一种检测牛精液中BVDV1型的组合物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，涉及一种检测牛精液中BVDV1型的组合物、试剂盒及应用。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)病毒，根据病毒5’-UTR基因序列将BVDV分为BVDV1型和BVDV2型。该病毒可引起牛的病毒性腹泻病(BVD)，还可感染猪、羊、鹿等其他反刍动物，引起呼吸、胃肠道系统疾病、母畜流产等症状；同时，BVDV可引起免疫抑制而易继发其它传染病，死亡率极高；给养殖业造成巨大的经济损失，在世界范围内属于动物检疫的重点对象。《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》将其列为二类传染病。2014年9月，我国口岸首次从澳大利亚牛血清中检出该病毒。因此，早期诊断对该病的及时发现和快速控制都非常重要。

近年来，因我国奶牛养殖业发展及动物育种改良的需要，先后批准从乌拉圭、新西兰、澳大利亚等国进口种牛，同时与澳大利亚、新西兰、美国等国均签署了进口牛精液检疫和卫生条件议定书，议定书中规定输入牛精液需进行BVDV检测。此外，国内也有用于育种的牛精液产品贸易。然而，对垂直传播的病毒检测需要更高的灵敏性要求，因此，提高检测敏感性避免漏检，以及加强检测规范性，是牛精液检疫技术的重中之重。

微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术是新一代PCR技术，用油包水的方法进行反应，使核酸分子分布于每个微滴中，经PCR扩增后，经过微滴检测，根据泊松分布原理计算出拷贝数，可实现核酸准确定量。相比荧光定量PCR方法更灵敏准确，受PCR反应抑制物的影响小，可实现复杂来源样品中极低含量核酸分子稳定检出。

而目前，国内对牛精液中BVDV1型检测方法为分子生物学检测法，主要有常规PCR法和荧光定量PCR法，当牛精液中病原含量极其微少时，存在检不出的现象。目前还没有采用ddPCR技术检测BVDV1型的方法，而基于现有技术中检测BVDV1型所存在灵敏性差等问题，亟待建立适合牛精液中BVDV1型检测的超灵敏、稳定、快速的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测牛精液中BVDV1型的组合物、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，提供了一种包含引物和探针的组合物，利用该组合物能快速、灵敏、准确检测牛精液中的BVDV1型。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种检测牛精液中BVDV1型的组合物，包括引物对和探针，其中所述引物对为上游引物如SEQ ID NO：1所示和下游引物如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述探针为5’端连接FAM且3’端连接BHQ1的如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种检测牛精液中BVDV1型的方法，包括基于微滴式数字PCR，且利用权利要求1所述的组合物扩增牛精液样品的步骤。

优选的是，所述微滴式数字PCR反应体系为20μL，其包括以下组分：2×ddPCR预混液10μL，上、下游引物各1.6μL，探针0.4μL，模板1μL，补充水至20μL。

优选的是，所述微滴式数字PCR反应条件为：95℃10min；95℃30sec，60℃1min，共40个循环；98℃5min，16℃保存；

所述微滴式数字PCR反应条件中的升温速度和降温速度均为2.5℃/sec。

具体的检测牛精液中BVDV1型的方法，包含如下操作：对经反转录后的牛精液样品进行微滴式数字PCR(QX200 Droplet Reader，BIO-RAD，USA)反应，每个反应总体积为20μL，各组分如下：2×ddPCR预混液10μL，上、下游引物各1.6μL(800nmol/L)，探针0.4μL(200nmol/L)，模板1μL，补充水至20μL。将充分混匀的PCR体系转移到微滴发生板上对应的样品孔中，在每个注油孔中加入70μL微滴发生专用油，将微滴发生板放到微滴发生卡适配器上，套上密封垫，最后把微滴发生卡适配器放置于微滴发生仪中进行反应。将反应生成的微滴转移入96孔PCR板上，并贴上热封膜，然后用热封仪密封后，置于PCR仪中进行扩增。反应程序参数为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火延伸1min，共40个循环；98℃稳定微滴5min，16℃保存。在PCR反应过程中温度升降速度设置在2.5℃/sec。最后用微滴分析仪对扩增产物进行计数分析。根据分析得到的拷贝数对检测结果进行判断。

本发明还提供一种检测牛精液中BVDV1型的试剂盒，包括权利要求1所述的组合物。

本发明还提供一种所述的组合物或所述的试剂盒在检测牛精液中BVDV1型中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明提供的ddPCR方法检测灵敏度高于现有的荧光定量PCR方法，可检测到低至单个拷贝的目的核酸(1copies/μL)，且无需依赖标准曲线即可对样品初始拷贝数进行定量，可实现BVDV1型的精准检疫。

(2)本发明通过实验验证，提供了ddPCR反应过程中最适的退火温度，以提高ddPCR的扩增效率。

(3)本发明提供的引物特异性好，与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛布氏杆菌(Brucella)和牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)核酸无交叉反应。

(4)本发明提供的引物稳定性好，样品经过不同时间后进行检测，其组内和组间阳性微滴占比的变异系数均小于0.5％，说明重现性高。

(5)本发明提供的ddPCR方法受抑制物影响小，荧光定量PCR方法的检测容易受反应抑制物的影响呈现假阴性，而利用ddPCR的微滴反应体系，能有效避免假阴性的出现。

(6)在低浓度病毒下，本发明提供的ddPCR方法的检测效果显著优于荧光定量PCR方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中不同退火温度牛病毒性腹泻病毒1型微滴式数字PCR法扩增一维散点图；

图2为本发明实施例中荧光定量PCR标准曲线(A)和灵敏性检测结果(B)图；其中，B图曲线1～10分别为1×10

图3为本发明实施例中牛病毒性腹泻病毒1型微滴式数字PCR法灵敏性检测中目标基因拷贝数结果图；其中，1～5分别为1×10

图4为本发明实施例中牛病毒性腹泻病毒1型微滴数字PCR法特异性检测结果一维散点图(A)和目标基因拷贝数结果图(B)；其中，1～5分别为阳性对照、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛布氏杆菌和牛型结核分枝杆菌核酸样品；NC为阴性对照。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例中所用到的牛病毒性腹泻病毒(BVDV1型)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛布氏杆菌(Brucella)和牛型结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)核酸样品以及90份牛精液样品(含30份BVDV1型临床样品)均由呼和浩特海关技术中心提供。

实施例1BVDV1型ddPCR方法的建立

1、引物和探针的设计

将GenBank公布的BVDV的5’-UTR基因序列(如有登录号：AJ304384.1\EU180029.1\GU395536.1\KF205297.1\LT901625.1MF347399.1\MG323524.1\MG670546.1\MH198309.1)进行序列比对，进一步确定了BVDV 5’-UTR基因的保守区域(其序列如SEQ ID NO：4所示)。根据保守区域，设计1对BVDV引物和1条Taqman探针，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体序列见表1。

其中SEQ ID NO：4：

AGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAATGAGGGGGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGCAGTCGTCAGTGGTTCGACACCTAGGATGGTAGGTCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAGCCTGAGCGGGGGTCGCCCAGGTGAAAGCGGTACAGACAGACCGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGA；

表1 BVDV1型ddPCR检测引物和探针序列

2、病毒基因组的提取

使用病毒基因组DNA/RNA小量提取试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司，货号AK2802)操作说明书进行病毒DNA或RNA提取，提取的DNA在-80℃保存备用。

提取的RNA进行cDNA转录，转录体系20μL，包括5×AMV Buffer 4μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，RNasin(40U/μL)0.5μL，10μM反转录引物2μL，AMV反转录酶(5U/μL)1μL，RNA模板10.5μL，混匀，然后置PCR仪进行反转录，反转录程序为：42℃60min；99℃5min，cDNA转录完成后-80℃保存备用。以上试剂均购自宝生物(大连)生物工程有限公司。

3、BVDV 5’-UTR基因DNA质粒模板的合成

用上述引物(BVDV-F和BVDV-R)将所获得BVDV的cDNA样品进行普通PCR扩增，收集扩增片段送至宝生物(大连)生物工程有限公司测序，通过NCBI的BLAST工具比对，为目标序列SEQ ID NO：5；

其中，SEQ ID NO：5：

TGAGTACAGGGCAGTCGTCAGTGGTTCGACACCTAGGATGGTAGGTCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAGCCTGAGC；

然后将所述片段连接到Trans-T1感受态细胞中，命名为pBVDV质粒。用质粒提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)提取质粒。用NanoDrop 1000紫外可见分光光度计(Thermo Scientific)定量纯化后的DNA稀释成1.0×10

4、ddPCR的建立

利用上述所设计的引物及探针，使用ddPCR Supermix for Probes试剂盒(BIO-RAD，USA)，用20μL ddPCR扩增体系，包括：2×ddPCR Supermix 10μL，200nmol/L探针0.4μL，800nmol/L上、下游引物各1.6μL，模板DNA 1μL，灭菌去离子水4.9μL。根据引物长度、碱基含量等优化反应条件，反应程序设置为：95℃10min；40个循环：95℃30sec，50℃～65℃1min；98℃稳定微滴5min，16℃保存。(升降温速度为2.5℃/sec)

结果显示：在60℃时，荧光信号的强度最大，中间弥散的微滴数最少，并且阳性微滴和阴性微滴之间的划分明显，阳性微滴数与阴性微滴数趋于稳定。因此，选用60℃作为最优退火温度，见图1。

实施例2荧光定量PCR方法检测引物和探针的有效性

利用上述ddPCR引物及探针，使用TransStart Probe qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，按照25μL反应体系进行荧光定量PCR实验，见表2。

表2 25μL荧光定量PCR反应体系

反应条件为：94℃30sec；94℃5sec，58℃30sec，共40个循环。

实验结果显示：线性关系良好，在40个循环内最低检出浓度为1×10

实施例3ddPCR方法灵敏性检测

根据荧光定量PCR的检测结果，剔除超过ddPCR动态范围的高浓度模板后进行ddPCR检测，以确定该所建立的方法的检测灵敏度。具体检测方法同实施例1中ddPCR的建立，优化后的反应参数，建立灵敏性检测试验。

检测结果显示：ddPCR对阳性质粒的最低检出浓度为1×10

实施例4ddPCR方法重复性和稳定性检测

选取稀释度为1×10

结果表明，阳性微滴数占总微滴数占比的组内重复变异系数为0.01％～0.08％，组间变异系数为0.02％～0.1％。均低于0.5％，该检测方法重复性和稳定性良好，表3-4。

表3组内重复性试验结果

表4组间重复性试验结果

实施例5ddPCR方法特异性检测

用IBRV、BTV、牛布氏杆菌和牛型结核分枝杆菌核酸为模板，按优化后的反应参数，建立特异性试验。用pBVDV质粒做为阳性对照组，同时设立阴性对照。

结果显示：该方法只对阳性样品有扩增，对其他样品均无扩增，表明该方法特异性较好，见图4A-B。

实施例6建立的ddPCR方法对临床样品检测

使用本发明实施例1提供的BVDV 1型ddPCR方法检测90份牛精液样品，其中已知30份BVDV1型阳性样品。同时，检测结果与OIE诊断用的荧光定量PCR检测结果进行比较。

结果显示，ddPCR结果：30份为阳性，60份为阴性，与已知结果一致；荧光定量PCR检测结果：27份为阳性，63份为阴性，其中27份阳性结果与已知结果一致，另外3份结果不一致的样品再用ddPCR方法检测出阳性，与已知结果一致。因此，说明本发明提供的ddPCR检测方法比荧光定量PCR检测方法更加灵敏。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广东海洋大学 呼和浩特海关技术中心

<120> 一种检测牛精液中BVDV1型的组合物、试剂盒及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagtacagg gcagtcgtca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcaggcta agatgtgctg t 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagatgcca cgtggacgag ggca 24

<210> 4

<211> 244

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggctagcca tgcccttagt aggactagca aaatgagggg ggtagcaaca gtggtgagtt 60

cgttggatgg ctgaagccct gagtacaggg cagtcgtcag tggttcgaca cctaggatgg 120

taggtctcga gatgccacgt ggacgagggc atgcccacag cacatcttag cctgagcggg 180

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<210> 5

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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tggacgaggg catgcccaca gcacatctta gcctgagc 98