一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法

技术领域

本发明属于医药中间体的生物合成技术领域，具体涉及星孢菌素的生物合成，尤其涉及一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法。

背景技术

癌症严重威胁人类健康，其诱发因素往往源于信号通路中激酶的异常活化。另外，自身免疫病、神经退行病等常见高发慢性病也与激酶异常密切相关。2001年，第一个激酶抑制剂类药物格列卫(Gleevec)在美获批上市，开启了癌症靶向治疗新时代，疗效显著优于化疗。截至2019年底，FDA共批准了52个激酶抑制剂。虽然数量较多，但由于癌症种类繁多、涉及的异常激酶众多且变异类型多样、以及使用后耐药等因素，癌症在临床上仍存在重大未满足的治疗需求。另外，这些上市药物仅靶向大约25个激酶，仅占人体518个激酶中的5％，尚有大量激酶暂未成药。因此，这类药物研发空间巨大。

抗肿瘤新药主要来源于天然产物类似物。因此，有效合成天然产物类似物的创新技术对于新药发现来说至关重要。天然产物往往结构复杂，含有多个手性中心。相对于化学合成，因具有严格的区域和立体选择性，生物合成更有优势。尤其是合成生物学原理与技术的日益成熟，使得天然产物类似物的有效合成易于实现。更重要的是，生物合成也能充分利用化学合成的灵活性，为其提供结构不同的合成原料，从而产生结构不同的非天然类似物。通过构建非天然类似物库，筛选出高选择性高活性化合物，进而可开发出安全有效的激酶抑制剂类新药。

星孢菌素(Staurosporine)是一种来源于放线菌的天然产物，具有广谱强效的激酶抑制活性。据不完全统计，星孢菌素能够有效抑制200多种人体激酶，多个激酶的半抑制浓度(IC50)能够达到nM级别。由于选择性不强，此类化合物中，目前只有米哚妥林(Midostaurin)于2017年在美获批上市，用于治疗急性髓性白血病。开发星孢菌素类似物的有效合成技术，构建其类似物库，进而筛选获得高选择性化合物，是促成这类化合物广泛成药的关键因素。由于结构复杂，通过化学手段合成星孢菌素类似物库进行新药发现困难较大。因此，生物合成提供了一种切实可行且有竞争力的技术手段。

1997年日本科学家发现了星孢菌素，其生物合成基因簇DNA序列在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别。随后，多个天然合成酶如StaO、StaD、StaP、StaC等的催化活性在体外生化实验中得到证实，式I显示了星孢菌素的生物合成途径，其中R基团表示＝O或者＝NH，两者可逆。

星孢菌素的核心结构单元是其母核即K252c，其合成原料为L-色氨酸。K252c经糖基化以及甲基化修饰后得到星孢菌素。K252c、Holyrine A等星孢菌素类似物均具有显著的激酶抑制活性。

通过遗传修饰星孢菌素的生物合成途径，例如失活或引入特定酶编码基因，便能够在微生物体内合成星孢菌素类似物。然而，这一方法效率低下，构建菌株耗时耗力，且每株菌仅能产生一个或少数几个类似物，难以用于构建数量较大的星孢菌素类似物库。

因此，本领域亟需开发一种不仅能够产生星孢菌素的核心结构单元K252c、也能够产生大量K252c类似物的合成路径，来构建数量较大的星孢菌素类似物库。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法。所述催化合成体系及催化合成方法利用体外酶法合成技术，适用于构建星孢菌素类似物库，可从库中筛选出高选择性高活性的化合物，进而开发出安全有效的激酶抑制剂类新药，从而满足癌症病人在临床上存在的重大治疗需求。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系，所述催化合成体系包括：合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶、辅因子和缓冲液；

其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，且所述单加氧酶为SpcC。

目前已知的L-色氨酸氧化酶包括天然合成酶StaO及其同工酶如RebO、NokA、SpcO、AtmO或VioA等，已知的CPA合成酶包括天然合成酶StaD及其同工酶如RebD、NokB、SpcD、AtmD或VioB等；然而，并不是所有的已报道的L-色氨酸氧化酶和CPA合成酶在CPA的合成路径中均能起到较好的催化作用；例如AtmO和AtmD，两种酶组合起来并不能催化L-色氨酸得到CPA；且不同的酶与不同的组合在制备过程中的产量均有较大差异。而本发明中特异选择的VioA、VioB作为CPA合成路径中的L-色氨酸氧化酶和CPA合成酶，再结合效率较高的单加氧酶SpcC，能够高效催化L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物生成星孢菌素中间体。

本发明中，将L-色氨酸和化学合成的不同L-色氨酸衍生物用作合成原料，逐一或混合加入到合成酶系中进行一定时间的温育，即可生成一系列结构不同的星孢菌素类似物。所述L-色氨酸氧化酶为VioA，且所述CPA合成酶为VioB，两者组合具有较高的反应效率，为后续细胞色素P450酶和单加氧酶提供反应原料，便于合成星孢菌素中间体K252c及其衍生物。

作为本发明优选的技术方案，所述细胞色素P450酶包括StaP或RebP。

优选地，所述催化合成体系中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，所述细胞色素P450酶为RebP，且所述单加氧酶为SpcC。

作为本发明优选的技术方案，所述辅因子包括还原型辅酶和/或蛋白类辅因子。对于本发明而言，反应体系中还原型辅酶和蛋白类辅因子都是必须的，两者同时存在才能使整个酶系具有合成活性。但在具体实验过程中，由于添加的酶液是粗酶液，即细胞裂解液，未经纯化；所以即使在实验过程中不外加还原型辅酶和蛋白类辅因子，酶液中也同时含有这两类辅因子。若额外添加还原型辅酶和/或蛋白类辅因子，会使整个酶系的合成活性会更高。

优选地，所述还原型辅酶包括NADH和/或NADPH。

优选地，所述蛋白类辅因子包括FldA和/或FnR。

优选地，所述催化合成体系中包括辅因子NADPH、FldA和FnR。

本发明中，所述辅因子的添加能够明显增加K252c的产量，同时，本发明中还比较了还原型辅酶Ⅰ(NADH)与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的反应效率，大肠杆菌来源FldA-FnR组合与菠菜来源Ferredoxin-Reductase组合，最终结果可知，辅因子NADPH、FldA和FnR的组合具有最好的辅助效果。

本发明中，所述反应体系中添加的酶可以是经过纯化或者是未经纯化的酶；当添加粗酶液时，所述酶液中除目的蛋白外，必然含有其他的杂蛋白。本发明中以大肠杆菌为宿主生产目的蛋白，以所得粗酶液加入反应体系，各酶液的加入量以其总蛋白在反应体系中的含量进行表示，即酶液的总蛋白含量乘以酶液加入体积与反应体系总体积之比，如下所示：

作为本发明优选的技术方案，所述催化合成体系中，L-色氨酸氧化酶液的总蛋白质量浓度为2～10mg/mL，例如可以是2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL等，优选为4～8mg/mL。

优选地，所述催化合成体系中，CPA合成酶液的总蛋白质量浓度为1～8mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL或8mg/mL等，优选为4～6mg/mL。

优选地，所述催化合成体系中，细胞色素P450酶液的总蛋白质量浓度为10～20mg/mL，例如可以是10mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL或20mg/mL等，优选为14～16mg/mL。

优选地，所述催化合成体系中，单加氧酶液的总蛋白质量浓度为30～40mg/mL，例如可以是31mg/mL、32mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL或40mg/mL等，优选为33～36mg/mL。

优选地，所述催化合成体系中，所述辅因子NADPH的摩尔浓度为5～15mM，例如可以是6mM、7mM、9mM、10mM、11mM、13mM、14mM或15mM等，优选为8～12mM。

优选地，所述催化合成体系中，辅因子FldA蛋白液的总蛋白质量浓度为2～6mg/mL，例如可以是2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL、5.5mg/mL或6mg/mL等，优选为3～5mg/mL。

优选地，所述催化合成体系中，辅因子FnR蛋白液的总蛋白质量浓度为0.5～1.5mg/mL，例如可以是0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.9mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL或1.5mg/mL等，优选为0.8～1mg/mL。

作为本发明优选的技术方案，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液。

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为50～200mM，例如可以是50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM等。

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为6.8～7.2，例如可以是6.8、6.9、7.0、7.1或7.2等。

优选地，所述Tris-HCl缓冲液还包括氯化钠。

优选地，所述Tris-HCl缓冲液中氯化钠的摩尔浓度为100～200mM，例如可以是100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM等。

优选地，所述缓冲液还包括DTT，在缓冲液中添加DTT，能够提高酶的稳定性。

优选地，所述缓冲液中DTT的摩尔浓度为0.5～1.5mM，例如可以是0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM或1.5mM等。

优选地，所述缓冲液还包括DMSO。

优选地，所述缓冲液中DMSO的质量浓度为5～15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％等。

第二方面，本发明还提供一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成方法，所述催化合成方法包括：

分别构建表达L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、细胞色素P450酶和单加氧酶的载体，诱导表达并制备酶液；

将合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶以及辅因子混合，得到如第一方面所述的催化合成体系，经反应，得到星孢菌素中间体K252c和/或K252c衍生物。

作为本发明优选的技术方案，所述反应的时间为8～20h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h等。

优选地，所述反应的温度为20～37℃，例如可以是20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、34℃或37℃等，优选为25℃。

作为本发明优选的技术方案，所述催化合成体系中细胞色素P450酶为RebP，所述单加氧酶为SpcC，所述辅因子为NADPH、FldA和FnR。

优选地，所述载体包括大肠杆菌表达载体。

优选地，所述载体包括表达载体pET-30a(+)。

作为本发明优选的技术方案，所述催化合成方法中反应完成后还包括加热的步骤。

优选地，所述加热的温度为80～85℃，例如可以是80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃等。所述加热可以使用金属浴，将反应体系中的酶灭活，同时也可能对后续的萃取步骤较为有利。

优选地，所述加热的时间为10～15min，例如可以是10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13min、14min或15min等。

优选地，所述催化合成方法中反应完成后还包括萃取的步骤。

优选地，所述萃取使用的萃取剂包括乙酸乙酯。

优选地，所述萃取的温度为30～37℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等。

优选地，所述萃取的时间为20～40min，例如可以是20min、22min、24min、25min、28min、30min、32min、35min、36min、38min或40min等。

作为本发明优选的技术方案，所述催化合成方法包括如下步骤：

(1)分别合成编码L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、细胞色素P450酶和单加氧酶的核苷酸并连接至大肠杆菌表达载体上，构建表达所述L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、细胞色素P450酶和单加氧酶的载体，诱导表达并制备酶液；

(2)将合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶以及辅因子混合，得到催化合成体系，20～37℃反应8～20h，80～85℃加热10～15min，再使用乙酸乙酯萃取，得到星孢菌素中间体K252c和/或K252c衍生物。

本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明基于体外酶法技术，提供了一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的合成方法，主要用于星孢菌素及其类似物的合成；该方法基于多酶催化，所选用的酶组合对于多种色氨酸衍生物都具有较好的催化效果，并在体外进行生物合成，能够解决星孢菌素类似物产量和效率低下，且种类匮乏的问题；

本发明中，将L-色氨酸和化学合成的不同L-色氨酸衍生物用作合成原料，逐一或混合加入到合成酶系中进行一定时间的温育，即可生成一系列结构不同的星孢菌素类似物。该催化合成方法适用于高效合成星孢菌素类似物库，能够广泛应用于激酶抑制剂类新药的发现研究。

附图说明

图1为实施例3中所得LC-MS检测图谱；其中，I图为反应体系的萃取样品在270nm处的紫外吸收图谱，II图为发酵液萃取样品中质荷比(m/z)为386的离子图谱。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1构建表达质粒

本实施例用于构建星孢菌素类似物天然合成酶、同工酶和蛋白类辅因子的表达质粒。

其中，所述星孢菌素类似物天然合成酶及其同工酶以及蛋白类辅因子共19种，具体如下表1所示：

表1

根据大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性，对19个蛋白的DNA编码序列进行密码子优化并合成，通过NdeI和HindIII双酶切，分别装入表达载体pET-30a(+)，得到相应的表达质粒。

实施例2制备酶液

将实施例1中构建的表达质粒，分别导入宿主菌BL21(DE3)中，得到相应的表达菌株。

将上述表达菌株分别在装有TB培养基的5L发酵罐(上海百伦)中进行培养，OD

结束后，离心收集菌体，Buffer B(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7)洗涤2次后，重悬至缓冲液(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％Glycerin，pH7)中，OD

酶液或蛋白液的蛋白浓度用Bradford试剂盒(上海生工)进行测定，蛋白浓度如表2所示。

表2

实施例3合成CPA

以L-色氨酸(L-tryptophan，Trp)为合成原料，按表3所示配制反应体系比较6组酶合成CPA的活性。

反应温度25℃，反应时间20h。

反应结束后，金属浴85℃加热15min，冷却至室温后加入2倍体积甲醇充分混匀，离心收集上清。

上清用LCMS检测反应产物，即Chromopyrrolic acid(CPA)，其在270nm处有强吸收，故CPA的浓度与270nm处的紫外吸收峰面积成正比。

本实施例中，同时以其他L-色氨酸氧化酶和CPA合成酶的组合作为对比例进行比较；其中，StaO同工酶液加入量的总蛋白保持与StaO酶液加入量的总蛋白量一致，同理StaD同工酶液加入量的总蛋白保持与StaD酶液加入量的总蛋白量一致。

表3

注：L-Trp：L-色氨酸；Buffer：0.1M Tris-HCl，150mM NaCl，pH为7.0。

LC-MS检测结果如图1所示：实施例反应体系中，目标产物CPA[m/z 386，M+1]在270nm处的峰面积最大，出峰时间为3.348min(I图)，该峰对应的离子即[M+1]的质/荷比(m/z)为386(II图)；

上述实验结果证明，VioA-VioB的同工酶组合，远大于其他反应体系；其次是对比反应体系3，对比反应体系1和对比反应体系2和4，而对比反应体系5中没有监测到CPA。

综上，反应效率最高的是VioA-VioB组合，最差的是AtmO-AtmD组合；也可以证明不同的酶会有较为明显的差别。

实施例4三组酶合成K252c的活性比较

本实施例中以CPA作为合成原料，按表4所示配制反应体系，比较三组酶的反应活性，反应温度25℃，反应时间20h。

RebP酶液加入体积保持与StaP酶液加入体积一致，同理SpcC酶液加入体积保持与StaC酶液加入体积一致。

反应结束后，金属浴85℃加热15min，冷却至室温后加入2倍体积的乙酸乙酯充分混匀萃取，摇床37℃，200rpm，30min后离心收集上清中的有机相，重复进行一次。

合并两次萃取得到的有机相，40℃挥发干燥，加入50μL DMSO溶解后进行LCMS检测。

反应产物K252c在290nm处有强吸收，故K252c的浓度与290nm处的紫外吸收峰面积成正比。

表4

LCMS监测结果显示，三个反应体系中均检测到了K252c的生成[m/z 312，M+1]。通过比较峰面积可知，RebP-SpcC组合(实施例反应体系4)催化效率大于StaP-SpcC组合(实施例反应体系2)，远大于StaP-StaC组合(实施例反应体系3)。这一结果说明SpcC催化活性远大于StaC，RebP催化活性大于StaP。

实施例5反应体系中辅因子的筛选

StaP催化活性需依赖多个辅因子，包括：1)还原型辅酶NADH或NADPH；2)氧还蛋白，如菠菜来源铁氧还蛋白(Ferredoxin)或大肠杆菌来源黄素氧还蛋白(Flavodoxin，FldA)等；3)氧还蛋白还原酶，如菠菜来源铁氧还蛋白还原酶(Reductase)或大肠杆菌来源黄素氧还蛋白还原酶(Flavodoxin Reductase，FnR等。

本实施例中比较了还原型辅酶Ⅰ(NADH)与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的反应效率，大肠杆菌来源FldA-FnR组合与菠菜来源Ferredoxin-Reductase组合的反应效率以及DTT和DMSO对反应效率的影响，具体反应体系如表5和表6所示。随后，使用LC-MS检测K252c在290nm处的紫外吸收峰面积。

表5

注：Buffer溶液为0.1M Tris-HCl，150mM NaCl，pH为7.0。

表6

LCMS检测结果显示，以上反应体系均检测到了K252c[m/z 312，M+1]。

通过比较290nm处紫外吸收峰面积可知，FnR-FldA组合(实施例反应体系6)的反应效率远大于Ferredoxin-Reductase组合(实施例反应体系5)，NADPH(实施例反应体系8)的反应效率大于NADH(实施例反应体系7)，添加1mM DTT和10％DMSO(实施例反应体系10)可以显著提高反应效率。

实施例6反应时间和温度比较

本实施例中使用酶组合(VioA，VioB，RebP，SpcC)进行催化反应，以L-色氨酸为底物，反应如下表7所示。

LCMS检测K252c在290nm处的紫外吸收峰面积。LCMS检测结果显示，五个反应体系均检测到了K252c。

表7

通过比较峰面积可知，本发明中所述反应的最佳时间为8～20h，最佳反应温度为25℃。

综上所述，最优酶组合(VioA，VioB，RebP，SpcC)，及其最优适配辅因子组合(FnR，FldA，NADPH)，以及反应效率促进剂1mM DTT和10％DMSO的反应体系组合为最佳反应体系，最佳的反应温度为25℃，最佳的反应时间为8～20h。

实施例7星孢菌素类似物的合成

本实施例以L-色氨酸衍生物作为合成原料，采用上述实施例中得到的最佳反应体系(见表8)，以及最佳反应条件(反应温度为25℃，反应时间为20h)，合成了数个星孢菌素类似物，结果见表9。

表8

注：RebP与SpcC的加样体积可根据色氨酸衍生物的体积调整。

表9

另外，利用上述反应体系及反应条件，同时使用L-色氨酸与L-色氨酸衍生物为合成原料，LCMS检测结果显示，除了能够检测到两个底物各自对应的K252c及其衍生物外，还能够检测到两个底物杂合的反应产物，如表10所示：

表10

由上表可知，本发明所提供的酶组合，对于不同的色氨酸衍生物都具有较好的催化效果，因此，能够解决星孢菌素类似物产量低下，种类匮乏的问题。

综上所述，本发明基于多酶催化，提供了一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的合成方法，能够解决星孢菌素类似物产量低下，种类匮乏的问题。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。