一种苯胺类药物快速检测试剂盒及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于胶体金检测技术领域，具体涉及一种苯胺类药物快速检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，中成药、保健食品及食品中非法添加现象层出不穷，其中，宣称解热镇痛类的产品已成为非法添加的重灾区，一直是研究热点。宣称解热镇痛类的产品常见有抗风湿类的保健食品，快速退热、消炎止痛的凉茶饮料，“不上头”的酒类等。由于苯胺类解热镇痛类药物(如对乙酰氨基酚、非那西丁、贝诺酯等)，具有起效迅速、疗效显著、价廉易得的特点，该类药物已成为宣称具有止痛、退热功能的食品及保健食品中非法添加的主要成分。通过风险监测，近四成宣称具有止痛、退热功能的食品及保健食品检出苯胺类解热镇痛类药，存在较高的安全隐患。

对乙酰氨基酚是最常用的退热、止痛药物，也是该类产品中非法添加最为严重的药物，在植物饮料(凉茶)中尤为常见，约70％问题凉茶样品检出对乙酰氨基酚。凉茶中非法添加对乙酰氨基酚的剂量较大，以常见的销售包装(250mL/瓶)计，部分问题样品对乙酰氨基酚的量高达1000mg，超过单次正常服用量的2～4倍，存在较高的安全隐患。

非那西丁在肝内的主要代谢物为对乙酰氨基酚，由于毒性较大，在国外均已禁用，但国内未全面禁用，但单方制剂均已被淘汰禁止生产，目前只允许生产其复方制剂，常见的复方制剂有索米痛片(亦称去痛片，每片含非那西丁0.2g，氨基比林0.15g，苯巴比妥0.015g，咖啡因0.05g)。卫生部在1982年公告禁用非那西丁的单方制剂，食药监局在1999年、2003年相继多次发布公告，禁用大部分含有非那西丁的复方制剂。在食品及保健食品中添加该药物引发的安全隐患较高。

贝诺酯为对乙酰氨基酚与阿司匹林的酯化物，其作用机制基本与阿司匹林及对乙酰氨基酚相同，疗效与阿司匹林相似，主要用于类风湿性关节炎、急慢性风湿性关节炎、风湿痛、感冒发烧、头痛、手术后疼痛、神经痛等。有研究认为，贝诺酯不比其他非甾体抗炎药优越，且不良反应可能超过它的好处。其不良反应主要有呕吐、灼心、便秘、嗜睡及头晕等，用量过大可致耳鸣、耳聋。对阿司匹林过敏者禁用。在食品及保健食品中添加该药物，对特定人群存在较高安全风险。

目前，关于健康产品中非法添加苯胺类解热镇痛药物的研究较少，苯胺类解热镇痛药的检验方法主要有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、薄层色谱法、毛细管色谱法等。以上大型仪器方法操作繁琐、检验时间长，不满足现场快速检测的需求。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测的检测装置及其制备方法和用途。

本发明所采取的技术方案是：

本发明提供一种化合物，所述化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明还提供上述化合物作为苯胺类解热镇痛药物检测用半抗原的应用。

本发明还提供上述化合物的制备方法，包含以下步骤：

添加对乙酰氨基酚1.25～1.75g、20～30ml二氯甲烷和2.5～3.5ml吡啶，搅拌后加入对硝基氯甲酸苯酯2.38～2.46g的二氯甲烷溶液，搅拌1～2h。旋蒸后，加水及乙酸乙酯，萃取分液，取上层溶剂挥干溶剂，得到黄色固体。取上述黄色固体用THF溶解后，加入等体积的4-氨基丁酸的碳酸氢钠溶液，搅拌反应过夜；蒸干部分易挥发溶剂，盐酸溶液调节pH至3～4左右后，用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有机相，蒸干溶剂，过柱提纯。

本发明还提供一种抗原，所述抗原由上述的化合物制备而成。

在本发明的一些实施方式中，所述抗原为苯胺类解热镇痛药物免疫抗原或苯胺类解热镇痛药物偶联抗原。

在本发明的一些实施方式中，上述免疫抗原的制备方法为：

1.取上述半抗原0.08～0.12mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS。4℃搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；

2.称取血蓝蛋白(KLH)130～150mg溶于PBS中，加入DMF 0.8～1.2mL，混匀得B液；

3.搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换3～4次透析液，得苯胺类解热镇痛药物免疫抗原。

在本发明的一些实施方式中，上述苯胺类解热镇痛药物偶联抗原的制备方法为：

1.取上述半抗原0.08～0.12mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.18～0.22mmol DCC和0.1～0.2mmol NHS，4℃搅拌反应过夜，离心取上清得A液；

2.称取人血清蛋白(HSA)130～150mg溶于PBS中，加入DMF0.8～1.2mL，混匀得B液；

3.搅拌条件下，将A液滴入B液中，2～6℃反应10～14h，离心取上清，用生理盐水透析2～4天，每天更换3次透析液，得到苯胺类解热镇痛药物偶联抗原。

本发明还提供一种抗体，所述抗体由上述苯胺类解热镇痛药物免疫抗原免疫制备而成。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体为苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：

1.使用苯胺类解热镇痛药物免疫抗原免疫小鼠，加强免疫后，采血测效价，待血清效价不再上升，用1.8～2.2倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，3～4天后脱颈致死小鼠，制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按7～9:1的比例混合，加入无血清培养基，离心弃上清，将细胞团振松，置于36～38℃水浴中。在细胞液中加入0.025～0.04倍体积的45～55％PEG-400，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1～3min后，前25～40s沿管壁缓慢匀速加入0.025～0.04倍体积的无血清培养基，再在25～35s加入0.05～0.08倍体积的无血清培养基，然后快速加入0.8～1倍体积的无血清培养基终止融合过程。

2.离心弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的细胞培养板中，36～38℃、体积分数4.5～5.5％的CO

3.将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。采用体内诱生腹水法生产苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体。在小鼠腹腔注射液体石蜡油0.4～0.6mL/只，6～8天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×10

本发明还提供上述化合物或抗原或抗体在检测苯胺类解热镇痛药物中的应用。

本发明还提供一种检测装置，包括底板和反应杯，底板上依次铺设有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上为能与苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体结合的苯胺类解热镇痛药物偶联抗原；所述质控线上为能与苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体结合的兔抗鼠抗体；所述反应杯内为胶体金标记苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述胶体金的制备方法为：取0.5～1.5％氯金酸溶液0.5～1.5ml，加90～100ml超纯水制成氯金酸溶液，加热沸腾后，取0.5～2％柠檬酸三钠1.0～2ml迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热4～6min，室温冷却，补充失水至原体积。

本发明还提供上述胶体金标记苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体的制备方法为：调节胶体金溶液pH值至7～9，边搅拌边滴加苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体，0.5～1.5h后加入抗体量相当的PEG，反应20～35min后加入抗体量相当的BSA，继续搅拌20～35min，离心获得均一性胶体金标记苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体沉淀，再加PNPB重悬。

在本发明的一些实施方式中，所述离心的条件为：转速8000～10000rpm，时间25～35min。

在本发明的一些实施方式中，所述兔抗鼠抗体的制备方法为：用载体蛋白结合抗原免疫兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，测其定效价达到10

本发明还提供上述检测装置的制备方法，包含以下步骤：

S1：制备硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；所述检测线为能与苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体结合的上述的苯胺类解热镇痛药物偶联抗原在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；所述质控线为能与上述的苯胺类解热镇痛药物抗体结合的兔抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上进行线状点样制得；

S2：组装试纸条：在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫，硝酸纤维素膜及吸水纸；

S3：制备反应杯：反应杯中含有胶体金标记吡唑酮类解热镇痛药物单克隆抗体。

本发明还提供上述检测装置在检测苯胺类药物中的应用。

本发明还提供一种检测苯胺类药物的方法，包含以下步骤：

使用上述检测装置进行样本检测，具体为吸取待测样本加到加样孔中，进行结果判读；若T线与C线同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。

在本发明的一些实施方式中，所述苯胺类解热镇痛药物包括对乙酰氨基酚、非那西丁、贝诺酯。

本发明的有益效果是：本发明应用层析式免疫胶体金原理，试纸中检测线与质控线线比色来半定量检测样品中苯胺类解热镇痛药物(如对乙酰氨基酚、非那西丁、贝诺酯等)的含量，在短时间内快速准确地检测出样品是否含有苯胺类解热镇痛药物(如对乙酰氨基酚、非那西丁、贝诺酯等)，能够满足解热镇痛类产品中非法添加苯胺类解热镇痛药物(如对乙酰氨基酚、非那西丁、贝诺酯等)检测需求，能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。本发明与现有技术相比，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。

附图说明

图1为实施例5中的苯胺类解热镇痛药物胶体金检测装置的结构示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1苯胺类解热镇痛药物半抗原的制备

在100ml烧瓶中加入对乙酰氨基酚1.51g，加入25ml二氯甲烷和3ml吡啶，搅拌，加入对硝基氯甲酸苯酯2.42g的二氯甲烷溶液，搅拌1～2h。旋蒸至干后，加少量的水及乙酸乙酯，萃取分液，取上层溶剂挥干溶剂，得到黄色固体。取上述黄色固体1.30g于100ml烧瓶，用30mlTHF溶解后，加入30ml 4-氨基丁酸的碳酸氢钠溶液，搅拌反应过夜。蒸干部分易挥发溶剂，盐酸溶液调节PH至3～4左右后，用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有机相，蒸干溶剂，过柱提纯。得苯胺类解热镇痛药物半抗原，其化学式为C

实施例2苯胺类解热镇痛药物免疫抗原的合成

利用苯胺类解热镇痛药物半抗原制备免疫抗原。取苯胺类解热镇痛药物半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.2mmol DCC和0.15mmol NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取血蓝蛋白(KLH)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。

实施例3苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体的制备

利用苯胺类解热镇痛药物免疫抗原制备单克隆抗体。使用苯胺类解热镇痛药物免疫抗原并鉴定后免疫4只6周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1000r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把1mL50％PEG-400缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程。

1000r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5％的CO

采用体内诱生腹水法生产苯胺类解热镇痛药物单克隆抗体。选4只昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3～5×10

实施例4苯胺类解热镇痛药物偶联抗原的制备

取苯胺类解热镇痛药物半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入0.2mmol DCC和0.15mmol NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜A液，称取人血清蛋白(HSA)140mg溶于10mL浓度0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF 1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的全抗原以10mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中备用。

实施例5苯胺类解热镇痛药物胶体金检测装置的制备

5.1胶体金的制备

取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。

5.2胶体金标记单克隆抗体的制备

调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入苯胺类解热镇痛药物的单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的PEG，充分反应30min后加入抗体量相当的BSA，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加PNPB重悬备用。

5.3胶体金检测装置的制备

在试纸条底板上，沿同一方向依次将样品垫，喷涂有苯胺类解热镇痛药物偶联抗原(检测线)和兔抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连；反应杯内加入胶体金标记抗体，冻干，具体结构见图1。

实施例6液体样品中苯胺类解热镇痛药物的检测

取液体样品1mL，用Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀备用。滴加7滴上述样品稀释试液于反应杯中，混匀，随后插入试纸条，于10～40℃反应5min。取出试纸条，进行结果判读。若T线(检测线)与C线(质控线)同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。

实施例7固体样品中苯胺类解热镇痛药物的检测

取固体样品约0.2g，用Tris-PBS缓冲溶液稀释10倍，摇匀，静置1min，备用。滴加7滴上述样品稀释试液于反应杯中，混匀，随后插入试纸条，于10～40℃反应5min。取出试纸条，进行结果判读。若T线与C线同时显示紫红色条带且T线颜色比C线深，则结果为阴性；若T线颜色比C线浅或C线显色而T线不显色，则结果为阳性；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。

实施例8苯胺类解热镇痛药物胶体金检测装置的灵敏度检测

用Tris-PBS缓冲溶液分别配制不同浓度的对乙酰氨基酚、非那西丁或贝诺酯标准溶液，对上述标准溶液分别作20次平行测试。结果见表1。

表1各待测物的检出限

从表1可以看出，当对乙酰氨基酚浓度为0.1mg/L时，20份样品阳性检出率为50％；当浓度为0.2mg/L时，20份阳性检出率为100％。因此，该检测装置对乙酰氨基酚的检出限为0.2mg/L。当非那西丁浓度为0.25mg/L时，20份样品阳性检出率为50％；当浓度为0.5mg/L时，20份阳性检出率为100％。因此，该检测装置非那西丁的检出限为0.5mg/L；当贝诺酯浓度为0.5mg/L时，20份样品阳性检出率为50％；当浓度为1.0mg/L时，20份阳性检出率为100％。因此，该检测装置中贝诺酯的检出限为1.0mg/L。

实施例9苯胺类解热镇痛药物胶体金检测装置的特异性检测

在阴性样品试液中，分别加入解热镇痛类产品常见非法添加物安乃近、氨基比林、安替比林、阿司匹林、水杨酸、双氯芬酸钠、布洛芬、萘普生、吡罗昔康、美洛昔康、保泰松、醋酸泼尼松、醋酸地塞米松标准溶液，使之浓度为5.0mg/L，检测结果见表2。

表2交叉反应验证结果

从表2可以看出，只有加入苯胺类解热镇痛药物(对乙酰氨基酚、非那西丁、贝诺酯)的样品能够检出，而加入吡唑酮类解热镇痛药物(安乃近、氨基比林、安替比林)、水杨酸类解热镇痛药物(阿司匹林、水杨酸)、苯乙酸类解热镇痛药物(双氯芬酸钠)、芳基丙酸类解热镇痛药物(布洛芬、萘普生)、1,2-苯并噻唑类解热镇痛药物(吡罗昔康、美洛昔康)、吡唑烷酮类解热镇痛药(保泰松)、甾体类抗炎药(醋酸泼尼松、醋酸地塞米松)的样品无法检出，说明本检测装置对苯胺类解热镇痛药物的特异性较好，对其它类型解热镇痛药物不存在交叉反应。

实施例10苯胺类解热镇痛药物胶体金检测装置的稳定性检测

在一星期内，非连续的三天时间里，在同一实验室，三名不同实验人员检测同一样品，记录结果，考察产品稳定性。使用经确认的空白阴性样品以及添加检测限水平的加标样品分别测试，每天各测试10份，结果见表3。

表3稳定性考察结果

从表3可以看出，不同时间不同批次检测的检测结果无变化，说明本检测装置的稳定性较好。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。