一种异丙托溴铵中杂质A的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体而言，本发明涉及异丙托溴铵中杂质A的检测方法。

背景技术

异丙托溴铵是一种含紫外吸收基团的季铵盐类小分子化合物，其既可用于缓解慢性阻塞性肺病(COPD)引起的支气管痉挛、喘息症状，也可用于防治哮喘、尤其适用于因服用β受体激动药而产生肌肉震颤、心动过速并由此不能耐受此类药物的患者。异丙托溴铵的母核为含紫外吸收基团的季铵盐结构，其众多相关杂质亦为含紫外吸收基团的季铵盐结构。然而，杂质A是异丙托溴铵诸多杂质中唯一一个无紫外吸收的季铵盐类化合物，故本领域中常规使用的紫外吸收高效液相色谱法无法对其进行定性或定量检测。

杂质A的化学名为(1R, 3R, 5S, 8R)-3-羟基-8-甲基-8-异丙基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷溴化物，分子式为C

本领域已知，在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面，必须保持药物的纯度，降低药物中所包含的杂质，这样才能保证药物的有效性和安全性。如药物中含有超过限量的杂质，就有可能使药物的理化常数发生变动，外观形状产生变异，并影响药物的稳定性。异丙托溴铵中杂质A的存在会影响药物的疗效，甚至对人体的健康产生危害，因此对杂质A加强控制检测，是提高异丙托溴铵质量的一个重要环节。

现有检测技术采用薄层色谱法，通过比较供试品溶液与特定浓度的异丙托溴铵杂质A 对照品溶液在薄层板上形成斑点的位置及颜色深浅来对杂质A进行控制，该种薄层色谱法无法精确且定量对杂质A进行检测。离子色谱法是高效液相色谱法的一种，其分离机理主要是离子交换，是目前分析阴、阳离子最为常用的一种有效方法。而杂质A是溴的季铵盐化合物，预期可通过离子色谱技术有效定性和定量检测。然而，用于杂质A分析的离子色谱技术的开发面临着诸多技术性挑战，例如：1、目标物低浓度的响应问题；2、季铵盐类化合物良好保留时间及色谱峰峰形的问题；3、阳离子分析柱的选择问题；4、异丙托溴铵主成分及其它季铵盐类杂质对杂质A的干扰问题；5、溶媒基质中外部可能引入的阳离子，如Na

因此，亟待开发一种可有效解决异丙托溴铵溶液中杂质A含量由于间接计算导致的不准确性的离子色谱技术。

发明内容

本发明通过提供一种异丙托溴铵中杂质A的检测方法填补了当前技术的空白。本发明提供的方法能够应用于异丙托溴铵中杂质A的定性鉴别和定量检测。

因此，本发明提供一种新的异丙托溴铵中杂质A的检测方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种异丙托溴铵中杂质A的检测方法，所述方法包括如下步骤：

（1）制备对照品溶液：精密称取异丙托溴铵杂质A对照品适量，以超纯水溶解稀释，制成每1ml约含5μg异丙托溴铵杂质A的对照品溶液；

（2）制备供试品溶液：精密称取异丙托溴铵原料50mg于10ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

（3）检测：精密吸取步骤（1）制备的对照品溶液和步骤（2）制备的供试品溶液各500μl注入配有阳离子色谱柱的离子色谱仪中进行测定；

其中，所述阳离子色谱柱选自IonPac CS12、IonPac CS14和IonPac CS17。

优选地，在本发明提供的异丙托溴铵中杂质A的检测方法的步骤(3)中，所述阳离子色谱柱为IonPac CS17。

优选地，在本发明提供的异丙托溴铵中杂质A的检测方法的步骤(3)中，所述色谱柱的柱温为25-40℃，更优选地为35℃。

优选地，在本发明提供的异丙托溴铵中杂质A的检测方法的步骤(3)中，所述检测采用的流动相包含有机酸和乙腈；更优选地，所述有机酸选自甲烷磺酸和硫酸；进一步优选地为浓度为2～20mmol/L的甲烷磺酸水溶液，再进一步优选地为浓度为5mmol/L的甲烷磺酸水溶液。

优选地，在本发明提供的异丙托溴铵中杂质A的检测方法的步骤(3)中，所述流动相中有机酸的体积占流动相总体积的100%～50%，更优选地为60%。

优选地，在本发明提供的异丙托溴铵中杂质A的检测方法的步骤(3)中，所述流动相的流速为0.8～1.2 ml/min，更优选地为0.8～1.0 ml/min，进一步优选地为1.0 ml/min。

优选地，在本发明提供的异丙托溴铵中杂质A的检测方法的步骤(3)中，所述检测采用电导检测器和阳离子抑制器进行。

在本发明的一些优选实施方案中，提供了一种异丙托溴铵中杂质A的检测方法，所述方法包括如下步骤：

（1）制备对照品溶液：精密称取异丙托溴铵杂质A对照品适量，以超纯水溶解稀释，制成每1ml约含5μg异丙托溴铵杂质A的对照品溶液；

（2）制备供试品溶液：精密称取异丙托溴铵原料50mg于10ml量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

（3）检测：精密吸取步骤（1）制备的对照品溶液和步骤（2）制备的供试品溶液各500μl注入配有阳离子色谱柱的离子色谱仪中进行测定；

其中，在步骤（3）所述的检测中所采用的色谱条件包括：

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm；预柱为IonPac CG17，4×50mm；

流动相：5 mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈，体积比为60:40；

柱温：35℃；

流速：1.0 ml/min；

进样量：500 μl。

在本发明的进一步优选实施方案中，根据检测记录的色谱图，按外标法以峰面积计算供试品溶液中异丙托溴铵杂质A的含量。

本发明具有以下有益效果：

本发明有效地解决了现有检测方法对异丙托溴铵中微量杂质A控制的不准确性，填补了精准检测异丙托溴铵中杂质A含量的技术空白。

本发明的方法操作简单，能快速、准确地对异丙托溴铵中杂质A进行测定，可有效保证用于各类制剂产品中的异丙托溴铵原料质量，保证用药安全。

本发明的结果显示，异丙托溴铵杂质A色谱法分离度良好，可以实现基线分离，专属性良好。异丙托溴铵、异丙托溴铵杂质B、异丙托溴铵杂质F、钠离子和钾离子对其均无干扰。本发明的方法验证结果表明，各验证项目均符合要求，采用本发明提供的方法测定异丙托溴铵中杂质A的含量，结果准确可靠。

本发明的流动相组成简单，仅采用甲烷磺酸水溶液和乙腈，且无需调节pH值；供试品处理简便、快速。

本发明的方法检测时间短，试剂消耗少，检测成本低。

附图说明

图1为实施例1中系统适用性溶液的离子色谱图。

图2为实施例1中对照品溶液的离子色谱图。

图3为实施例2中样品加标溶液的离子色谱图。

图4为实施例2中钠离子溶液、钾离子溶液、异丙托溴铵杂质A溶液、异丙托溴铵杂质B溶液和异丙托溴铵杂质F溶液的离子色谱图的典型叠图。

图5为实施例9中不同流速测定的系统适用性溶液离子色谱图的典型叠图。

图6为实施例9中不同柱温测定的系统适用性溶液离子色谱图的典型叠图。

图7为实施例9不同流动相比例测定的系统适用性溶液离子色谱图的典型叠图。

图8为实施例10中色谱柱IonPac CS16和IonPac CS17测定的系统适用性溶液离子色谱图的典型叠图。

图9为实施例11中不同浓度甲烷磺酸水溶液离子色谱图的典型叠图。

具体实施方式

下面结合附图说明和实施例对本发明做进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

本发明实施例中所用的离子色谱仪、电子天平均为市售。

如无特殊说明，以下实施例中所用试剂均为市售。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：其中分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm；预柱为IonPac CG17 4×50mm；

柱温35℃；

以5mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈（60:40）进行等度淋洗，流速1.0ml/min；进样量500μl。

具体检测步骤：

步骤1. 供试品溶液的制备：精密称取异丙托溴铵原料50mg置于10ml容量瓶中，用超纯水溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

步骤2. 对照品溶液的配制：精密称取异丙托溴铵杂质A对照品适量，以超纯水溶解稀释，制成每1ml约含5μg异丙托溴铵杂质A的对照品溶液。

步骤3. 系统适用性溶液的配制：分别精密称取异丙托溴铵、异丙托溴铵杂质A适量，以超纯水溶解、稀释，制成每1ml含异丙托溴铵50μg、异丙托溴铵杂质A 5μg的溶液。

步骤4. 取空白溶液（即超纯水）、系统适用性溶液、供试品溶液，对照品溶液各500μl，分别注入离子色谱仪，按照所述色谱条件进行测定，记录色谱图，其中系统适用性溶液的离子色谱图如图1所示；对照品溶液的离子色谱图如图2所示。

试验结果表明，供试品溶液中异丙托溴铵杂质A分离度良好、无干扰。与对照品溶液中对应的主峰基本一致。

采用与实施例1相同的色谱条件进行专属性试验。

具体试验步骤：

步骤1. 空白溶液的配制，即超纯水。

步骤2. 系统适用性溶液的配制，与实施例1中的系统适用性溶液一致。

步骤3. 对照品溶液的配制，与实施例1中的对照品溶液一致。

步骤4. 样品加标溶液：精密称取样品50mg置于10ml容量瓶，以对照品溶液溶解定容，摇匀即得。

步骤5. 定位溶液的配制：取氯化钠适量以超纯水溶解稀释即得钠离子定位溶液；取氯化钾适量以超纯水溶解稀释即得钾离子定位溶液；取异丙托溴铵杂质B适量以超纯水溶解稀释即得杂质B定位溶液；取异丙托溴铵杂质F适量以超纯水溶解稀释即得杂质F定位溶液。

步骤6. 混合溶液：分别称取氯化钠、氯化钾、异丙托溴铵杂质B、异丙托溴铵杂质F适量，以系统适用性溶液溶解稀释，制成每1ml含钠离子、钾离子、异丙托溴铵杂质B、异丙托溴铵杂质F各50μg，含异丙托溴铵杂质5μg、含异丙托溴铵50μg的溶液。

步骤7. 取空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液、各定位溶液、样品加标溶液、混合溶液各500μl，分别注入离子色谱仪，按照所述色谱条件进行测定，记录色谱图。其中样品加标溶液的离子色谱图如图3所示，钠离子溶液、钾离子溶液、异丙托溴铵杂质A溶液、异丙托溴铵杂质B溶液和异丙托溴铵杂质F溶液的离子色谱图的典型叠图如图4所示。

试验结果表明，钠离子、钾离子、杂质B、杂质F和异丙托溴铵主成分均与杂质A可达到有效分离；且样品溶液中，异丙托溴铵杂质A峰处无其它峰干扰，本发明方法专属性良好。

采用与实施例1相同的方法进行线性范围试验。

结果显示，异丙托溴铵安杂质A在L-200%浓度范围内（0.5-10μg/ml）以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，线性相关系数r为0.9993。表明本发明的方法在L-200%浓度范围内（0.5-10μg/ml）线性关系良好，适用于微量异丙托溴铵杂质A的定量检测。

本实施例中线性范围试验方法为现有技术。

采用与实施例1相同的方法进行检测限和定量限试验

检测限、定量限结果如下表1所示。

结果表明：信噪比S/N＞3时，异丙托溴铵杂质A的检测限是0.05μg，信噪比S/N均大于10时，异丙托溴铵杂质A的定量限为0.15μg。本发明方法灵敏度高，能有效定量检测出异丙托溴铵中的微量杂质A，从而保证药品安全。

本实施例中检测限和定量限试验方法均为现有技术。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm，预柱为IonPac CG17 4×50mm；

柱温35℃；

以5mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈（60:40）进行等度淋洗；1.0ml/min；进样量500μl。

具体试验步骤：

步骤1. 供试品溶液的制备：精密称取异丙托溴铵原料50mg置10ml容量瓶中，用超纯水溶剂稀释至刻度，摇匀即得。同法配制共6份供试品溶液，分别标记为样品1-6。

步骤2. 对照品溶液的配制：精密称取异丙托溴铵杂质A对照品适量，以超纯水溶解稀释，制成每1ml约含5μg异丙托溴铵杂质A的对照品溶液。

步骤3. 对照品溶液连续进样6次，6份供试品溶液各进样一次，进样量500μl，以外标法计算样品中杂质A的含量。

结果如下表2所示。

6次测定中，最大值和最小值的绝对值差为0.007%＜0.01%，结果良好，表明本发明的检测方法重复性良好。

本实施例中重复性试验方法为现有技术。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm，预柱为IonPac CG17 4×50mm；

柱温35℃；

以5mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈（60:40）进行等度淋洗；1.0ml/min；进样量500μl。

具体试验步骤：

步骤1. 供试品溶液的制备：精密称取重复性试验项下（即实施例5）同批号异丙托溴铵原料50mg置10ml容量瓶中，用超纯水溶剂稀释至刻度，摇匀即得。同法配制共6份供试品溶液，分别标记为样品1-6。

步骤2. 对照品溶液的配制：精密称取异丙托溴铵杂质A对照品适量，以超纯水溶解稀释，制成每1ml约含5μg异丙托溴铵杂质A的对照品溶液。

步骤3. 对照品溶液连续进样6次，6份供试品溶液各进样一次，进样量500μl，以外标法计算样品中杂质A的含量。

中间精密度试验样品1-6的测定结果如下表3所示。

结合重复性试验的检测结果，将两位试验人员对供试品溶液的检测结果汇总于表4。

在两位实验人员的12次测定中，最大值和最小值的绝对值差为0.007%＜0.01%，结果良好，表明本发明的检测方法中间精密度良好。

本实施例中，中间精密度试验方法为现有技术。

采用与实施例1相同的色谱条件进行准确度试验。

具体试验步骤：

步骤1. 空白溶液的配制：即超纯水。

步骤2. 系统适用性溶液的配制，与实施例1中的系统适用性溶液一致。

步骤3. 对照品溶液的配制，与实施例1中的对照品溶液一致。

步骤4. 供试品溶液的配制，与实施例1中的供试品溶液一致。

步骤5. 准确度对照品储备液的配制：精密称取三份杂质A 对照品，每份5mg，分别置20ml容量瓶中，以超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为250μg/ml的储备液。分别记为a、b、c。

步骤6. 准确度样品溶液的配制：

50%准确度样品溶液：

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.1ml储备液a，以超纯水稀释定容即得，记为50%—1；

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.1ml储备液b，以超纯水稀释定容即得，记为50%—2；

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密0.1ml加储备液c，以超纯水稀释定容即得，记为50%—3。

100%准确度样品溶液：

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.2ml储备液a，以超纯水稀释定容即得，记为100%—1；

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.2ml储备液b，以超纯水稀释定容即得，记为100%—2；

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.2ml储备液c，以超纯水稀释定容即得，记为100%—3。

150%准确度样品溶液：

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.3ml储备液a，以超纯水稀释定容即得，记为150%—1；

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.3ml储备液b，以超纯水稀释定容即得，记为150%—2；

精密称50mg样品，置10ml容量瓶中，精密加0.3ml储备液c，以超纯水稀释定容即得，记为150%—3。

步骤7. 取空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液，准确度样品溶液各500μl，分别注入离子色谱仪，按照所述色谱条件进行测定，记录色谱图，以外标法计算。

试验结果：回收率为90.4%～101.4%，均在90%～108%之间；回收的RSD为3.8%＜5%，表明本发明的方法准确度良好。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm，预柱为IonPac CG17 4×50mm；

柱温：35℃；

以5mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈（60:40）进行等度淋洗；1.0ml/min；进样量500μl。

具体试验步骤：

步骤1. 对照品溶液的配制，与实施例7中的对照品溶液同法配制。

步骤2. 供试品溶液的配制，与实施例7中的100%准确度样品溶液同法配制。

步骤3. 取以上对照品溶液和供试品溶液保存室温条件下，分别放置0h、12h、24h、36h、48h后测定，考察溶液稳定性。

结果如下表5所示。

试验结果表明：在室温条件下，对照品溶液于0h、12h、24h、36h、48h后测定的峰面积RSD为3.2%＜5%；供试品溶液于0h、12h、24h、36h、48h后测定的峰面积RSD为1.0%＜5%，表明本发明的方法溶液稳定性良好。

本实施例中溶液稳定性试验方法为现有技术。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm，预柱为IonPac CG17 4×50mm；

柱温35℃；

采用下表6所列的体积比，以5mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈进行等度淋洗；进样量500μl。

具体检测步骤：取系统适用性溶液500μl，注入离子色谱仪，分别按照下列所述色谱条件进行测定，记录色谱图。

结果如图5所示，从图5中可以看出，流速为0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min时，异丙托溴铵杂质A 都能达到基线分离，峰对称性良好，保留时间和流速成反比。

图6表明柱温为33℃、35℃、37℃时，异丙托溴铵杂质A 都能达到基线分离，峰型良好，响应值及保留时间基本相同。

图7表明流动相中5mmol/L甲烷磺酸水溶液与乙腈的体积比为50:50时，分离效果不理想；流动相中5mmol/L甲烷磺酸水溶液与乙腈的体积比为70:30时，主峰峰型不好；流动相中5mmol/L甲烷磺酸水溶液与乙腈的体积比为80:20时，响应值变小，主峰消失；流动相中5mmol/L甲烷磺酸水溶液与乙腈的体积比为60:40时，分离度良好，无干扰，信号响应高。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：如下表7所示。

柱温35℃；

以5mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈（60:40）进行等度淋洗；流速1.0ml/min；进样量500μl。

具体检测步骤：取系统适用性溶液500μl，注入离子色谱仪，分别按照所述色谱条件进行测定，记录色谱图。

结果如图8所示，从图8中可以看出，色谱柱IonPac CS16不适用于本发明的检测方法；色谱柱IonPac CS17为最优选的。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm，预柱为IonPac CG17 4×50mm；

柱温35℃；

以甲烷磺酸水溶液-乙腈（60:40）进行等度淋洗；流速1.0ml/min；进样量500μl。

甲烷磺酸水溶液浓度如下表8所示。

具体检测步骤：

步骤1. 称取异丙托溴铵杂质A和异丙托溴铵适量，加水溶解配制成每1ml含99.8μg异丙托溴铵杂质A和104μg异丙托溴铵的混合溶液。

步骤2. 取混合溶液500μl，注入离子色谱仪，分别按照所述色谱条件进行测定，记录色谱图。

结果如图9所示，从图9中可以看出，此三种浓度的甲烷磺酸水溶液都能使杂质A和异丙托溴铵完全分离，但采用浓度为2mmol/L 的甲烷磺酸水溶液时，峰形不好，拖尾因子差，检测耗时长，响应值低；采用浓度为10mmol/L的甲烷磺酸水溶液时，拖尾因子比采用浓度为5mmol/L的甲烷磺酸水溶液时略差；采用浓度5mmol/L的甲烷磺酸水溶液时，峰形良好，拖尾因子良好，响应值良好，为最优选。

仪器与色谱条件：

赛默飞 DIONEX ICS-2100离子色谱仪；

检测器：电导检测器；

抑制器：阳离子抑制器 CSRS 300, 4mm；

色谱柱：分析柱为IonPac CS17 4×250mm，3.5μm，预柱为IonPac CG17 4×50mm；

柱温：35℃；

以5mmol/L甲烷磺酸水溶液-乙腈（60:40）进行等度淋洗；流速1.0ml/min；进样量500μl。

具体检测步骤同实施例1，检测结果如下表9所示。

结果表明，异丙托溴铵原料中，不同含量水平的杂质A均可有效定量。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。