，其用途主要在于检测免疫性疾病患者中可溶性CD161蛋白含量；

本发明的目的之三在于提供如上限定的检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒在免疫性疾病诊断中的应用。

为了实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：

一种检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括CD161-14G12和CD161-5G6两种抗人CD161单克隆抗体，其中：所述单克隆抗体CD161-14G12用作包被抗体，所述单克隆抗体CD161-5G6用作检测抗体，

所述CD161-14G12单克隆抗体，包括重链和轻链，所述CD161-14G12的重链可变区（mVH）的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：

EVQLQQSGPELVKPGTSLKVSCKTSGYSFTDYNIYWVKQSHGESLEWIGFIDPDNGVNRYNQKFKDKATLTVDKSSSTAFMHLSSLTSEDSAVYYCARWGDGYLNIHGMDYWGPGTSVTVSS；

所述CD161-14G12的轻链可变区（mVL）的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：

DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSRSPLTFGAGTKLEIK；

所述CD161-5G6单克隆抗体，包括重链和轻链，所述CD161-5G6的重链可变区（mVH）的氨基酸序列与SEQ ID NO.3相同，具体如下：

EVMLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIDYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGGHWFAYWGQGTLVTVSA；

所述CD161-5G6的轻链可变区（mVL）的氨基酸序列与SEQ ID NO.4相同，具体如下：

DIVLSQSPVIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYHCFQGSGYPLTFGAGTKLELK。

为了实现本发明的目的之二，所采用的技术方案是：

一种检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒的用途，其中，所述用途为用于检测免疫性疾病患者可溶性CD161蛋白含量。

为了实现本发明的目的之三，所采用的技术方案是：

一种检测可溶性CD161蛋白含量的酶联免疫检测试剂盒，其中，所述试剂盒用于人血清、血浆或组织液内检测可溶性CD161含量。

上述试剂盒在肺结核、类风湿性关节炎或系统性硬化症的辅助诊断中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明的酶联免疫试剂盒能够有效检测可溶性CD161含量。利用该试剂盒检测发现，健康人血浆中含有一定基础水平的可溶性CD161蛋白（~743.85 pg/ml），肺结核、系统性硬化症患者血浆可溶性CD161含量明显升高，说明免疫性疾病患者体液中可溶性CD161含量检测具有临床价值。

附图说明

图1 为本发明的酶联免疫检测试剂盒标准曲线示意图；

图2 为本发明的酶联免疫检测试剂盒特异性考察示意图；

图3可溶性CD161蛋白在肺结核患者外周血血浆中的表达水平分析示意图；

图4 可溶性CD161蛋白在类风湿性关节炎患者外周血血浆中的表达水平及临床相关性分析示意图；

图5可溶性CD161蛋白在系统性硬化症患者外周血血浆中的表达水平及临床相关性分析示意图。

具体实施方式

以下结合具体实例及附图对本发明作进一步描述。应理解，以下实施例仅适用于说明本发明而非限定本发明的范围。

实施例1 ：

抗人CD161单克隆抗体轻重链可变区序列的测定：

测定抗人CD161单克隆抗体重链和轻链可变区的方法包括以下步骤：

1.1杂交瘤细胞cDNA的获取

从分泌抗人CD161单抗的杂交瘤细胞株中提取mRNA，酶促逆转录合成cDNA，通过分子克隆、PCR测序获得抗体重链可变区（mVH）和轻链可变区（mVL）的序列信息。

1.2 分别将重链可变区（mVH）和轻链可变区（mVL）与pJET cloning vector克隆载体连接。随后，将连接的产物转化至DH5a感受态细菌后，将转化后的菌液均匀涂布于LB固体培养基上。

1.3 挑选LB固体培养基上边缘清晰、生长良好的菌落进行测序鉴定。

1.4 根据测序结果保留候选的轻重链可变区序列，再次通过PCR克隆出可与表达载体连接的轻链和重链的可变区序列，并将可变区序列与表达载体连接，随后将连接产物转化至DH5a。将转化菌液均匀涂布LB固体培养基，培养过夜。

1.5挑选生长良好的细菌测序，并对比两次测序结果从而得到具有正确的序列的转化细菌，通过扩大培养后进行质粒抽提。

1.6 将连有单克隆抗体重链和轻链可变区基因的表达载体一起共同转染真核表达细胞293。

1.7 293细胞用无血清培养基SFM4Transfx-293 without L-Glutamine悬浮培养，在转染时培养基替换为无血清培养基Gibco®FreeStyle™293 Expression Medium。

1.8 利用ELISA试剂盒检测含有目的抗体的上清液，结果显示良好。

通过上述方法来获得抗人CD161-14G12单克隆抗体重链可变区：

EVQLQQSGPELVKPGTSLKVSCKTSGYSFTDYNIYWVKQSHGESLEWIGFIDPDNGVNRYNQKFKDKATLTVDKSSSTAFMHLSSLTSEDSAVYYCARWGDGYLNIHGMDYWGPGTSVTVSS；

CD161-14G12抗体轻链可变区：

DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSRSPLTFGAGTKLEIK；

CD161-5G6抗体重链可变区：

EVMLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIDYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGGHWFAYWGQGTLVTVSA；

CD161-5G6抗体轻链可变区：

DIVLSQSPVIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYHCFQGSGYPLTFGAGTKLELK。

本发明从分泌抗人CD161单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取到抗体的重链和轻链的可变区，根据测序结果保留候选的轻重链可变区序列，并通过PCR扩增出与表达载体匹配的轻重链可变区序列，连接PCR产物与双酶切预处理的表达载体。将连有目的单抗轻链和重链可变区的表达载体共同转染真核表达细胞株293，收取培养后的上清含有目的抗体，说明得到的重链和轻链可变区序列是正确的。

实施例2

一种检测可溶性CD161蛋白（sCD161）含量的ELISA试剂盒：

2.1试剂盒的组成

本发明的ELISA试剂盒包括包被于酶标板上的实施案例1中的CD161包被抗体（CD161-14G12）、经HRP标记的CD161检测抗体（CD161-5G6-HRP）、可溶性CD161蛋白标准品（上海百英生物科技公司）、样本稀释液、洗涤液（PBST）、显色液（TMB）及终止液组成。

2.2 样本的采集及处理

2.2.1收集一批医院肺结核患者、类风湿关节炎患者和系统性硬化症患者的血浆，分装后-80℃冰箱保存，并避免反复冻融。

2.2.2 血浆样本检测前，提前将样本常温平衡半小时，并震荡混匀，取适量病人血浆样本用稀释液稀释进行5倍稀释。

2.3 可溶性CD161蛋白含量的测定方法

2.3.1 使用包被液（Na2CO3和NaHCO3）稀释包被抗体CD161-14G12 (1µg/ml) ，随后将包被抗体加入96孔酶标板（100µl/孔），4℃孵育过夜。

2.3.2第二天，用洗涤液（PBST）洗板3次，随后每孔加入3%牛血清封闭液100µl，37℃封闭1h。

2.3.3 去除封闭液，加入100µl稀释好的待测血浆样品以及梯度稀释好的可溶性CD161蛋白标准品（从1 ng/ml开始倍比稀释，共设8个浓度，（1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0ng/ml），每个梯度做3个重复，37℃恒温箱孵育2h。

2.3.4 PBST洗液洗板三次，按1：2000比例加入HRP标记的检测抗体CD161-5G6（100µl/孔），37℃恒温箱孵育1h。

2.3.5 PBST洗液洗板六次，加入显色液TMB（100µl/孔），室温避光孵育10min，之后加入终止液（50µl/孔）终止颜色反应，通过酶标仪测定每孔的OD450值。

2.3.6 以CD161标准品浓度乘以样品稀释倍数（×5）的值为纵坐标，以相应测得的OD450值为横坐标制作标准曲线（如图1），并得到计算公式，根据待测样品的OD450值计算出样品中可溶性CD161的含量。

本发明试剂盒按照方法学鉴定，可达到以下指标：

曲线方程：y = -3.498x

标准曲线线性：R

2.4准确性考察：

1）板内准确性分析：在同一次实验中，将五个已知浓度的样本（500、250、125、62.5、31.25pg/mL）分别设置10个复孔，进行sCD161检测，分析该试剂盒的准确性。

2）板间准确性分析：在不同批次实验中，将五个已知浓度的样本（500、250、125、62.5、31.25pg/mL）分别设置10个复孔，进行sCD161检测，分析该试剂盒的准确性。

3）结果与讨论：

变异系数CV<10%，证实该检测方法具有良好的准确性。

2.5特异性考察

将CD4Ig、CD8Ig、CD25Ig和CD161 Ig连续倍比稀释成不同的浓度。抗人CD161单抗（14G12）用碳酸盐缓冲液（0.01M CBS，pH9.3）调整为5µg /ml包被ELISA检测板，4℃过夜。PBS（含0.1% Tween 20）洗涤3次，3% BSA室温封闭1h。PBS洗涤3次后加入上述稀释好的商品化蛋白，室温反应2h，PBS洗涤3次。然后，加入HRP标记的单抗HRP-5G6（1:2000，100µl/孔），室温继续反应1h，PBST洗涤6次后，再加入HRP反应底物TMB（100µl/孔），室温反应10~15min，用2mol/L H

实施例3

可溶性CD161在肺结核患者外周血血浆中的表达及意义

收集正常健康人及肺结核患者（TB）外周血血浆，其中包括健康对照组（HC）55例，TB患者76例，其中TB患者测量初治血浆数值（初诊，未接受标准个体化治疗）。ELISA法检测外周血血浆中sCD161的表达。比较TB患者血浆sCD161表达水平改变，分析sCD161对于诊断TB的潜在临床意义。如图3所示，TB患者外周血血浆中的sCD161表达显著高于健康对照组（P<0.05）。鉴此，使用本发明的可溶性CD161 ELISA试剂盒在TB的诊断和预后判断中具有应用价值。

实施例4

可溶性CD161在类风湿性关节炎患者外周血血浆中的表达及意义

收集健康对照组（HC）外周血血浆20例、类风湿性关节炎（RA）患者外周血血浆16例。ELISA法检测外周血血浆中sCD161的表达，并进行相关实验室诊断指标相关性分析。如图4所示，RA患者外周血血浆中的sCD161表达水平高于健康对照组，但无统计学差异（P=0.08）。鉴此，使用本发明的可溶性CD161 ELISA试剂盒在RA的诊断和预后判断中可能具有一定的应用价值。

实施例5

可溶性CD161在系统性硬化症患者外周血血浆中的表达及意义

收集正常健康人外周血浆20例及系统性硬化症（SS）患者外周血血浆20例。ELISA法检测外周血血浆中sCD161的表达，并进行相关实验室诊断指标相关性分析。如图5所示，SS患者外周血血浆中的sCD161表达显著高于健康对照组（P<0.005），提示本发明的可溶性CD161 ELISA试剂盒在SS的诊断中具有应用价值。