猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗。

背景技术

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型引起的猪的一种传染病，引起仔猪断奶综合征、猪皮炎与肾病综合征及母猪繁殖障碍，其临床表现多样化。猪感染圆环病毒后，可引起严重的免疫抑制，从而继发或并发其他传染病，如支原体、副猪嗜血杆菌、猪溶血性链球菌等疾病。

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病病毒的天然宿主和贮存者，本病以发热、奇痒、脑脊髓炎和严重的繁殖障碍为主要特征，华中农大、中国农大、南京农大、中国动物疫病控制中心等通过多项实验研究表明，新发生伪狂犬病是由新的毒株引起的。华中农业大学动物疫病诊断中心将全国各省份发病猪病料中分离的伪狂犬野毒进行基因测序，结果表明，当前分离的流行毒株在TK、gB、gE、gC等基因发生了多个碱基的标志性突变和连续性缺失，这些突变和缺失有可能是导致当前猪伪狂犬再次流行的一个重要原因。目前商品化疫苗免疫产生的抗体对目前流行毒株的中和能力要差。变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状，猪场母猪、仔猪、育肥猪大量死亡，给该病的防控提出新的难题，给当今的养猪业也造成严重的经济损失。

猪支原体肺炎，又称猪地方性流行肺炎，是由支原体引起的以慢性、高度传染性、高发病率和低死亡率为主要特点的呼吸道疾病。感染猪长期发育不良、饲料转化率低、日增重下降，严重影响养猪业的经济效益。支原体和其他呼吸道疾病的病原，如猪繁殖与呼吸道综合征病毒、放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪流感病毒、圆环病毒2型混合感染时，会使病情加剧，引起猪的死亡。猪支原体肺炎是一种顽固性慢性病，抗支原体药物治疗一般可以抑制该病但很难清除，用药后咳喘症状消失，但停药后容易再次复发。

目前，市售疫苗中仅有相关单苗或者二联疫苗，免疫频率过大，导致猪只应激。同时由于抗生素滥用，导致耐药菌株的出现，使药物治疗趋于无效；本发明所提供的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联疫苗，可做到一针三防，减少免疫次数及应激，切实解决养猪业的难题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原组成，所述猪圆环病毒2型抗原为纯化浓缩并灭活的猪圆环病毒2型蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原为纯化浓缩并灭活的猪伪狂犬病毒蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述支原体抗原为灭活的支原体蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。

作为本发明的一种优选技术方案，所述水性高分子聚合物佐剂为Montanide Gel，所述复合多糖类免疫增强剂为中药多糖水溶性复合物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原按照体积比为1:1:1。

作为本发明的一种优选技术方案，所述猪圆环病毒2型病毒液的病毒含量≥10

作为本发明的一种优选技术方案，所述猪伪狂犬病毒液的病毒含量≥10

作为本发明的一种优选技术方案，所述支原体病毒液的病毒含量≥10

作为本发明的一种优选技术方案，猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪圆环病毒2型毒株CCTCC-V201333，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7-10天；

S2、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪伪狂犬病毒毒株CCTCC-V201654，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7-10天；

S3、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种支原体病毒毒株CCTCC-V201317，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7-10天；

S4、当以上三种细胞的病变程度均在90％以上时，分别收获病毒液，并反复冻融2次后，并通过离心机6000r/min离心10分钟，分别取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，静置12h并在4℃室温下过夜，经中空纤维膜过滤，分别得到猪圆环病毒2型病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液，保存于-40℃以下，备用；

S5、对收获的病毒液分别进行病毒含量和纯净性检验，所述猪圆环病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液的病毒含量均≥10

S6、将上述检验合格的三批病毒液经过2000～5000r/min低速离心，2次微孔滤膜澄清过滤并经100KD～1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，分别得到得猪圆环病毒2型浓缩液、猪伪狂犬病毒浓缩液和支原体病毒浓缩液；

S7、分别向步骤S6中澄清过滤纯化后的三批病毒液加入0.3％所得病毒液体积的灭活剂，搅拌灭活24～48小时，灭活过程中将灭活体系pH稳定控制在7.0～7.4之间；

S8、将检验合格的病毒液按1:1:1体积比例混合，即得猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体的三联活疫苗。

作为本发明的一种优选技术方案，所述猪圆环病毒2型的宿主细胞为乳猪肾原代细胞，所述猪伪狂犬病毒的宿主细胞为BHK细胞，所述支原体病毒的宿主细胞为PK15细胞。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤S7中所述灭活剂为二乙烯亚胺、β～丙内酯、甲醛以及戊二醛的一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、通过浓缩纯化工艺可提高抗原含量，获得高浓度Cap蛋白含量的抗原液，是传统工艺抗原含量的3倍；病毒液中的细胞碎片和异物蛋白是造成猪体副反应的主要原因，本发明采用澄清过滤去除细胞碎片和大蛋白，使用超滤浓缩去除小分子异物蛋白，经检测纯化后病毒液异物蛋白去除率达75％，极大的降低了疫苗副反应几率；

2、解决了目前市场上缺少的有效的防治猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三种疾病的多联疫苗的问题，和现有的打三针单疫苗才能预防这三种传染病比较，可做到一针三防，减少免疫次数及应激，该发明经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例一

本发明提供一种技术方案：猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原组成，所述猪圆环病毒2型抗原为纯化浓缩并灭活的猪圆环病毒2型蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原为纯化浓缩并灭活的猪伪狂犬病毒蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述支原体抗原为灭活的支原体蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。

本实施例中，优选的，所述水性高分子聚合物佐剂为Montanide Gel，所述复合多糖类免疫增强剂为中药多糖水溶性复合物。

本实施例中，优选的，所述猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原按照体积比为1:1:1。

本实施例中，优选的，所述猪圆环病毒2型病毒液的病毒含量≥10

本实施例中，优选的，所述猪伪狂犬病毒液的病毒含量≥10

本实施例中，优选的，所述支原体病毒液的病毒含量≥10

本实施例中，优选的，猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪圆环病毒2型毒株CCTCC-V201333，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7天；

S2、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪伪狂犬病毒毒株CCTCC-V201654，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7天；

S3、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种支原体病毒毒株CCTCC-V201317，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7天；

S4、当以上三种细胞的病变程度均在90％以上时，分别收获病毒液，并反复冻融2次后，并通过离心机6000r/min离心10分钟，分别取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，静置12h并在4℃室温下过夜，经中空纤维膜过滤，分别得到猪圆环病毒2型病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液，保存于-40℃以下，备用；

S5、对收获的病毒液分别进行病毒含量和纯净性检验，所述猪圆环病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液的病毒含量均≥10

S6、将上述检验合格的三批病毒液经过3000r/min低速离心，2次微孔滤膜澄清过滤并经800KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，分别得到得猪圆环病毒2型浓缩液、猪伪狂犬病毒浓缩液和支原体病毒浓缩液；

S7、分别向步骤S6中澄清过滤纯化后的三批病毒液加入0.3％所得病毒液体积的灭活剂，搅拌灭活24～48小时，灭活过程中将灭活体系pH稳定控制在7.0；

S8、将检验合格的病毒液按1:1:1体积比例混合，即得猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体的三联活疫苗。

本实施例中，优选的，所述猪圆环病毒2型的宿主细胞为乳猪肾原代细胞，所述猪伪狂犬病毒的宿主细胞为BHK细胞，所述支原体病毒的宿主细胞为PK15细胞。

本实施例中，优选的，步骤S7中所述灭活剂为甲醛。

实施例二

本发明提供一种技术方案：猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原组成，所述猪圆环病毒2型抗原为纯化浓缩并灭活的猪圆环病毒2型蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原为纯化浓缩并灭活的猪伪狂犬病毒蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述支原体抗原为灭活的支原体蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。

本实施例中，优选的，所述水性高分子聚合物佐剂为Montanide Gel，所述复合多糖类免疫增强剂为中药多糖水溶性复合物。

本实施例中，优选的，所述猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原按照体积比为1:1:1。

本实施例中，优选的，所述猪圆环病毒2型病毒液的病毒含量≥10

本实施例中，优选的，所述猪伪狂犬病毒液的病毒含量≥10

本实施例中，优选的，所述支原体病毒液的病毒含量≥10

本实施例中，优选的，猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪圆环病毒2型毒株CCTCC-V201333，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养10天；

S2、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪伪狂犬病毒毒株CCTCC-V201654，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养10天；

S3、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种支原体病毒毒株CCTCC-V201317，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养10天；

S4、当以上三种细胞的病变程度均在90％以上时，分别收获病毒液，并反复冻融2次后，并通过离心机6000r/min离心10分钟，分别取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，静置12h并在4℃室温下过夜，经中空纤维膜过滤，分别得到猪圆环病毒2型病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液，保存于-40℃以下，备用；

S5、对收获的病毒液分别进行病毒含量和纯净性检验，所述猪圆环病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液的病毒含量均≥10

S6、将上述检验合格的三批病毒液经过5000r/min低速离心，2次微孔滤膜澄清过滤并经1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，分别得到得猪圆环病毒2型浓缩液、猪伪狂犬病毒浓缩液和支原体病毒浓缩液；

S7、分别向步骤S6中澄清过滤纯化后的三批病毒液加入0.3％所得病毒液体积的灭活剂，搅拌灭活48小时，灭活过程中将灭活体系pH稳定控制在7.0～7.4之间；

S8、将检验合格的病毒液按1:1:1体积比例混合，即得猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体的三联活疫苗。

本实施例中，优选的，所述猪圆环病毒2型的宿主细胞为乳猪肾原代细胞，所述猪伪狂犬病毒的宿主细胞为BHK细胞，所述支原体病毒的宿主细胞为PK15细胞。

本实施例中，优选的，步骤S7中所述灭活剂为二乙烯亚胺。

本发明通过浓缩纯化工艺可提高抗原含量，获得高浓度Cap蛋白含量的抗原液，是传统工艺抗原含量的3倍；病毒液中的细胞碎片和异物蛋白是造成猪体副反应的主要原因，本发明采用澄清过滤去除细胞碎片和大蛋白，使用超滤浓缩去除小分子异物蛋白，经检测纯化后病毒液异物蛋白去除率达75％，极大的降低了疫苗副反应几率；解决了目前市场上缺少的有效的防治猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三种疾病的多联疫苗的问题，和现有的打三针单疫苗才能预防这三种传染病比较，可做到一针三防，减少免疫次数及应激，该发明经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。