一种检测HPV的试剂及其试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及HPV检测技术领域，具体而言，涉及一种检测HPV的试剂及其试剂盒和应用。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。根据临床数据显示，人乳头状瘤病毒(papillomavirus，HPV)与宫颈癌的发生存在明确的关系，在99.9％的宫颈癌患者中均可检测出人乳头状瘤病毒。

HPV是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性。HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。HPV属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。

HPV根据致病的程度，可划分为高危型和低危型。高危险型HPV包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59以及68等型别，高危型中HPV-16型和HPV-18型与宫颈癌的关系更为紧密，数据显示，有70％的宫颈癌病例都与HPV-16型或者HPV-18型的感染有关。因此，检测HPV-16型和HPV-18型病毒对宫颈癌的筛查和辅助诊断具有重要的临床价值，有助于早期发现和治疗宫颈癌，对降低宫颈癌发病率和死亡率有重要的意义。

荧光定量PCR是检测病原体核酸应用最广泛的方法，由于方法学限制，现有荧光定量PCR检测HPV16/18型的试剂(如引物、探针)普遍灵敏度为100个拷贝，灵敏度达10个拷贝的甚少，拷贝数为个位数的更是未见报道。因此，如何在保证检测特异性的前提下，提高检测灵敏度或给出新的高灵敏度解决方案，是HPV筛查需要解决的技术问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测HPV的试剂及其试剂盒和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，实施例提供一种检测HPV的试剂，所述试剂包括用于检测HPV16型的第一核酸组和/或用于检测HPV18型的第二核酸组；

其中，所述第一核酸组检测的靶区域A选自HPV16型L1基因的第27～第1101位碱基的区域；

所述第二核酸组检测的靶区域B选自HPV18型L1基因的第640～第1163位碱基的区域。

第二方面，实施例提供一种用于检测HPV的试剂盒，其包括前述实施方式所述的检测HPV的试剂。

第三方面，实施例提供一种检测HPV的方法，其包括采用前述实施方式所述的检测HPV的试剂对待测样品进行检测。

第四方面，实施例提供一种筛查或辅助诊断宫颈癌的试剂盒，其包括如前述实施方式所述的检测HPV的试剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供的检测HPV的试剂对HPV检测具有灵敏度高、特异性强的优点，其能有效对HPV进行检测和/或分型，避免或显著减少出现假阳性的结果，为宫颈癌的筛查或辅助诊断提供了一个新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实验例1中的核酸组合2针对HPV16型质粒(1E2-1E5)的线性扩增结果；

图2为实验例2中的核酸组合8针对HPV18型质粒(1E2-1E5)的线性扩增结果；

图3为试验例3中的针对国标人乳头瘤病毒L1基因分型参考品中非HPV-16型非HPV18型的扩增结果；

图4为试验例3中针对国标人乳头瘤病毒L1基因分型参考品中非HPV-16型非HPV18型的扩增结果；

图5为试验例3中针对国标人乳头瘤病毒L1基因分型参考品中非HPV质粒的阴性参考品的扩增结果；

图6为试验例3中核酸组合14针对内标(人基因组)的扩增结果如图6所示；

图7为试验例4中核酸组合2、8和14的三重扩增结果；

图8为试验例4中核酸组合2、8和14对5拷贝/反应的单一HPV16型临床样本的检测结果；

图9为试验例4中核酸组合2、8和14对5拷贝/反应的单一HPV18型临床样本的检测结果；

以上图1～图9中的黑色线为内标荧光信号标识，绿色线为HPV-18荧光信号标识，紫色线为HPV-16荧光信号标识(请参照提交的实审参考资料)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供了一种检测HPV的试剂，所述试剂包括用于检测HPV16型的第一核酸组和/或用于检测HPV18型的第二核酸组；

其中，所述第一核酸组检测的靶区域A选自HPV16型L1基因的第27～第1101位碱基的区域；

所述第二核酸组检测的靶区域B选自HPV18型L1基因的第640～第1163位碱基的区域。需要说明的是，“靶区域A选自HPV16型L1基因的第27～第1101位碱基的区域”是指：靶区域A选自HPV16型L1基因的第27～第1101位碱基的全长区域或部分区域，靶区域B依此类推。

在可选实施方式中，所述靶区域A包括如下区域中的任意一种或几种的组合：区域1～区域5。

其中，区域1选自HPV16型L1基因的第217位～第324位碱基的区域；

区域2选自HPV16型L1基因的第27位～第150位碱基的区域；

区域3选自HPV16型L1基因的第1011位～第1101位碱基的区域；

区域4选自HPV16型L1基因的第307位～第406位碱基的区域；

区域5选自HPV16型L1基因的第191位～第326位碱基的区域。

所述靶区域B包括如下区域中的任意一种或几种的组合：区域6～区域13；其中，

区域6选自HPV18型L1基因的第640位～第748位碱基的区域；

区域7选自HPV18型L1基因的第955位～第1068位碱基的区域；

区域8选自HPV18型L1基因的第954位～第1068位碱基的区域；

区域9选自HPV18型L1基因的第957位～第1065位碱基的区域；

区域10选自HPV18型L1基因的第988位～第1097位碱基的区域；

区域11选自HPV18型L1基因的第1045位～第1163位碱基的区域；

区域12选自HPV18型L1基因的第1067位～第1163位碱基的区域；

区域13选自HPV18型L1基因的第1045位～第1148位碱基的区域。

在可选实施方式中，所述靶区域A为如下区域中的任意一种：所述区域1、所述区域2和所述区域3；

所述靶区域B为所述区域7或所述区域8。

在可选实施方式中，所述靶区域A为区域3，所述靶区域B为区域8。

在可选实施方式中，所述第一核酸组包括用于检测靶区域A的引物对和/或探针。

在可选实施方式中，所述第一核酸组包括如下核酸组合中的任意一种或几种的组合：

用于扩增所述区域1的核酸组合1，其包括序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对1，或与所述引物对1具有至少90％序列同一性的引物对。

需要说明的是，“与所述引物对1具有至少90％序列同一性的引物对”是指与引物对1的上游引物或引物对1的下游引物具有至少90％序列同一性的引物对，下同。

用于扩增所述区域2的核酸组合2，其包括序列如SEQ ID No.3～4所示的引物对2，或与所述引物对2具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域3的核酸组合3，其包括序列如SEQ ID No.5～6所示的引物对3，或与所述引物对3具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域4的核酸组合4，其包括序列如SEQ ID No.7～8所示的引物对4，或与所述引物对4具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域5的核酸组合5，其包括序列如SEQ ID No.9～10所示的引物对5，或与所述引物对5具有至少90％序列同一性的引物对。

在可选实施方式中，所述第二核酸组包括用于检测靶区域B的引物对和/或探针。

在可选实施方式中，所述第二核酸组包括如下核酸组合中的任意一种或几种的组合：

用于扩增所述区域6的核酸组合6，其包括序列如SEQ ID No.16～17示的引物对6，或与所述引物对6具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域7的核酸组合7，其包括序列如SEQ ID No.18～19所示的引物对7，或与所述引物对7具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域8的核酸组合8，其包括序列如SEQ ID No.20～21所示的引物对8，或与所述引物对8具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域9的核酸组合9，其包括序列如SEQ ID No.22～23所示的引物对9，或与所述引物对9具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域10的核酸组合10，其包括序列如SEQ ID No.24～25所示的引物对10，或与所述引物对10具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域11的核酸组合11，其包括序列如SEQ ID No.26～27所示的引物对11，或与所述引物对11具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域12的核酸组合12，其包括序列如SEQ ID No.28～29所示的引物对12，或与所述引物对12具有至少90％序列同一性的引物对；

用于扩增所述区域13的核酸组合13，其包括序列如SEQ ID No.30～31所示的引物对13，或与所述引物对13具有至少90％序列同一性的引物对。

在可选实施方式中，所述核酸组合2的上游引物还包括如序列如SEQ ID No.40或41所示的序列。

需要说明的是，“序列如SEQ ID No.40或41所示的序列”为与所述引物对2具有至少90％序列同一性的引物对，此处的“还包括”是指，引物对2的上游引物还可以为如SEQ IDNo.40或41所示的序列，下同。

在可选实施方式中，所述核酸组合2的下游引物还包括如序列如SEQ ID No.42或43所示的序列。

在可选实施方式中，所述核酸组合8的上游引物还包括如序列如SEQ ID No.44或45所示的序列。

在可选实施方式中，所述核酸组合8的下游引物还包括如序列如SEQ ID No.46或47所示的序列。

在可选实施方式中，所述核酸组合1还包括序列如SEQ ID No.11的探针1；

在可选实施方式中，所述核酸组合2还包括序列如SEQ ID No.12的探针2。

在可选实施方式中，所述核酸组合3还包括序列如SEQ ID No.13的探针3。

在可选实施方式中，所述核酸组合4还包括序列如SEQ ID No.14的探针4。

在可选实施方式中，所述核酸组合5还包括序列如SEQ ID No.15的探针5。

在可选实施方式中，所述核酸组合6还包括序列如SEQ ID No.32的探针6。

在可选实施方式中，所述核酸组合7还包括序列如SEQ ID No.33的探针7。

在可选实施方式中，所述核酸组合8还包括序列如SEQ ID No.34的探针8。

在可选实施方式中，所述核酸组合9还包括序列如SEQ ID No.35的探针9。

在可选实施方式中，所述核酸组合10还包括序列如SEQ ID No.36的探针10。

在可选实施方式中，所述核酸组合11还包括序列如SEQ ID No.37的探针11。

在可选实施方式中，所述核酸组合12还包括序列如SEQ ID No.38的探针12。

在可选实施方式中，所述核酸组合13还包括序列如SEQ ID No.39的探针13。

在可选实施方式中，所述试剂还包括用于检测β-球蛋白基因的第三核酸组。

在可选实施方式中，所述第三核酸组包括用于检测β-球蛋白基因的引物对和/或探针。

在一些可选实施方式中，所述第三核酸组包括引物对14和/或探针14，引物对14的序列如SEQ ID No.48、49所示，所述探针14的序列如SEQ ID No.50所示。

在可选实施方式中，上述探针1～14序列的5’端均连接有荧光基团，3’端均连接有淬灭基团。荧光基团包括但不限于：VIC、FAM、TET、HEX、CY3、CY5、Texas Red、LC RED640和LCRED705；淬灭基团包括但不限于：BHQ1、BHQ2和BHQ3。

本发明实施例还提供了一种用于检测HPV的试剂盒，其包括前述实施方式所述的检测HPV的试剂；

在可选的实施方式中，上述试剂盒包括上述试剂还包括样品保存液、核酸提取液、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、内标对照、标准品试剂中一种或多种。

本发明实施例还提供了一种检测HPV的方法，其包括采用如前述实施方式所述的检测HPV的试剂对待测样品进行定性或定量检测。

在可选实施方式中，所述定性或定量检测为荧光定量PCR。

在可选实施方式中，荧光定量PCR的反应体系为：

50μl的PCR反应体系中包括：PCR反应液、酶混合液以及引物探针混合液。

其中，PCR反应液中包括：20～100mM Tris-base、5～45mM硫酸铵、5～45mM氯化钾、1～8mM氯化镁、0.01％～1％Tween20以及125～525μM d(U)NTPs(五种碱基)；

酶混合液包括：0.02～0.1U耐热DNA聚合酶和0.001～0.01U UDG酶。在一些实施例中，耐热DNA聚合酶可采用化学修饰耐热DNA聚合酶(例如Hotstart HiTaq DNAPolymerase；货号：MD026)。

引物探针混合液包括：2～300μM引物和2～300μM探针。

荧光定量PCR的反应条件为：

此外，本发明实施例还提供了一种筛查或辅助诊断宫颈癌的试剂盒，其包括如前述实施方式所述的检测HPV的试剂；

在可选的实施方式中，上述试剂盒包括上述试剂还包括样品保存液、核酸提取液、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、内标对照、标准品试剂中一种或多种。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种检测HPV的试剂盒，所述试剂包括用于检测HPV16型的第一核酸组、用于检测HPV18型的第二核酸组以及用于检测β-球蛋白基因扩增的第三核酸组。

第一核酸组

其靶区域A选自HPV16型L1基因(序列如SEQ ID No.51所示)的第27～第1101位碱基的区域。

具体地，靶区域A包括区域1～区域5。第一核酸组具体包括：用于依次扩增区域1～区域5的引物对1～引物对5，引物对1～引物对5的序列依次如SEQ ID No.1～10所示；以及，用于依次检测区域1～区域5的序列如SEQ ID No.11～15所示的探针1～探针5，具体请参照表1。

第二核酸组

其靶区域B选自HPV18型L1基因(序列如SEQ ID No.52所示)的第640～第1163位碱基的区域。具体地，靶区域B具体包括区域6～区域13；第二核酸组包括用于依次扩增区域6～区域13的引物对6～引物对13，引物对6～引物对13的序列依次如SEQ ID No.16～31所示；以及，用于依次检测区域6～区域13的序列如SEQ ID No.32～39所示的探针6～13，具体请参照表2。

表1第一核酸组

表2第二核酸组

备注：表1中的探针1～探针5的5’端均连接有VIC荧光基团，3’端均连接有BHQ1淬灭基团；

表2中的探针6～探针13的5’端均连接有FAM荧光基团，3’端均连接有BHQ1淬灭基团；

表1和表2中区域括号中的内容为对应的HPV 16型L1基因或HPV 18型L1基因中的碱基序列区域。

第三核酸组

其包括引物对14和探针14，引物对14的序列如SEQ ID No.48和49所示，所述探针14的序列如SEQ ID No.50所示，请参照表3。

表3第三核酸组

备注：表3中探针14的5’端连接有FOX荧光基团，3’端连接有BHQ2淬灭基团。

该试剂盒还包括有线性定量参考品。以采购的Sacace

以对照试剂盒的定量结果为标准，对本发明实施例试剂盒中的线性参考品浓度进行校对，使本发明试剂盒中的线性标准品对所有临床样本的定量结果与对照试剂盒的定量结果一致。

最后用浓度1ng/μl的正常人基因组为基质，分别对HPV-16型和HPV-18型质粒进行梯度稀释并混合，形成实施例1试剂盒中最终的1E5-1E2拷贝/μl的HPV-16型和HPV-18型混合质粒线性定量参考品。

实施例2

本实施例提供一种检测HPV的方法，其包括采用实施例1提供的试剂盒，根据需要检测的靶区域，选择相对应的引物对和探针对待测样品进行荧光定量PCR检测，具体步骤如下。

2.荧光定量PCR

(1)PCR反应体系的配置：

50μl的PCR反应体系中包括：PCR反应液、酶混合液以及引物探针混合液。

PCR反应液中包括：60mM Tris-base、12.5mM硫酸铵、20mM氯化钾、4mM氯化镁、0.05％Tween20以及200μMdN(U)TPs(五种碱基)；

酶混合液包括：0.075U耐热DNA聚合酶和0.005UUDG酶；

引物探针混合液包括：200μM引物和20μM探针。

待测样品加入5μl。

(2)将配置好的反应液分别加入各反应管中，进行PCR扩增，PCR反应条件如表4所示。

表4 PCR反应条件

试验例1

1.根据实施例1提供的核酸组合1～5中的引物对1-5，参考实施例2(将探针替换为SYBR Green I)采用SYBR法(SYBR Green I法的特点在于，SYBR在游离状态下几乎不发荧光，而当结合到DNA双链后，荧光信号强度会被放大百万倍，此时即可被仪器检测到，而不同片段的DNA序列，其熔解曲线的Tm值会有差异，所以可以通过对扩增产物的熔解曲线Tm值的分析，来判断产物是否单一)，对HPV16型的单一质粒进行检测，获取各组引物对的CT值，结果请参照表5。

表5第一核酸组合的检测结果

由表5可知，引物对1～5的扩增效率基本一致，且目的产物单一，为单一的HPV16型。

2.根据实施例1提供的核酸组合1～5中的引物对1-5，参考实施例2(将探针替换为SYBR Green I)采用SYBR法，对不同亚型的HPV质粒样本进行检测，获取各组引物对的熔解曲线的Tm值，结果请参照表6。

不同亚型的HPV包括：HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、66以及68。

表6不同亚型的HPV质粒样本的熔解曲线的Tm值

由表6可知，对于不同亚型的HPV质粒进行扩增后，引物对4和引物对5均有部分亚型与目标具有相似的Tm值，即引物对4和5对于其他HPV亚型具有非特异的扩增，而引物对1～3，对于其他亚型的Tm值均明显低于目的产物的Tm值，特性型优于引物对4和5。

3.根据实施例1提供的核酸组合1～3，参照实施例2采用Taqman探针法，对HPV16质粒进行扩增，线性范围选择1E5-1E2拷贝/μl，灵敏度稀释到10拷贝/μl，比较3组引物对的扩增效率、线性和灵敏度，比较结果请参照表7。

表7引物对1～3的比较结果

由表7可知，核酸组合1对于线性的扩增效率显著低于核酸组合2，且灵敏度偏低；而核酸组合3灵敏度与核酸组合2相当，其对于线性范围的扩增效率略低于核酸组合2，对于不同模板浓度的扩增效率也不一致，导致其线性范围内的△CT值偏离理论值(理论上，在线性范围内，10倍的模板浓度△CT值是3.3)，会导致标准曲线的不准确。

因此，核酸组合2为是针对HPV-16型最优的引物探针组合。

图1为核酸组合2针对HPV-16型质粒的线性扩增结果。

试验例2

1.根据实施例1提供的核酸组合6～13中的引物对6-13，参考实施例2(将探针替换为SYBR Green I)采用SYBR法，对HPV18型的单一质粒进行检测，获取各组引物对的CT值，结果请参照表8。

表8核酸组合6～13的检测结果

由表8可知，引物对11和引物对13均出现非特异性扩增，除引物对11和13外的引物对6～10以及12在扩增效率基本相同，目的产物单一，为单一的HPV18型。

2.根据实施例1提供的引物对6～10以及12，参考实施例2(将探针替换为SYBRGreen I)采用SYBR法，对不同亚型的HPV质粒样本进行检测，获取各引物对的熔解曲线的Tm值，结果请参照表6。

不同亚型的HPV包括：HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、66以及68。

表9不同亚型的HPV质粒样本的熔解曲线的Tm值

由表9可知，对于不同亚型的HPV质粒进行扩增后，引物对6、9、10和12均有部分其他亚型与目标具有相似的Tm值，即引物对6、9、10和12对于其他HPV亚型具有非特异的扩增，而引物对7和8，对于其他亚型的Tm值均明显低于目的产物的Tm值，且引物对8只对HPV18型有扩增曲线和Tm值，引物二聚体等非特异性扩增较好。

3.根据实施例1提供的核酸组合7和8，采用Taqman探针法，对HPV18质粒进行扩增，线性范围选择1E5-1E2拷贝/μl，灵敏度稀释到10拷贝/μl，比较2组引物对的扩增效率、线性和灵敏度，比较结果请参照表10。

表10引物对7和8的比较结果

由表10可知，核酸组合7对于线性的扩增效率和灵敏度均略低于核酸组合8；核酸组合7对于不同模板浓度的扩增效率也不一致，这样会导致其线性范围内的△CT值偏离理论值(理论上，在线性范围内，10倍的模板浓度△CT值是3.3)，会导致标准曲线的不准确。

因此，核酸组合8为是针对HPV-18型最优的引物探针组合。

图2为核酸组合8针对HPV-18型质粒的线性扩增结果。

试验例3

采用实施例1提供的核酸组合2、8和14构建三重PCR扩增系统。

采用以上三重扩增系统，对采购的国标人乳头瘤病毒L1基因分型参考品(批号360002-201602)中非HPV-16型非HPV-18型的其余32个HPV亚型的L1区段重组质粒进行特异性检测，检测结果如图3和4所示。

由图3～4可知，核酸组合2、8和14对于该32个HPV亚型检测均为阴性(即无扩增)，但是内标均可以正常扩增(国标HPV-L1各重组质粒的基质是浓度为2ng/μl的正常人基因组)。

采用以上三重扩增系统，针对国标人乳头瘤病毒L1基因分型参考品中非HPV质粒的阴性参考品的扩增结果如图5所示，内标可以正常扩展，阴性参考品扩增结果均为阴性。

采用以上三重扩增系统，针对内标(人基因组)的扩增结果如图6所示，只有内标扩增。

以上结果看见，核酸组合2、8和14构成的三重扩增系统对HPV非16型和18型的其他亚型和国标中提供的特异性模板均有高度的特异性，不会出现因为非特异的扩增所引起的假阳现象。

试验例4

采用本发明实施例1提供的核酸组合2、8和14构建三重PCR扩增系统。以实施例1中的线性参考品为定量标准，采用实施例2提供的Taqman方法，对制备的含有人基因组的HPV-16型和HPV-18型混合质粒的线性浓度梯度样品进行检测，检测结果请参照附图7。

由图7可知，不同目的浓度时的内标扩增效率一致，HPV-16型和HPV-18型两个亚型的线性扩增曲线与理论值一致，可以对未知浓度样品进行准确定量，在三重体系中各对核酸组合之间不存在相互干扰。

三重扩增系统的检测灵敏度

采用本发明实施例1提供的核酸组合2、8和14构建三重扩增系统，以实施例1中的线性参考品为定量标准，对单一HPV-16型核酸临床样本进行定量检测，将临床样本稀释至5拷贝/反应用于三重扩增检测，结果请参照附图8，对单一HPV-18型核酸临床样本进行定量检测，将临床样本稀释至5拷贝/反应用于三重扩增检测，结果请参照附图9。

由图8可知，内标正常扩增，核酸组合2在三重扩增系统中对于HPV16型样本的检测灵敏度为5拷贝/反应。

由图9可知，内标正常扩增，核酸组合8在三重扩增系统中对于HPV18型样本的检测灵敏度为5拷贝/反应。

试验例5

为了确定扩增区段对HPV16/HPV18型扩增灵敏度和特异性的作用。

针对扩增区域2，设置8组引物对，采用Taqman探针法分别对HPV16型质粒进行检测，检测结果如表11所示。

表11检测结果

由表11可知，针对区域2的8组引物对均具有灵敏度高，特异性好的优点，能对HPV16型样本进行分型检测。

针对扩增区域8，设置8组引物对，采用Taqman探针法分别对HPV16型质粒进行检测，检测结果如表12所示。

表12检测结果

由表12可知，针对区域8的8组引物对a～h均具有灵敏度高，特异性好的优点，能对HPV18型样本进行分型检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东菲鹏生物有限公司

<120> 一种检测HPV的试剂及其试剂盒和应用

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttagaatac atttacccga cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acctacctca acacctacac ag 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cactgtctac ttgcctcctg t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaataggga tgtccaactg c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgcagtaca aatatgtcat tat 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccatgtcgt aggtactcc 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtaggtgttg aggtaggtcg t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cataagcact agcattttct gt 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagtatcagg atcacaatac agggt 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgacctacct caacacctac aca 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgaggtgtc aggaaaacca aactt 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tccgtgctta caaccttaga tactg 25

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgtagtttc tgaagtagat atggca 26

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgcccacacc taatggctga c 21

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttggggtcgg gtaaatgtat tctaa 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cagacacagt tatgtatttt gggct 25

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctaaaggggg gcaatcgc 18

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggcatttttg gaatagagca g 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttggagaggg agaatacaca ca 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aggcattttt ggaatagagc a 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ttggagaggg agaatacaca ca 22

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

catttttgga atagagcagg t 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gagagggaga atacacacag c 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acactgtgcc tcaatcctta 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctgggagtca gaggtaacaa ta 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gctgtgtgta ttctccctct 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

attatgccag caaacacc 18

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aagtggctct attgttacct c 21

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

attatgccag caaacacc 18

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gctgtgtgta ttctccctct c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

accattgtta tgaccctgtg 20

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tagcccagtg ttccccaata gcagg 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

attgaggcac agtgtcaccc atagt 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

attgaggcac agtgtcaccc atagt 25

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tgaggcacag tgtcacccat agt 23

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ccaggtgaag cacgcatac 19

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgggagtcag aggtaacaat agag 24

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

accctgtgcc ttatgtaacc aat 23

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

acaactggga gtcagaggta acaat 25

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cactgtctac ttgcctcctg 20

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cactgtctac ttgcctcct 19

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aaaataggga tgtccaactg 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

aaaataggga tgtccaact 19

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

aggcattttt ggaatagagc 20

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

aggcattttt ggaatagagc ag 22

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ttggagaggg agaatacaca cag 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ttggagaggg agaatacaca cagc 24

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tgggtttctg ataggcactg act 23

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

aacagcatca ggagtggaca gat 23

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tctacccttg gacccagagg ttcttt 26

<210> 51

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

atgtctcttt ggctgcctag tgaggccact gtctacttgc ctcctgtccc agtatctaag 60

gttgtaagca cggatgaata tgttgcacgc acaaacatat attatcatgc aggaacatcc 120

agactacttg cagttggaca tccctatttt cctattaaaa aacctaacaa taacaaaata 180

ttagttccta aagtatcagg atcacaatac agggtattta gaatacattt acccgacccc 240

aataagtttg gttttcctga cacctcattt tataatccag atacacagcg gctggtttgg 300

gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat tagtggccat 360

cctttattaa ataaattgga tgacacagaa aatgctagtg cttatgcagc aaatgcaggt 420

gtggataata gagaatgtat atctatggat tacaaacaaa cacaattgtg tttaattggt 480

tgcaaaccac ctatagggga acactggggc aaaggatccc catgtaccaa tgttgcagta 540

actccaggtg attgtccacc attagagtta ataaacacag ttattcagga tggtgatatg 600

gttgatactg gctttggtgc tatggacttt actacattac aggctaacaa aagtgaagtt 660

ccactggata tttgtacatc tatttgcaaa tatccagatt atattaaaat ggtgtcagaa 720

ccatatggcg acagcttatt tttttattta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780

tttaataggg ctggtgctgt tggtgaaaat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840

gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900

acctctgatg cccaaatatt caataaacct tattggttac aacgagcaca gggccacaat 960

aatggcattt gttggggtaa ccaactattt gttactgttg ttgatactac acgcagtaca 1020

aatatgtcat tatgtgctgc catatctact tcagaaacta catataaaaa tactaacttt 1080

aaggagtacc tacgacatgg ggaggaatat gatttacagt ttatttttca actgtgcaaa 1140

ataaccttaa ctgcagacgt tatgacatac atacattcta tgaattccac tattttggag 1200

gactggaatt ttggtctaca acctccccca ggaggcacac tagaagatac ttataggttt 1260

gtaacatccc aggcaattgc ttgtcaaaaa catacacctc cagcacctaa agaagatccc 1320

cttaaaaaat acactttttg ggaagtaaat ttaaaggaaa agttttctgc agacctagat 1380

cagtttcctt taggacgcaa atttttacta caagcaggat taaaggccaa accaaaattt 1440

acattaggaa aacgaaaagc tacacccacc acctcatcta cctctacaac tgctaaacgc 1500

aaaaaacgta agctgtaa 1518

<210> 52

<211> 1706

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

atgtgcctgt atacacgggt cctgatatta cattaccatc tactacctct gtatggccca 60

ttgtatcacc cacagcccct gcctctacac agtatattgg tatacatggt acacattatt 120

atttgtggcc attatattat tttattccta agaaacgtaa acgtgttccc tatttttttg 180

cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatatc ttccacctcc ttctgtggca 240

agagttgtaa ataccgatga ttatgtgact cgcacaagca tattttatca tgctggcagc 300

tctagattat taactgttgg taatccatat tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag 360

caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa tatagagtat ttagggtgca gctacctgac 420

ccaaataaat ttggtttacc tgatactagt atttataatc ctgaaacaca acgtttagtg 480

tgggcctgtg ctggagtgga aattggccgt ggtcagcctt taggtgttgg ccttagtggg 540

catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgccac gtctaatgtt 600

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atccttatgg ggattccatg tttttttgct tacggcgtga gcagcttttt gctaggcatt 960

tttggaatag agcaggtact atgggtgaca ctgtgcctca atccttatat attaaaggca 1020

caggtatgcg tgcttcacct ggcagctgtg tgtattctcc ctctccaagt ggctctattg 1080

ttacctctga ctcccagttg tttaataaac catattggtt acataaggca cagggtcata 1140

acaatggtgt ttgctggcat aatcaattat ttgttactgt ggtagatacc actcgcagta 1200

ccaatttaac aatatgtgct tctacacagt ctcctgtacc tgggcaatat gatgctacca 1260

aatttaagca gtatagcaga catgttgagg aatatgattt gcagtttatt tttcagttgt 1320

gtactattac tttaactgca gatgttatgt cctatattca tagtatgaat agcagtattt 1380

tagaggattg gaactttggt gttccccccc cgccaactac tagtctggtg gatacatatc 1440

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atccctatga taagttaaag ttttggaatg tggatttaaa ggaaaagttt tctttagact 1560

tagatcaata tccccttgga cgtaaatttt tggttcaggc tggattgcgt cgcacgccca 1620

ccataggccc tcgcaaacgt tctgctccat ctgccactac gtcttctaaa cctgccaagc 1680

gtgtgcgtgt acgtgccagg aagtaa 1706