检测外周血单核细胞亚群的抗体组合、试剂盒及系统

技术领域

本发明属于免疫学检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测外周血单核细胞亚群的抗体组合、试剂盒及系统。

背景技术

慢性粒单核细胞白血病(CMML)是一种克隆性造血恶性肿瘤，以兼有骨髓增殖性肿瘤(MPN)和骨髓增生异常综合征(MDS)的表现，常见于老年患者，发病率约4/10万，报道的CMML病人生存期从1个月至>100个月，多数报道中位生存期是20～40个月，约15～30％病例进展可为AML，早期的识别及精准的诊断对于患者的精准治疗及预后有重要的作用。

外周血单核细胞增多是CMML突出特点，2016版WHO中定义其诊断标准中第一个先决条件标准就是外周血单核细胞持续增多：绝对值≥1×10

在《慢性粒-单核细胞白血病诊断与治疗中国指南(2021年版)》中将外周血单核细胞亚群分析纳入辅助诊断标准中，并指出利用经典型(MO1)单核细胞百分比＞94％的临界值，识别CMML病例的敏感性＞90％，特异性＞95％，MO3单核细胞减少甚至与循环的MO1细胞增多具有同等诊断价值。

在最新的2022版WHO中的CMML的诊断标准将外周血单核细胞的要求变更为：绝对值≥0.5×10

但目前国际指南中只有关于外周血单核细胞免疫表型的界定，并没有明确指出怎么圈出总单核细胞，以及使用哪些具体抗体组合来确定免疫表型。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种检测外周血单核细胞亚群的抗体组合、试剂盒及系统，使用本发明的抗体组合检测外周血单核细胞，可以准确分型，灵敏度高、特异性强，且简单方便。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种检测外周血单核细胞亚群的抗体组合，所述抗体组合包括：CD36抗体、CD64抗体、CD14抗体、CD16抗体和CD45抗体。

本发明的第二方面，提供了上述检测外周血单核细胞亚群的抗体组合在制备辅助诊断慢性粒单核细胞白血病的试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供了一种检测外周血单核细胞亚群的试剂盒，包括上述检测外周血单核细胞亚群的抗体组合。

本发明的第四方面，提供了一种检测外周血单核细胞亚群的系统，包括：对待测外周血单核细胞进行流式细胞术检测的检测模块，获取流式细胞术检测结果的数据获取模块，以及对获取的流式细胞术检测结果进行分析的数据分析模块。

本发明的第五方面，提供了一种检测外周血单核细胞亚群的方法，包括以下步骤：利用上述抗体组合和系统，检测待测外周血的单细胞悬液，依次分析抗体对CD45-SSC、CD36-CD64、CD14-CD64和CD16-CD14的表达情况及三种单核细胞亚型的比例，得到待测外周血的抗体表达模式；再与正常对照人群的抗体表达模式进行比对。

本发明具有以下有益效果：

在本发明中，发明人基于对慢性粒-单核细胞白血病外周血单核细胞的研究经验，筛选出CD36抗体、CD64抗体、CD14抗体、CD16抗体和CD45抗体作为抗体组合来检测外周血单核细胞，该抗体组合可以识别目的单核细胞群，且通过对目的单核细胞群依次进行CD36-CD64，CD14-CD64，CD16-CD14荧光抗体表达情况分析，可以快速获得经典型单核(MO1)、中间型单核(MO2)、非经典型单核(MO3)这三个亚群的百分比，从而可以根据免疫表型及三个亚群的百分比，判定为免疫表型正常的单核细胞群还是可疑肿瘤性单核细胞。本发明合理应用各项抗体指标，涵盖范围广，采用该抗体组合通过多参数流式检测技术，可快速简便、快速(从样本接收到出检验结果，只需1～2小时)、高灵敏度地检出单核细胞亚群(本发明以1例临床正常样本和1例临床异常样本为例，验证了采用本发明的抗体组合检测外周血单核细胞，与临床检测结果相符)，可以助力临床上慢性粒单核细胞白血病(CMML)的精准诊断。此外，本发明固定了分析模板，拖入数据可直接分析，操作简单，降低了对分析人员专业知识水平的要求，弥补了现有检测技术的局限性。

附图说明

图1为本发明实施例3中待测临床正常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD45-SSC表达散点图。

图2为本发明实施例3中待测临床正常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD36-CD64表达散点图。

图3为本发明实施例3中待测临床正常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD14-CD64表达情况。

图4为本发明实施例3中待测临床正常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD16-CD14表达情况。

图5为本发明实施例3中待测临床异常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD45-SSC表达散点图。

图6为本发明实施例3中待测临床异常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD36-CD64表达散点图。

图7为本发明实施例3中待测临床异常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD14-CD64表达情况。

图8为本发明实施例3中待测临床异常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD16-CD14表达情况。

图9为本发明对比例1中待测临床正常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD45-SSC表达散点图。

图10为本发明对比例1中待测临床正常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD16-CD14表达情况。

图11为本发明对比例1中待测临床异常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD45-SSC表达散点图。

图12为本发明对比例1中待测临床异常样本的单核细胞亚群的免疫表型CD16-CD14表达情况。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

在本发明中，针对现有技术的不足，提供了一种检测外周血单核细胞亚群的抗体组合、试剂盒及系统。发明人经过大量的实验后发现，选择CD36抗体、CD64抗体、CD14抗体、CD16抗体和CD45抗体的组合，对外周血单核细胞进行检测，即可快速、简便、准确地检出经典型单核(MO1)、中间型单核(MO2)、非经典型单核(MO3)这三个亚群的百分比，助力临床CMML的精准诊断。在检测过程中，首先使用CD45-SSC(侧向散射光)进行设门(CD45为白细胞共同抗原，故将CD45作为设门抗体，正常血细胞的CD45的表达强度大小为：淋巴细胞>单核细胞>粒细胞，SSC作为侧向散射光，与细胞的颗粒度有关，侧向散射光的正常表达强度为：粒细胞>单核细胞>淋巴细胞，结合CD45和SSC的表达特点，可划出淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的分区，其中淋巴细胞处于CD45最强而SSC最低的位置，粒细胞CD45弱于单核细胞而SSC信号最高)，根据表达情况将细胞群分为粒细胞群、单核细胞群、淋巴细胞群，再依次分析目的细胞(即单核细胞群)中抗体对CD36-CD64、CD14-CD64和CD16-CD14的荧光表达强度及比例(通过骨架抗体CD36、CD64可识别出总的单核细胞群，圈出CD36+CD64+表达的单核细胞；再看CD16和CD14的表达确定亚群的占比，表型为CD14+/CD16-的单核细胞为经典型单核细胞(MO1)、表型为CD14+/CD16+单核细胞为中间型单核(MO2)、表型为CD14dim/CD16+的单核细胞为非经典型单核(MO3))，显示三个亚群占总的单核细胞的百分比；最后根据预定的分析逻辑及判断标准进行结果判定——如待测细胞抗体表达模式及百分比落入所述正常对照人群抗体表达模式模板中，则将待测细胞判定为正常的单核细胞亚群；如待测细胞抗体表达模式及百分比未落入所述正常对照人群抗体表达模式模板中，则将待测细胞判定为疑似肿瘤细胞群。

在本发明的其中的一些实施例中，公开了一种检测外周血单核细胞亚群的抗体组合，包括：CD36抗体、CD64抗体、CD14抗体、CD16抗体和CD45抗体。

在其中一些实施例中，所述抗体组合的抗体为单克隆抗体。

在其中一些实施例中，所述单克隆抗体为荧光素标记的抗体，从而可以在十色及以上流式细胞仪中同时检测上述指标，具有一定的便捷性；所述荧光素选自：FITC、PE、ECD、APC和KO。

在其中一些实施例中，所述CD36抗体标记荧光素FITC；所述CD64抗体标记荧光素PE；所述CD14抗体标记荧光素ECD；所述CD16抗体标记荧光素APC；所述CD45抗体标记荧光素KO。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测外周血单核细胞亚群的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测外周血单核细胞亚群的抗体组合。

在本发明的另一些实施例中，公开了上述检测外周血单核细胞亚群的抗体组合在制备辅助诊断慢性粒单核细胞白血病(CMML)的试剂盒中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测外周血单核细胞亚群的系统，包括：对待测外周血单核细胞进行流式细胞术检测的检测模块，获取流式细胞术检测结果的数据获取模块，对获取的流式细胞术检测结果进行分析的数据分析模块。

在其中一些实施例中，所述检测模板包括单细胞悬液模块(用以制备单细胞悬液)、孵育模块(用以将单细胞悬液与抗体组合进行避光孵育进行抗原抗体反应)、重悬模块(用以向经孵育的细胞中加入溶血素、离心、洗涤后重悬细胞制备悬液)和测定模块(用以对重悬后的悬液进行流式细胞术测定)。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测外周血单核细胞亚群的方法，包括以下步骤：利用上述抗体组合和系统检测待测外周血的单细胞悬液，依次分析抗体对CD45-SSC、CD36-CD64、CD14-CD64和CD16-CD14的表达情况及三种单核细胞亚型的比例，得到待测外周血的抗体表达模式；再与正常对照人群的抗体表达模式模板进行比对。

在其中一些实施例中，所述正常对照人群抗体表达模式模板通过以下方法建立：获取正常对照人群细胞群的流式细胞术检测结果数据，通过设门将有核细胞分群，圈出目的细胞群(即单核细胞)，再分析MO1、MO2、MO3三个亚群的占比。

在其中一些实施例中，所述待测外周血细胞抗体表达模式通过以下方法建立：获取待测外周血细胞的流式细胞术检测结果数据，按照正常对照人群抗体表达模式模板中的方式设门将有核细胞分群，圈出目的细胞群(即单核细胞)，再按照正常对照人群抗体表达模式模板中的方式分析所述目标细胞群中MO1、MO2、MO3三个亚群的占比。

本实施例的检测外周血单核细胞亚群的系统，其技术过程参考流式细胞术常规技术即可，所用设备和耗材选用流式细胞分析的设备和耗材，如流式专用管、震荡器、移液器等耗材。以下实施例中所用部分抗体的具体来源为：CD36FITC(货号IM0766U，BeckmanCoulter)、CD64 PE(货号IM3601U，BeckmanCoulter)、CD14 ECD(货号B92391，BeckmanCoulter)、CD16 APC(货号360706，BeckmanCoulter)、CD45 KO(货号B36294，biolegend)。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1检测外周血单核细胞亚群的抗体组合

本实施例提供了一种检测外周血单核细胞亚群的抗体组合，包括CD36抗体、CD64抗体、CD14抗体、CD16抗体和CD45抗体；上述抗体中相关单克隆抗体的荧光标记和用量如表1所示。

表1

注：将市售购得的上述抗体进行浓度梯度验证，确定最佳用量，从而取上述用量的单克隆抗体装于编号1的流式专用管中。

实施例2检测外周血单核细胞亚群的系统及方法

本实施例提供了一种快速检测外周血单核细胞亚群的系统，包括：

1、检测模块

对待测细胞进行流式细胞术检测，包括：

(1)、单细胞悬液模块，用以制备单细胞悬液；

(2)、孵育模块，用以将单细胞悬液与实施例1的抗体组合进行避光孵育进行抗原抗体反应；

(3)、重悬模块，用以向经孵育的细胞中加入溶血素、离心、洗涤后重悬细胞制备悬液；

(4)、测定模块，用以对重悬后的悬液进行流式细胞术测定；

2、数据获取模块

获取待测细胞的流式细胞术检测结果的数据；可以直接获取经典型单核(MO1,表型定义为CD14+/CD16-)、中间型单核(MO2，表型定义为CD14+/CD16+)、非经典型单核(MO3，表型定义为CD14dim/CD16+)这三个亚群占总的单核细胞的百分比。

3、数据分析模块

对获取的数据进行分析，根据预定的分析逻辑及判断标准，判定待测细胞是否为可疑肿瘤性单核细胞——如待测细胞抗体表达模式及百分比落入正常对照人群抗体表达模式模板中，则待测细胞判定为正常的单核细胞亚群；如待测细胞抗体表达模式及百分比未落入正常对照人群抗体表达模式模板中，则待测细胞判定为疑似肿瘤细胞群。

本实施例还提供了一种快速检测外周血单核细胞亚群的方法，采用上述系统，对外周血单核细胞亚群进行检测的具体工作流程如下：

1、配制实施例1的抗体组合中各抗体，如表1所示。

2、样本处理

将待测样本(外周血)的细胞数调整至1×10

3、样品检测

(1)、取流式管，标记1，加入实施例1中的一组抗体，加入量为22.5μl(表1)，然后加入步骤2中的单细胞悬液100μl，涡旋震荡混匀，室温避光孵育15min。

(2)、向孵育后的流式管1中加入400μl Bc溶血素，涡旋震荡，静置，待溶血透亮。溶血透亮后，流式管1以1500r/min离心5min，弃上清，加入2ml小牛血清，涡旋震荡，1500r/min离心5min，弃上清。加入400μl 1％多聚甲醛重悬。

(3)、用BeckmanCoulterNavios十色流式细胞仪对流式管1进行检测，获取CD36+CD64+的单核细胞数≥5000个，分析其免疫表型及比例。

4、数据分析

(1)、建立健康人抗体表达模式模板

根据40例正常对照人群细胞群的流式细胞术检测结果数据，通过设门将细胞分群，优选使用CD45-SSC(侧向散射光)设门，圈出目的细胞群，再对此细胞群进行分析各荧光抗体表达情况及三种单核细胞亚型的比例，依次选择以下抗体对：CD45-SSC，CD36-CD64，CD14-CD64，CD16-CD14。

(2)、建立待测细胞抗体表达模式

获取待测细胞的流式细胞术检测结果数据，按照上述正常对照人群抗体表达模式中的方式设门将细胞分群，圈出目的细胞群，再按照正常对照人群抗体表达模式中的方式分析所述目标细胞群中各荧光抗体表达情况，得到待测细胞抗体表达模式。

(3)、分析待测细胞抗体表达模式

如待测细胞抗体表达模式落入正常对照人群抗体表达模式模板中，则将待测细胞判定为免疫表型正常的单核细胞群；

如待测细胞抗体表达模式未落入正常对照人群抗体表达模式模板中，则将待测细胞判定为可疑肿瘤性单核细胞。

实施例3本发明检测方法的检测结果与临床诊断结果的一致性验证

采用实施例2的检测方法，检测两例待测细胞(1例临床正常样本+1例临床异常样本)的单核细胞，进行抗体表达模式及亚群分析，以验证本发明检测方法与临床结果是否一致。

一、正常样本

该样本为体检正常且血常规单核细胞含量正常的临床样本，按以下步骤进行抗体表达模式分析：

1、获取该待测样本的流式细胞术检测结果数据。使用CD45-SSC(侧向散射光)设门，根据CD45-SSC的表达情况，将细胞群分为3个区域(如图1所示)，分别为粒细胞(图1的中间上部区域)、单核细胞(图1的右侧上部区域)、淋巴细胞(图1的右侧下部区域)3个区域，单核细胞区域为目的细胞群，以下将对这群细胞进行免疫表型分析。

2、所有有核细胞的CD36-CD64免疫表型散点图如图2所示，从图中可见CD36+CD64+单核细胞为7.97％，比例正常，获取单核细胞个数为10094，细胞数满足要求(≥5000个)。

3、所有有核细胞的CD14-CD64表达情况散点图如图3所示，从图中可见CD36+CD64+单核细胞CD14均为阳性，均为成熟单核细胞。

4、单核细胞群的CD16-CD14表达情况散点图如图4所示，根据CD16和CD14的表达情况，分为三个亚群，可见经典型单核(MO1,表型定义为CD14+/CD16-)占单核细胞的90.24％、中间型单核(MO2，表型定义为CD14+/CD16+)占单核细胞的7.61％、非经典型单核(MO3，表型定义为CD14dim/CD16+)占单核细胞的0.54％。

因此，该例待测样本的单核细胞亚群的细胞群落在正常对照人群抗体表达模式模板中，且经典型单核(MO1)＜94％，提示患者为非慢性粒单核细胞白血病(非CMML)，与临床诊断结果相符。

二、异常样本

该样本为临床已经确诊CMML患者的外周血标本。按以下步骤进行抗体表达模式分析：

1、获取该待测样本的流式细胞术检测结果数据。使用CD45-SSC(侧向散射光)设门，根据CD45-SSC的表达情况，将细胞群分为3个区域，如图5所示，分别为粒细胞(图5的中间上部区域)、单核细胞(图5的右侧上部区域)、淋巴细胞(图5的右侧下部区域)，单核细胞区域为目的细胞群，以下将对这群细胞进行免疫表型分析。

2、所有有核细胞的CD36-CD64免疫表型散点图如图6所示，从图中可见CD36+CD64+的单核细胞为15.84％，比例升高，获取单核细胞个数为15772，细胞数满足要求(≥5000个)。

3、所有有核细胞的CD14-CD64表达情况散点图如图7所示，从图中可见CD36+CD64+单核细胞CD14均为阳性，均为成熟单核细胞。

4、单核细胞群的CD16-CD14表达情况散点图如图8所示，根据CD16和CD14的表达情况，分为三个亚群，可见经典型单核(MO1,表型定义为CD14+/CD16-)占单核细胞的98.39％、中间型单核(MO2，表型定义为CD14+/CD16+)占单核细胞的0.48％、非经典型单核(MO3，表型定义为CD14dim/CD16+)占单核细胞的0.21％。

以上免疫表型均提示该待测样本的细胞群不在正常对照人群抗体表达模式模板中，且经典型单核(MO1)比例为98.39％，＞94％，提示患者为慢性粒单核细胞白血病(CMML)，与临床诊断结果相符。

因此，综合以上的结果，采用本发明的检测方法对临床样本进行检测，获得的检测结果与临床结果具有一致性，本发明的抗体组合及检测方法对CMML的诊断，具有非常好的价值。

对比例使用其他抗体组合检测待测细胞的单核细胞

采用实施例2的检测方法，检测实施例3的两例待测细胞的单核细胞，进行抗体表达模式及亚群分析，不同的是使用的抗体组合不相同。

一、正常样本

该样本为体检正常且血常规单核细胞含量正常的临床样本(同实施例3)，使用抗体组合为CD64-PE、CD14-ECD、CD16-APC、CD45-KO，对获取数据按以下步骤进行抗体表达模式分析：

1、获取该待测样本的流式细胞术检测结果数据。使用CD45-SSC(侧向散射光)设门，根据CD45-SSC的表达情况，圈出目标细胞群：总单核细胞(图9的右侧上部区域)，可见总单核细胞比例为7.92％，以下将对这群细胞进行免疫表型分析。

2、总单核细胞群的CD16-CD14表达情况散点图如图10所示，根据CD16和CD14的表达情况，分为三个亚群，可见经典型单核(MO1，表型定义为CD14+/CD16-)占单核细胞的75.61％、中间型单核(MO2，表型定义为CD14+/CD16+)占单核细胞的10.80％、非经典型单核(MO3，表型定义为CD14dim/CD16+)占单核细胞的6.45％。

使用此抗体组合检测该例待测样本的单核细胞亚群，经典型单核(MO1)的比例为75.61％，虽＜94％，提示患者为非慢性粒单核细胞白血病(非CMML)，与临床诊断结果相符，但是如图10所示，L-区域中有7.13％的CD16/CD14均不表达的细胞群，提示仅使用CD45-SSC圈出的总单核细胞群，里面可能混有其他细胞(如部分体积偏小的粒细胞和部分体积偏大的淋巴细胞)，总单核细胞不纯，会直接影响亚群的比例，导致结果不准确。

二、异常样本

该样本为临床已经确诊CMML患者的外周血标本(同实施例3)。使用抗体组合为CD64-PE、CD14-ECD、CD16-APC、CD45-KO，对获取数据按以下步骤进行抗体表达模式分析：

1、获取该待测样本的流式细胞术检测结果数据。使用CD45-SSC(侧向散射光)设门，根据CD45-SSC的表达情况，圈出目标细胞群：总单核细胞(图11的右侧上部区域)，可见总单核细胞比例为15.75％，以下将对这群细胞进行免疫表型分析。

2、总单核细胞群的CD16-CD14表达情况散点图如图12所示，根据CD16和CD14的表达情况，分为三个亚群，可见经典型单核(MO1,表型定义为CD14+/CD16-)占单核细胞的85.24％、中间型单核(MO2，表型定义为CD14+/CD16+)占单核细胞的1.11％、非经典型单核(MO3，表型定义为CD14dim/CD16+)占单核细胞的3.79％。

以上免疫表型均提示该待测样本的细胞群在正常对照人群抗体表达模式模板中，经典型单核(MO1)比例为85.24％，＜94％，提示患者为非慢性粒单核细胞白血病(CMML)，与临床诊断结果不相符。

因此，综合一和二的结果可知，在CD45-SSC圈门的基础上，增加CD36抗体，使用CD36-CD64圈出总单核细胞群，更精准，保证后面的单核亚群分析的百分比更准确。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。