雌激素相关受体α的编码基因ESRRA的医药用途

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种孤儿核受体，即雌激素相关受体α(Estrogen-related receptorα,ERRα)的编码基因ESRRA在制备预防或治疗肝脏疾病的药物中的应用。

背景技术

基因ESRRA编码的蛋白雌激素相关受体α(ERRα)是一类孤儿核受体。其可以参与许多下游信号分子的转录过程，在调控线粒体合成、氧化代谢和炎症反应中发挥重要作用(Front.Endocrinol.2019,10:206,doi:10.3389/fendo.2019.00206)。首先，ERRα作为线粒体合成及氧化代谢的关键转录因子，其下游靶基因和靶蛋白(包括PGC1α、PDK4和MCAD等)参与线粒体合成以及氧化代谢(Cell Metab.2013,17,586)。其次，ERRα可调控炎症和凋亡抑制因子A20的转录(PNAS 2013,44,17975；Immunity 2015,43,80)。此外，ERRα可以调控自噬发生相关基因的表达(Autophagy 2019,14,152)。然而，ERRα及其基因ESRRA在肝脏疾病中功能及其应用尚不明确。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征(Nat.Rev.Drug.Discov.2016,15,249)。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的疾病谱包括：非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及NASH诱发的肝硬化(Science 2011，332,1519)。公认的NASH的病理机制是“二次打击”假说(J.Gastroenterol.Hepatol.2013,28(SI 1),68)：“第一次打击”是肝脏脂肪堆积和胰岛素抵抗；“第二次打击”是肝脏脂肪堆积引发的氧化应激和炎性细胞因子的过度释放，导致肝脏炎症和肝纤维化，进而导致肝硬化和肝癌。目前，针对NASH尚无有效的临床治疗手段(Med.Res.Rev.2019,39,328)。有文献报道ERRα敲除鼠可以防止高脂饮食诱导的NAFLD(Endocrinology 2018,159,2153)，且抑制ERRα可增强胰岛素的敏感性并具有降血糖作用(J.Med.Chem.2011,54,788；Eur.J.Med.Chem.2017,138,830)。总之，ERRα在NASH发生发展中的作用尚不明确。

原发性胆汁性胆管炎(PBC)又称原发性胆汁性肝硬化，是器官特异性的慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病。该病以肝内胆汁淤积、循环血液中出现抗线粒体抗体和肝内小胆管进行性、非化脓性炎症性破坏，最终导致广泛性肝管破坏、胆汁性肝硬化甚至肝衰竭为显著特征。约90％患者为女性，发病年龄30～65岁，30％～50％无症状患者通常在常规检查中被发现。目前，已批准上市的治疗PBC的药物主要包括熊去氧胆酸、奥贝胆酸、糖皮质激素和环孢素等，然而，上述药物的有效性和安全性都存在问题。另一方面，ERR在PBC发生发展中的作用与功能尚不明确(J.Clin.Pathol.2014,67,566)。

原发性硬化性胆管炎(PSC)也是一种慢性胆汁淤积性疾病，其特征为肝内外胆管进行性炎症和纤维化，进而导致多灶性胆管狭窄。大多数患者最终发展为肝硬化、门静脉高压和肝功能失代偿。PSC的确切病理机制不明，可能有以下因素参与：(1)由于PSC与溃疡性结肠炎(一种自身免疫性疾病)关系密切，提示PSC可能存在自身免疫过程；(2)慢性或反复的细菌进入门脉循环可以诱发肝脏及胆管的炎症反应。此外，结肠细菌或慢性病毒感染造成毒性胆汁酸积聚，也可以导致肝脏损伤；(3)亦可能发生胆管的缺血性损伤。目前，针对PSC尚无有效的治疗药物。

酒精性脂肪性肝病(AFLD)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，是酒精性肝病中的一个分型。患者有长期饮酒史，一般超过5年。临床症状为非特异性，可无症状，或有右上腹胀痛、食欲不振、乏力、体重减轻等。目前，针对AFLD尚无有效的治疗药物。现有的治疗手段包括：S-腺苷蛋氨酸治疗可以改善AFLD患者的临床症状和生物化学指标；多烯磷脂酰胆碱对AFLD患者有防止组织学恶化的趋势；甘草酸制剂、水飞蓟素类、多烯磷脂酰胆碱和还原型谷胱甘肽等药物有不同程度的抗氧化、抗炎、保护肝细胞膜及细胞器等作用，临床应用可改善肝脏生物化学指标。

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。目前，抗肝纤维化仍然缺乏有效的治疗手段，现有的治疗方法主要包括：(1)针对原发病去除致病因素，如抗乙型肝炎、丙型肝炎病毒治疗，抗血吸虫治疗，戒酒等；(2)针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞的增生活化，以及促进胶原降解等。

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。在我国大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化、NASH诱发的肝硬化、胆汁淤积性肝硬化和血吸虫性肝硬化等。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。早期由于肝脏代偿功能较强可无明显症状，后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多系统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发症。肝硬化是因组织结构紊乱而致肝功能障碍，目前尚无根治办法，主要在于早期发现和阻止病程进展，尤其是要防治肝硬化的并发症。

发明内容：

本发明目的：为解决现有防治肝脏疾病的临床治疗手段的缺陷和不足，本发明在揭示ESRRA基因的表达与肝脏疾病之间相互关系的基础上，提供一种雌激素相关受体α(ERRα)的编码基因ESRRA在制备预防或治疗肝脏疾病的药物中的用途，即一种用于预防或治疗肝脏疾病的ESRRA基因的用途，进而把ESRRA基因应用于肝脏疾病的预防或治疗中。

本发明还提供一种预防或治疗肝脏疾病的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明提供雌激素相关受体α(ERRα)的编码基因ESRRA在制备预防或治疗肝脏疾病的药物中的用途。

所述基因ESRRA在NCBI上的基因编号为：Gene ID 2101。

所述肝脏疾病包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、酒精性脂肪性肝病、肝纤维化或肝硬化。

所述药物是能够提高ERRα表达量的生物制剂。

作为优选，所述ERRα编码基因ESRRA通过调控线粒体合成和氧化代谢的关键转录因子，即高表达ERRα可促进脂肪酸的氧化代谢，进而降低肝脏的脂质堆积，因而可用于制备预防或治疗肝脏脂质堆积相关疾病的药物。

作为优选，所述ERRα编码基因ESRRA通过调控自噬相关基因的表达，产生保护性自噬/线粒体自噬作用，抑制炎症反应和纤维化，因而可用于制备预防或治疗肝脏自噬/线粒体自噬异常、肝脏炎症或肝纤维化相关疾病的药物。

进一步地，所述编码基因ESRRA为腺相关病毒携带ESRRA基因表达ERRα蛋白在制备预防或治疗肝脏疾病的药物中的用途。

更进一步地，如腺相关病毒AAV8载体携带ESRRA基因，可以在肝脏高表达ERRα蛋白，因而可用于制备预防或治疗肝脏疾病的药物中。

本发明还提供一种预防或治疗肝脏疾病的药物组合物，其含有ERRα的编码基因ESRRA作为活性成份和其递送系统。

所述药物组合物的给药方式包括：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷型细菌携带质粒DNA法、逆转录病毒携带目的RNA法、复制缺陷型腺病毒携带目的DNA法、复制缺陷型慢病毒携带目的DNA法、腺相关病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法或蛋白微球制剂皮下注射法。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物的给药方式是复制缺陷型腺病毒携带目的DNA法或腺相关病毒携带目的DNA法。

在某些更优选的实施方案中，所述药物组合物的给药方式是腺相关病毒携带目的DNA法。

本发明意外地发现，在各种肝脏疾病(如NAFLD、NASH、PBC、PSC、肝纤维化和肝硬化等)的体内外模型中，肝细胞或肝组织中的ERRα蛋白水平显著下调，且ERRα蛋白水平下调并不是通过转录水平，而是通过泛素-蛋白酶体途径实现的，也就是说，在肝脏疾病状态下，ERRα蛋白的稳定性显著降低了。在此基础上，本发明惊奇地发现，在动物肝脏高表达ERRα可逆转各种应激损伤导致的肝脏脂质堆积、炎症反应和纤维化，并改善肝脏功能。在作用机制方面，本发明人发现，在各种应激刺激(如：分别用脂多糖、棕榈酸或毒胡萝卜素等刺激肝脏实质细胞)下，细胞中的ERRα蛋白稳定性显著降低，细胞发生凋亡，而高表达ERRα可抑制各种应激刺激导致的细胞凋亡。另一方面，在巨噬细胞中高表达ERRα则可抑制炎症反应。总之，在肝脏高表达ERRα可通过抗凋亡、抗炎和抗纤维化而防治各种肝脏疾病。

有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：

本发明首次发现雌激素相关受体α(ERRα)的编码基因ESRRA在预防或治疗肝脏疾病方面效果显著，主要体现在：在各种急慢性肝损伤模型中，通过给予ERRα的编码基因ESRRA，可上调肝脏ERRα的蛋白水平，进而降低肝脏的脂质堆积，改善肝脏损伤，并减少肝脏炎症反应和纤维化，因而可用于防治各种肝脏疾病。

在作用机制方面，ERRα编码基因ESRRA的作用机制主要包括以下几个方面：(1)ERRα是调控线粒体合成和氧化代谢的关键转录因子，高表达ERRα可促进脂肪酸的氧化代谢，进而降低肝脏的脂质堆积；(2)ERRα可调控自噬相关基因的表达，因而可通过保护性自噬/线粒体自噬而抑制炎症反应和纤维化；(3)ERRα具有抗凋亡作用。

附图说明

图1为棕榈酸刺激后Huh7细胞中ERRα蛋白水平图(Western Blot检测)；

图2为高脂高糖饮食(HFHSD)诱导NASH模型小鼠肝脏的ERRα蛋白水平图(WesternBlot检测)；

图3为小鼠注射携带ERRα的腺相关病毒后肝脏ERRα表达的效应图(Western Blot检测)；

图4为高表达ERRα对高脂高糖饮食(HFHSD)诱导NASH模型小鼠肝脏HE染色图；

图5为高表达ERRα对高脂高糖饮食(HFHSD)诱导NASH模型小鼠肝脏油红染色图；

图6为高表达ERRα对高脂高糖饮食(HFHSD)诱导NASH模型小鼠肝脏TG水平的影响图(n＝10,与AAV8-control ND组相比

图7为高表达ERRα对高脂高糖饮食(HFHSD)诱导NASH模型小鼠血清转氨酶(ALT和AST)水平的影响图(n＝10,与AAV8-control ND组相比

图8为高表达ERRα对高脂高糖饮食(HFHSD)诱导NASH模型小鼠肝脏中炎症因子(TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL10和CXCL16)mRNA表达水平的影响图(n＝10,与AAV8-control ND组相比

图9为高表达ERRα对高脂高糖饮食(HFHSD)诱导NASH模型小鼠肝脏中纤维化相关因子(α-SMA，Col1a1，Col3a1，Loxl2，Timp2)mRNA表达水平的影响图(n＝10,与AAV8-control ND组相比

图10为小鼠注射携带ERRα的腺相关病毒后肝脏ERRα表达的效应图(Q-PCR检测)；

图11为高表达ERRα对胆管结扎(BDL)诱导胆汁淤积性肝纤维化小鼠肝脏中纤维化相关因子(α-SMA，Col1a1，Col3a1，Loxl2，TGFβ1)mRNA表达水平的影响图(n＝6，与AAV8-control Sham组相比

图12为胆管结扎(BDL)诱导胆汁淤积性肝纤维化小鼠中，假手术+对照病毒组，假手术+高表达组，胆管结扎+对照病毒组和胆管结扎+高表达组肝脏的天狼猩红切片结果；

图13为高表达ERRα对CCl

图14为高表达ERRα对CCl

具体实施方式

以下将根据具体的实施例来描述本发明。然而，本发明不受到这些实施例的限制。

实施例1

棕榈酸诱导Huh7细胞中ERRα水平的下调

采用Western Blot方法检测棕榈酸刺激下Huh-7细胞中ERRα蛋白的水平。

细胞培养条件：Huh-7细胞：DMEM完全培养基(含10％胎牛血清和1％streptomycin/penicillin)在5％CO2的37℃培养箱中培养。

抗体：anti-ERRα(Abcam)

细胞实验：取活细胞比例90％以上的细胞进行实验。在3.5cm细胞培养皿中，将Huh-7细胞按照25万每皿铺板，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，12h后，弃去原先培养基。实验组加入含有1.5mM棕榈酸的培养基溶液，并于刺激3h，6h，9h和12h后收取培养皿，冻存于-80℃冰箱；对照组加入含有相应浓度脱脂牛血清白蛋白的培养基溶液，并于12h后收取培养皿，冻存于-80℃冰箱。

Western Blot实验：取出冻存于-80℃冰箱的细胞培养皿，加入150μL裂解液，冰上裂解10min，将裂解液转移至1.5mL离心管中，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上清110μL至干净EP管中，取出10μL用于BCA蛋白定量，其余的蛋白上清中加入25μL的5*loading buffer煮沸变性，后续进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转印到PVDF膜上，再进行相关抗体的孵育和洗脱，最后采用化学发光仪进行成像分析。

实验结果：如图1所示，棕榈酸可以时间依赖的下调Huh7细胞中ERRα的蛋白水平。

实施例2

高脂高糖饮食(HFHSD)诱导的小鼠NASH模型中肝脏ERRα水平下调

动物：雄性C57BL/6J小鼠10只，SPF级，4周龄，购于北京维通利华。所有动物保持12小时交替的昼夜节律，自由饮食。

试剂：高脂高糖饲料(含40％脂肪和20％果糖)，-购自江苏南通特洛菲饲料科技有限公司；对照饲料-购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

实验过程：

小鼠按体重随机分成2组，对照饲料组(ND)和高脂高糖饲料组(HFHSD)。小鼠适应性喂养1周后，对照饲料组给予对照饲料喂饲，高脂高糖饲料组给予高脂高糖饲料喂养。这期间每周对小鼠称重，仔细观察并记录其体重、毛发、粪便及活动情况。20周后，处死小鼠，取出肝脏分成3份，液氮速冻。取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的组织裂解液约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解30min；4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上清170μL至干净EP管中，取出10μL用于BCA蛋白定量，其余的蛋白上清中加入40μL的5*loading buffer煮沸变性，后续进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转印到PVDF膜上，再进行相关抗体的孵育和洗脱，最后采用化学发光仪进行成像分析。

实验结果：如图2所示，高脂高糖饮食诱导的小鼠NASH模型中小鼠肝脏的ERRα蛋白水平显著下调。

通过实施例1和2的体内外实验结果表明在凋亡或代谢性炎症等应激刺激下，肝脏ERRα蛋白水平显著降低。这提示ERRα蛋白水平的下调在各种肝脏疾病发生发展中发挥重要作用。

实施例3

肝脏高表达雌激素相关受体α对高脂高糖饮食(HFHSD)诱导的小鼠NASH模型的保护作用

动物：雄性C57BL/6J小鼠40只，SPF级，4周龄，购于北京维通利华。所有动物保持12小时交替的昼夜节律，自由饮食。

仪器：动物体重秤；切片机；全自动生化分析仪；显微镜

试剂：AAV8-Esrra(为腺相关病毒AAV8载体携带鼠源的Esrra基因，可以在小鼠肝脏表达ERRα蛋白)腺相关病毒-购自上海汉恒生物科技有限公司；AAV8-control腺相关病毒-购自上海汉恒生物科技有限公司；高脂高糖饲料(含40％脂肪和20％果糖)，-购自江苏南通特洛菲饲料科技有限公司；对照饲料-购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

实验过程：

1、动物分组

小鼠按照体重随机分成4组：对照饲料+对照病毒组(AAV8-control ND)、对照饲料+高表达组(AAV8-Esrra ND)、高脂高糖饲料+对照病毒组(AAV8-control HFHSD)和高脂高糖饲料+高表达组(AAV8-Esrra HFHSD)。

2、造模

小鼠适应性喂养1周后，对照饲料+对照病毒组和对照饲料+高表达组喂以对照饲料，高脂高糖饲料+对照病毒组和高脂高糖饲料+高表达组给予高脂高糖饲料造模。造模4周后，对照病毒组每只小鼠尾静脉注射100μL浓度为1×10

3、取材

提前12小时禁食不禁水，次日上午眼眶取血，处死取肝脏。肝脏右小叶组织用4％多聚甲醛固定，用于HE染色切片。部分肝组织分成3份，液氮速冻，以备后续其他指标检测。

4、生化指标的测定

将全血室温静置2小时，3000rpm离心15分钟，收集血清。取肝脏组织100mg，用0.9mL预冷的生理盐水匀浆，匀浆液4℃，3000rpm离心15分钟，取上清。将两者送江苏省中西医结合医院病理科全自动生化分析仪测定血清中甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的水平，测定肝脏组织匀浆上清中TG和TC水平。

5、肝脏组织切片

将用4％多聚甲醛固定的组织送谷歌生物技术有限公司制作HE染色切片、油红染色切片。

6、肝脏组织蛋白的提取及Western Blot(WB)检测

取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的组织裂解液约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解30min；4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上清170μL至干净EP管中，取出10μL用于BCA蛋白定量，其余的蛋白上清中加入40μL的5*loading buffer煮沸变性，后续进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转印到PVDF膜上，再进行相关抗体的孵育和洗脱，最后采用化学发光仪进行成像分析。

7、肝脏组织RNA的提取及q-PCR检测

取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的Trizol试剂约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解15min，加入100μL氯仿后剧烈震摇15s，在冰上放置10min后4℃，12000rpm离心15min。转移上层水相至干净的1.5mL EP管中，加入200μL异丙醇沉淀RNA，冰上放置10min后，4℃，12000rpm离心10min。弃去上清液，将沉淀用75％乙醇洗涤一遍，离心后去除上清，用40μL DEPC处理水溶解RNA沉淀。用Nano进行RNA浓度定量，并按说明书加入Takara公司的逆转录试剂，使用普通PCR仪将mRNA逆转录成cDNA。最后，在q-PCR专用96孔板中分别加入目的基因(Tnf，Ccl2，Ccl3，Ccl4，Ccl5，Cxcl10，Cxcl16，Acta2，Col1a1，Col3a1，Loxl2和Timp2)的上下游引物(引物序列查自PrimerBank)、q-PCR试剂(SYBR Green)以及cDNA，使用q-PCR仪进行扩增和定量。选用ΔΔCt值来表征基因表达的差异，并采用GraphPad Prism 7软件进行数据处理以及统计学检验。

8、实验结果

图3结果表明，相较于注射AAV8-control腺相关病毒，注射AAV8-Esrra腺相关病毒可以增加对照饲料组和高脂高糖饲料组小鼠肝脏组织中ERRα的蛋白表达量。图4和图5的结果表明，肝脏高表达ERRα可以明显减少高脂高糖饲料喂养小鼠的肝脏脂肪泡的形成，减少肝脏脂滴的聚集。根据图6的实验结果，给予高脂高糖饲料喂养后，肝脏的TG含量增加至与对照饲料组相比约3倍，而高脂高糖饲料+高表达ERRα组相较于高脂高糖饲料+对照病毒组，肝脏TG的含量显著地下降。

为进一步检测肝脏高表达ERRα对降低NASH动物肝脏损伤、肝脏炎症反应和纤维化的效应，测定了血清中转氨酶的含量和肝脏中炎症因子的mRNA表达情况。图7的结果表明，肝脏高表达ERRα可以显著抑制由于高脂高糖喂养导致的ALT和AST的升高，因此认为高表达ERRα可以有效地抵抗高脂高糖喂养诱导的肝脏损伤。图8的结果表明，肝脏高表达ERRα可以显著抑制由于高脂高糖喂养导致的TNFα、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL10和CXCL16的mRNA表达水平的升高，因此认为高表达ERRα能够有效地抵抗高脂高糖喂养诱导的肝脏炎症反应。根据图9的实验结果，肝脏高表达ERRα可以显著地降低由于高脂高糖饲料喂养导致的α-SMA、Col3a1和Loxl2的mRNA表达水平的升高，因此认为高表达ERRα能够有效地抵抗高脂高糖喂养诱导的肝脏纤维化。

以上结果表明，注射携带Esrra基因的腺相关病毒可以在肝脏高表达ERRα，进而有效地降低高脂高糖饮食诱导的小鼠肝脏的脂质堆积，抑制炎症反应以及肝脏纤维化。因此，通过本发明所述的方法，增加ERRα的表达量可以用于预防和治疗脂肪性肝病(尤其是非酒精性脂肪性肝炎)、慢性肝炎和肝纤维化等慢性肝脏疾病。

实施例4

肝脏高表达雌激素相关受体α对胆管结扎(BDL)诱导胆汁淤积性肝纤维化小鼠的保护作用

动物：雄性C57BL/6J小鼠24只，SPF级，体重30g，购于北京维通利华。所有动物保持12小时交替的昼夜节律，自由饮食。

仪器：动物体重秤；麻醉机；切片机；全自动生化分析仪；倒置显微镜。

试剂：AAV8-Esrra腺相关病毒-购自上海汉恒生物科技有限公司；AAV8-control腺相关病毒-购自上海汉恒生物科技有限公司。

实验过程：

1、动物分组

小鼠按照体重随机分成4组：假手术+对照病毒组(AAV8-control Sham)、假手术+高表达组(AAV8-Esrra Sham)、胆管结扎+对照病毒组(AAV8-control BDL)和胆管结扎+高表达组(AAV8-Esrra BDL)。

2、造模

小鼠适应性喂养1周后，对照病毒组每只小鼠尾静脉注射100μL浓度为1×10

3、取材

提前6小时禁食不禁水，次日上午眼眶取血，处死取肝脏。肝脏右小叶组织用4％多聚甲醛固定，用于HE染色切片。部分肝组织分成3份，液氮速冻，以备后续其他指标检测。

4、肝脏组织切片

将用4％多聚甲醛固定的组织送谷歌生物技术有限公司制作HE染色切片、天狼猩红染色切片。

5、肝脏组织RNA的提取及q-PCR检测

取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的Trizol试剂约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解15min，加入100μL氯仿后剧烈震摇15s，在冰上放置10min后4℃，12000rpm离心15min。转移上层水相至干净的1.5mL EP管中，加入200μL异丙醇沉淀RNA，冰上放置10min后，4℃，12000rpm离心10min。弃去上清液，将沉淀用75％乙醇洗涤一遍，离心后去除上清，用40μL DEPC处理水溶解RNA沉淀。用Nano进行RNA浓度定量，并按说明书加入Takara公司的逆转录试剂，使用普通PCR仪将mRNA逆转录成cDNA。最后，在q-PCR专用96孔板中分别加入目的基因(Esrra，Acta2，Col1a1，Col3a1，Loxl2和Tgfb1)的上下游引物(引物序列查自Primer Bank)、q-PCR试剂(SYBR Green)以及cDNA，使用q-PCR仪进行扩增和定量。选用ΔΔCt值来表征基因表达的差异，并采用GraphPadPrism 7软件进行数据处理以及统计学检验。

6、实验结果

图10结果表明，相较于注射AAV8-control腺相关病毒，注射AAV8-Esrra腺相关病毒可以显著增加假手术组与胆管结扎组肝脏ERRαmRNA的表达量。图11的结果表明，相较于假手术组，胆管结扎后小鼠肝脏纤维化相关基因的表达会明显地升高，而肝脏高表达ERRα可以显著地降低由于胆管结扎导致的肝脏纤维化相关的α-SMA，Col3a1，Loxl2和TGFβ1的mRNA水平的升高，因此认为高表达ERRα能够有效地抵抗胆管结扎诱导的肝脏纤维化。为了进一步明确肝脏高表达ERRα对于胆管结扎导致的小鼠肝脏纤维化的保护作用，对小鼠肝脏进行了天狼猩红染色。图12的天狼猩红染色结果显示，肝脏高表达ERRα可以有效地减少由于胆管结扎导致的肝脏胶原沉积。

以上结果表明，注射携带Esrra基因的腺相关病毒可以在肝脏高表达ERRα，进而有效地降低胆管结扎导致的小鼠肝脏纤维化。因此，通过本发明所述的方法，增加ERRα的表达量可以用于预防和治疗原发性胆汁性肝硬化、肝炎导致的纤维化(病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和酒精性脂肪性肝炎)等肝纤维化及肝硬化相关疾病。

实施例5

肝脏高表达雌激素相关受体α对CCl

动物：雄性C57BL/6J小鼠32只，SPF级，体重25g，购于北京维通利华。所有动物保持12小时交替的昼夜节律，自由饮食。

仪器：动物体重秤；切片机；全自动生化分析仪；倒置显微镜。

试剂：CCl

实验过程：

1、动物分组

小鼠按照体重随机分成4组：溶剂对照+对照病毒组(AAV8-control Con)、溶剂对照+高表达组(AAV8-Esrra Con)、CCl

2、造模

小鼠适应性喂养1周后，对照病毒组每只小鼠尾静脉注射100μL浓度为1×10

3、取材

提前12小时禁食不禁水，次日上午眼球取血，处死取肝脏。肝脏右小叶组织用4％多聚甲醛固定，用于HE染色切片。剩余肝组织分成3份，液氮速冻，以备后续其他指标检测。

4、生化指标的测定

将全血室温静置2小时，3000rpm离心15分钟，收集血清送江苏省中西医结合医院病理科全自动生化分析仪测定血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的水平。

5、肝脏组织切片

将用4％多聚甲醛固定的组织送谷歌生物技术有限公司制作HE染色切片。

6、肝脏组织RNA的提取及q-PCR检测

取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的Trizol试剂约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解15min，加入100μL氯仿后剧烈震摇15s，在冰上放置10min后4℃，12000rpm离心15min。转移上层水相至干净的1.5mL EP管中，加入200μL异丙醇沉淀RNA，冰上放置10min后，4℃，12000rpm离心10min。弃去上清液，将沉淀用75％乙醇洗涤一遍，离心后去除上清，用40μL DEPC处理水溶解RNA沉淀。用Nano进行RNA浓度定量，并按说明书加入Takara公司的逆转录试剂，使用普通PCR仪将mRNA逆转录成cDNA。最后，在q-PCR专用96孔板中分别加入目的基因(Acta2，Col1a1，Col3a1，Loxl2和Tgfb1)的上下游引物(引物序列查自Primer Bank)、q-PCR试剂(SYBR Green)以及cDNA，使用q-PCR仪进行扩增和定量。选用ΔΔCt值来表征基因表达的差异，并采用GraphPad Prism7软件进行数据处理以及统计学检验。

7、实验结果

如图13所示，与溶剂对照组相比，腹腔注射CCl

如图14所示，与溶剂对照组比较，腹腔注射CCl

以上结果表明，注射携带Esrra基因的腺相关病毒可以在肝脏高表达ERRα，进而有效地缓解CCl