纳米卫星复合物
文献发布时间：2023-06-19 12:07:15
本申请要求2018年10月17日提交的美国临时申请序列号62/746,755的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明提供了方法、组合物、系统和试剂盒，其包含纳米卫星复合物，所述纳米卫星复合物包含：核心纳米颗粒复合物，其包含围绕纳米颗粒核心的生物相容性涂层；3-25个卫星颗粒，其附着到或吸收到所述生物相容性涂层；多个抗原肽，其缀合到或吸收到所述卫星颗粒；以及至少一种额外的特性：i)所有所述卫星颗粒与所述纳米颗粒核心的重量比为10-40％；每个所述卫星颗粒的直径为2-20nm；iii)所述卫星颗粒以每平方微米500-20,000个或15,00-30,000个的密度存在；iv)所述多个抗原肽是100-4000个抗原肽；v)所述多个抗原肽中的10-300个存在于每个所述卫星颗粒上；和/或vi)每个所述卫星颗粒之间的平均距离为5-20nm。
背景技术
已知病毒是非常高效的递送媒介物、细胞摄取的介质和有效的免疫剂。因此，在多种生物技术和医学应用中使用病毒和病毒特性已变得合乎需要。然而，传统的减毒活病毒或灭活病毒仍然过于危险而不能以这种方式使用。为了解决这个问题，出现了病毒样颗粒。
病毒样颗粒是基于蛋白质的纳米颗粒，其包含可自组装成几何上刚性的纳米结构的病毒衣壳蛋白，所述纳米结构直接类似于病毒结构，并且无需病毒基因组即可确认。因此，病毒样颗粒被认为是传统病毒的可行且安全的替代品。尽管具有此优点，然而病毒样颗粒技术的许多明显缺点(包括依赖于蛋白质自组装、制造困难、应用通用性有限以及抗载剂反应显著)仍然存在，所述缺点限制了体内重新给药的潜力。由于这些挑战，人们对开发受病毒启发的替代纳米颗粒系统的兴趣日益浓厚。
这些所谓的病毒模拟纳米颗粒是基于对病毒的物理和化学材料特性的理解来进行合理设计和工程化的。最常用于告知病毒模拟纳米颗粒设计的病毒材料特性包括：颗粒大小、颗粒形状、电荷、疏水性、抗原展示、抗原组织、抗原密度和表面拓扑结构。虽然在病毒模拟纳米颗粒的设计、工程化和应用方面取得了许多进步，但是尚没有出现一种普遍适用的纳米颗粒系统。
发明内容
本发明提供了方法、组合物、系统和试剂盒，其包含纳米卫星复合物，所述纳米卫星复合物包含：核心纳米颗粒复合物，其包含围绕纳米颗粒核心的生物相容性涂层；3-25个卫星颗粒，其附着到或吸收到所述生物相容性涂层；多个抗原肽，其缀合到或吸收到所述卫星颗粒；以及至少一种额外的特性：i)所有所述卫星颗粒与所述纳米颗粒核心的重量比为10-40％；每个所述卫星颗粒的直径为2-20nm；iii)所述卫星颗粒以每平方微米500-20,000个或15,00-30,000个的密度存在；iv)所述多个抗原肽是100-4000个抗原肽；v)所述多个抗原肽中的10-300个存在于每个所述卫星颗粒上；和/或vi)每个所述卫星颗粒之间的平均距离为5-20nm。在某些实施方案中，纳米卫星复合物的直径为约20-70nm(例如，约25nm、约40-50nm或约60nm)。
在某些实施方案中，本文提供了组合物，其包含纳米卫星复合物，其中所述纳米卫星复合物包含：a)核心纳米颗粒复合物，其包含围绕纳米颗粒核心的生物相容性涂层；b)3-25个(例如3个、7个、13个、17个、21个或25个)卫星颗粒，其附着到或吸收到所述生物相容性涂层；c)多个抗原肽(例如，来自表4或表1、表2或表3)或多个半抗原，其缀合到或吸收到所述卫星颗粒；并且d)其中所述纳米卫星复合物包含以下特性中的至少一种(例如，1种、2种、3种、4种、5种或6种)：i)所述卫星颗粒与所述纳米颗粒核心的重量比为10-40％(例如，10％、20％、30％或40％)；ii)每个所述卫星颗粒的直径为2-20nm(例如2nm、5nm、8nm、13nm、17nm、20nm)；iii)所述卫星颗粒以每平方微米500-20,000个(例如，每平方微米500个、1000个、4000个、8000个、13,000个、17,000个或20,000个)的密度存在；iv)所述多个抗原肽或多个半抗原是100-4000个(例如，100个、500个、1000个、2000个、3000个或4000个)抗原肽；v)所述多个抗原肽或所述多个半抗原中的10-300个(例如，10个、40个、100个、175个、225个或300个)存在于每个所述卫星颗粒上；并且vi)每个所述卫星颗粒之间的平均距离为5-20nm(例如，5.0nm、6.5nm、7.5nm、10nm、13nm、17nm或20nm)。
在某些实施方案中，本文提供了组合物、试剂盒和系统，其包含纳米卫星复合物，其中所述纳米卫星复合物包含：a)核心纳米颗粒复合物，其包含围绕纳米颗粒核心的生物相容性涂层(例如，其中所述纳米颗粒核心直径为约12-18nm)；b)10-20个卫星颗粒，其附着到或吸收到所述生物相容性涂层；c)多个抗原肽(例如，来自表4或表1、表2或表3)，其缀合到或吸收到所述卫星颗粒；并且d)其中所述纳米卫星复合物包含以下特性中的至少一种：i)所有所述卫星颗粒与所述纳米颗粒核心的重量比为10-40％(例如，10％、20％、30％、40％)；ii)每个所述卫星颗粒的直径为1-5nm(例如，约1nm、2nm、3nm、4nm或5nm)；iii)所述卫星颗粒以每平方微米15,00-30,000个(例如，15,000个、18,000个、21,000个、25,000个、28,000个或30,000个)的密度存在；iv)所述多个抗原肽是1500-3000个(例如，约1500个、1900个、2200个、2300个、2600个、3000个)抗原肽；v)所述多个所述抗原肽中的100-400个(例如，100个、200个、250个、300个、400个)存在于每个所述卫星颗粒上；并且vi)每个所述卫星颗粒之间的平均距离为4-7nm(例如4.0nm、5.0nm、5.2nm、5.9nm、6.1nm或7.0nm)。
在一些实施方案中，本文提供了试剂盒和系统，其包含：a)核心纳米颗粒复合物，其包含围绕纳米颗粒核心的生物相容性涂层；b)3-25个卫星颗粒，其配置为附着到或吸收到所述生物相容性涂层；c)多个抗原肽或多个半抗原，其配置为缀合到或吸收到所述卫星颗粒；以及d)以下中的至少一种：i)所有所述卫星颗粒与所述纳米颗粒核心的重量比为10-40％；ii)每个所述卫星颗粒的直径为2-20nm；并且iii)所述多个抗原肽或多个半抗原是100-4000个抗原肽。
在特定实施方案中，本文提供了引发受试者的免疫反应的方法，其包括：向受试者施用如本文所述的组合物，使得产生针对抗原肽或半抗原的抗体。在某些实施方案中，所述受试者是人。在其他实施方案中，所述受试者是动物(例如，狗、猫、猪、马等)。在额外的实施方案中，所述方法还包括从所述受试者获取样品，并从所述样品纯化一些抗体。在额外的实施方案中，没有佐剂作为组合物的一部分或以其他方式施用。在一些实施方案中，所述受试者以组合物的形式或单独地施用I型干扰素激动剂。在其他实施方案中，所述受试者以组合物的形式或单独地施用免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，抗原肽包含B细胞表位、或T细胞表位、或两者(参见例如，表4或表1、表2或表3)。在其他实施方案中，纳米卫星复合物在所述受试者中不产生针对所述纳米卫星复合物的可检测非特异性抗体。在其他实施方案中，纳米卫星复合物(例如，以等于病毒的水平)归巢于所述受试者的淋巴结。在其他实施方案中，纳米卫星复合物归巢于所述受试者淋巴结的B细胞区或T细胞区。在其他实施方案中，纳米卫星复合物以等于病毒的速率被所述受试者的被膜下淋巴窦巨噬细胞吸收。
在某些实施方案中，卫星颗粒包含金。在其他实施方案中，核心纳米颗粒包含Fe
在一些实施方案中，3-25个卫星颗粒是10-15个卫星颗粒。在其他实施方案中，至少一种特性是所有卫星颗粒与纳米颗粒核心的重量比为10-40％(例如，约30％)。在额外的实施方案中，所有卫星颗粒与纳米颗粒核心的重量比为25-35％。在某些实施方案中，所有卫星颗粒与纳米颗粒核心的重量比为29-31％。
在一些实施方案中，至少一种特性是每个卫星颗粒的直径为2-20nm。在某些实施方案中，每个卫星颗粒的直径为5-15nm。在其他实施方案中，每个卫星颗粒的直径为4-6nm。
在特定实施方案中，至少一种特性是卫星颗粒以每平方微米500-20,000个的密度存在。在其他实施方案中，卫星颗粒以每平方微米13,000至17,000个的密度存在。
在一些实施方案中，至少一种特性是多个抗原肽是100-4000个抗原肽或100-4000个半抗原。在其他实施方案中，多个抗原肽是1500-2500个抗原肽，或者多个半抗原是1500-2500个半抗原。
在其他实施方案中，至少一种特性是多个抗原肽或半抗原中的10-300个存在于每个卫星颗粒上。在其他实施方案中，多个抗原肽或半抗原中的225-275个存在于每个卫星颗粒上。
在一些实施方案中，至少一种特性是每个卫星颗粒之间的平均距离为5-20nm。在某些实施方案中，每个卫星颗粒之间的平均距离为6-8nm。
在其他实施方案中，至少一种特性是所述特性中的至少两种或三种。在一些实施方案中，至少一种特性是所述特性中的至少四种或五种。在额外的实施方案中，至少一种特性是所述特性中的所有六种。
在某些实施方案中，抗原肽包含：i)新抗原决定簇；ii)来自肿瘤抗原的至少一个表位；iii)来自病毒癌蛋白的至少一个表位；iv)来自感染性病毒的至少一个表位；v)来自寄生虫的至少一个表位；或vi)来自感染性细菌的至少一个表位。在其他实施方案中，所述组合物、系统和试剂盒还包含生理相容性水性溶液和/或癌细胞和/或抗原呈递细胞。
在一些实施方案中，多个抗原肽不均匀地分布在卫星颗粒上。在其他实施方案中，纳米卫星复合物的直径为50-100nm(例如，55-65nm)。在其他实施方案中，纳米卫星复合物的表面带负电(例如，-10mV至-20mV)。在其他实施方案中，核心纳米颗粒的直径为10-25nm(例如，15-20nm)。
在一些实施方案中，所述组合物还包含I型干扰素激动剂。在其他实施方案中，I型干扰素激动剂被静电吸引或吸收到i)抗原肽或半抗原、ii)多个卫星颗粒和/或iii)核心纳米颗粒。在额外的实施方案中，所述组合物不含佐剂。在额外的实施方案中，所述组合物还包含免疫检查点抑制剂。
在其他实施方案中，抗原肽包含至少一种新抗原决定簇，包括例如致癌病毒抗原决定簇。在一些实施方案中，抗原肽包含至少一种来自肿瘤抗原的表位，包括病毒癌蛋白。在某些实施方案中，抗原肽包含来自感染性病毒的至少一个表位、来自寄生虫的至少一个表位和/或来自感染性细菌的至少一个表位。用于免疫受试者(例如，人受试者)的来自病毒、寄生虫和细菌的合适抗原是本领域众所周知的(参见例如表2和表3)。用于疫苗的额外的抗原正在开发中，所述疫苗包括例如：腺病毒疫苗、柯萨奇(Coxsackie)B病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、登革热疫苗、东部马脑炎病毒疫苗、埃博拉疫苗、肠病毒71疫苗、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)疫苗、丙型肝炎疫苗、HIV疫苗、HTLV-1T淋巴细胞白血病疫苗、马尔堡(Marburg)病毒病疫苗、诺如病毒(Norovirus)疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗、严重急性呼吸系统综合征(SARS)疫苗、西尼罗河病毒疫苗、寨卡热(Zika fever)、龋病疫苗、埃立克体病(Ehrlichiosis)疫苗、麻风病疫苗、莱姆(Lyme)病疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、化脓性链球菌疫苗、梅毒疫苗、土拉菌病(Tularemia)疫苗、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)疫苗、疟疾疫苗、血吸虫病疫苗、恰加斯(Chagas)病疫苗、钩虫疫苗、人类盘尾丝虫病河盲症疫苗、锥虫病疫苗和内脏利什曼病(Visceral leishmaniasis)疫苗。
在某些实施方案中，向受试者施用本文的纳米卫星复合物的方法杀伤至少一些癌细胞且/或调节所述受试者的抗原特异性免疫反应。在其他实施方案中，癌细胞来自选自由以下组成的组的癌症类型：头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、HPV阳性癌症、牙源性肿瘤、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、白血病、黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。在额外的实施方案中，癌细胞是受试者的肿瘤的一部分。在其他实施方案中，肿瘤是低免疫原性“冷”肿瘤，其特征在于对肿瘤特异性免疫的引发不足以及对免疫原性细胞毒性具有抗性。
在某些实施方案中，纳米卫星复合物还可用作光热剂和/或MRI造影剂。
在某些实施方案中，I型干扰素激动剂包括I型干扰素信号传导衔接子蛋白的活化剂、干扰素基因的刺激物(STING)(包括选自c-di-GMP、c-di-AMP和cGAMP的环二核苷酸)或其类似物。在其他实施方案中，STING激动剂选自由以下组成的组：c-di-IMP、c-di-UMP和5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、2'3'-cGAM(PS)
在某些实施方案中，所述受试者是人或其他哺乳动物。在一些实施方案中，所述方法包括将前述纳米卫星复合物与向受试者施用免疫检查点抑制剂组合。这些免疫检查点抑制剂可包括单克隆抗体，诸如抗PD-L1、抗CLTA-4或抗PD-1。在其他实施方案中，免疫检查点抑制剂选自：YERVOY(依匹单抗(ipilimumab))、KEYTRUDA(派姆单抗(pembrolizumab))、OPDIVO(纳武单抗(nivolumab))和TECENTRIQ(阿替利珠单抗(atezolizumab))。
在一些实施方案中，核心包括选自以下的材料：近红外光热剂材料和MRI造影剂材料，并且至少一个卫星颗粒包括近红外光热剂材料、MRI造影剂材料和近红外光学染料材料。在额外的实施方案中，纳米颗粒核心包含选自由以下组成的组的材料：Fe
在实施方案中，纳米颗粒核心包含Fe
在另外的实施方案中，核心纳米颗粒包含选自由以下组成的组的第一类型的材料：Fe
在一些实施方案中，每个卫星颗粒的直径大小在0.5nm与25nm之间(例如0.5nm、1.5nm、10nm、15nm、20nm.、23nm和25nm)。在其他实施方案中，卫星颗粒的直径大小在2nm与7nm之间(例如，约5nm或约2-4nm)。在其他实施方案中，纳米颗粒核心的直径大小在35nm与100nm之间。在另外的实施方案中，纳米卫星复合物以1.0mg/mL与5.0mg/mL之间(例如1.0mg/ml、3.3mg/ml和5.0mg/ml)的浓度存在于所述组合物中。在其他实施方案中，生物相容性涂层包含选自由以下组成的组的材料：人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇、三嵌段共聚物、PEO-b-PPO-b-PEO(F121)、PEO-b-PVP、糖基化的聚(五氟苯乙烯)、壳聚糖、二氧化硅和阿拉伯胶、葡萄糖酸、乳糖酸、聚丙烯酸、磷灰石和酪蛋白。在额外的实施方案中，生物相容性涂层用硫醇基或胺基团进行官能化。具体地，可以使用硅氧烷分子，像使用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)来在纳米颗粒表面上产生硫醇基，或使用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷来在纳米颗粒表面上产生胺基团，以对聚合物涂覆的纳米颗粒进行官能化。
在一些实施方案中，向受试者施用纳米卫星复合物在受试者中产生多个核心-卫星纳米复合物浸渍的癌细胞。在另外的实施方案中，所述方法包括：使受试者经历光热疗法和/或成像，其中所述光热疗法：A)包括使用发射电磁辐射的治疗装置，并且B)使至少一部分核心-卫星纳米复合材料浸渍的癌细胞被破坏或杀伤；并且其中所述成像：A)包括使用配置用于MRI/NMR检测和/或光学检测的成像装置，并且B)使至少一部分核心-卫星纳米复合材料浸渍的癌细胞离体可视化。
附图说明
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图1上部示出了用于产生示例性无机病毒样纳米颗粒(IVLN)空白和IVLN-肽复合物的简化示意图。图1下部示出了用于产生脂质涂覆的氧化铁纳米颗粒(脂质-IONP)的简化示意图，所述纳米颗粒在实施例1中用作对照。
图2a示出了IVLN的配制条件和氧化铁纳米颗粒核心上的卫星颗粒的负载效率。图2b示出了在不同配制条件下IVLN的TEM成像。图2c示出了在不同配制条件下，卫星之间距离的数学建模。图2d示出了在不同配制条件下，纳米颗粒表面上的卫星密度的数学模型建模。图2e示出了IVLN表面上的肽负载和对卫星的负载特异性。图2f示出了在配制的不同阶段，IVLN的体积加权流体动力学颗粒分布。
图3示出了实施例1使用IVLN-肽在小鼠中产生抗原特异性抗体的结果。图3a示出了实验时间线和免疫接种时间表。图3b示出了第1次加强后第10天，不同IVLN配制条件和肽密度下的抗原特异性IgG效价。图3c示出了IVLN对可溶性和纳米颗粒型对照的抗体定量和抗原特异性IgG效价。
图4a示出了基于使用ICP-MS进行的离体定量，定量为初始铁剂量的百分比的纳米颗粒向淋巴结的递送效率和动力学。图4b示出了基于离体IVIS成像，3小时肽向淋巴结递送的半定量分析。图4c示出了3小时在体内纳米颗粒到淋巴结中的淋巴细胞和抗原呈递细胞的分布。图4d示出了在体外纳米颗粒的细胞摄取。
图5示出了ERBB2/HER2蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，其中已鉴定的T细胞表位或HLA配体以灰色阴影突出显示，如肿瘤T细胞抗原数据库TANTIGEN所提供。
图6示出了示例性纳米卫星复合物，其中标记了各种示例性参数。
图7示出，在某些实施方案中，无机病毒样纳米卫星(IVLN)具有三种类似于病毒的刺突抗原S蛋白(peplomer)的重要特征：刺突抗原簇拓扑结构、抗原簇之间的最佳距离(5nm)以及刺突上的局部高抗原密度。(A)通过(1)经由金-硅氧烷相互作用(IVLN)将AuNP自组装到聚合物涂覆的IONP表面，然后(2)经由金-硫醇键将末端半胱氨酸修饰的HER2肽缀合至IVLN来逐步产生肽官能化的无机病毒样纳米颗粒(IVLN-HER2)的示意图。(B)通过ICP-MS测量的每个氧化铁纳米颗粒(IONP)核心的金纳米颗粒(AuNP)负载。数据代表平均值±SD，n≥6；使用线性回归模型拟合曲线，R
图8示出了来自实施例2的数据，其表明所测试的IVLN-HER2增强了抗原特异性抗体产生。(A)动物研究免疫接种和分析取样时间线。(B)在第38天并且在5μg HER2肽+10μgcGAMP作为佐剂下，来自BALB/c小鼠的血清的非特异性总IgG和抗原特异性抗体效价(IgG、IgG1和IgG2a)的定量。(C)在第38天并且在50μg HER2肽+10μg cGAMP作为佐剂下，来自BALB/c小鼠的血清的非特异性总IgG和抗原特异性抗体效价(IgG、IgG1和IgG2a)的定量；数据代表平均值±SE，n＝5。数据代表平均值±SE，n＝5。统计比较基于单因素ANOVA，然后是事后Tukey氏成对比较。星号表示在*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001水平下的统计显著性。ANOVA，方差分析；SE，标准误差；n.s.，无统计显著性。
图9示出了实施例2的结果，包括具有以下特性的IVLN的结果：针对HER2特异性IgG的产生的抗原簇(14个簇)、抗原簇之间的距离(5-6nm)以及局部抗原密度(2000个肽/IVLN，约150个肽/AuNP)。(A)小鼠的免疫接种时间表。(B)通过ELISA的抗原特异性IgG抗体的定量，以抗体效价表示；数据代表平均值±SE，n＝5。统计比较基于单因素ANOVA，然后是事后Tukey氏成对比较。星号表示在*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001水平下的统计显著性。ANOVA，方差分析；SE，标准误差。
图10示出，与IONP-HER2相比，实施例2中测试的IVLN-HER2使Ag特异性B细胞活化和GC形成增加了6倍。(A)使用B细胞受体四聚体染色的鉴定为CD19
图11示出了实施例2的结果，其表明免疫细胞的CyTOF分析显示了IVLN-HER2促进淋巴结中的Tfh依赖性B细胞活化。第一次免疫接种后38天(第二次加强后10天)，对淋巴结中的免疫细胞进行CyTOF分析。(A，B)使用SPADE无监督聚类分析的整体分析。节点包含具有类似标志物表达的细胞。基于与IONP-HER2或HER2相比，IVLN-HER2样品中那个节点内的相对细胞数是较高(蓝色)还是较低(红色)来对节点进行着色。(D)单独用INLN-HER2、INOP-HER2和HER2肽免疫的小鼠淋巴结中的生发中心B细胞(CD19+/GL7+或B220+/GL7+)的频率。(D)用INLN-HER2、INOP-HER2和HER2肽免疫的小鼠淋巴结中的CD4+ T滤泡辅助性T细胞(CD4+/CXCR5+/PD-1+)的频率。(E)用INLN-HER2、INOP-HER2和HER2肽免疫的小鼠淋巴结中的浆细胞的频率。(50ug HER2肽，10ug cGAMP)。
图12示出了来自实施例2的结果，其表明与IONP-HER2相比，IVLN-HER2改善了淋巴结递送和B细胞区分布。(A)在指定的时间间隔内纳米颗粒向施用部位同侧淋巴结(腘+腹股沟)递送的定量，表示为使用ICP-MS递送的初始氧化铁百分比；数据代表平均值±SE，n＝3。(B)施用Cy5.5标记的可溶性HER2肽、IONP-HER2-Cy5.5和IVLN-HER2-Cy5.5后3小时获得的肽向淋巴结递送的代表性离体IVIS荧光图像和半定量分析(腘(上)+腹股沟(下))(Ex/Em＝675/720nm，曝光＝0.5s)。彩色条代表平均辐射效率(p/s/cm
图13示出了来自实施例2的结果，其表明IVLN-HER2诱导的HER2特异性抗体具有抑制HER2+癌症的功能。(A)动物研究免疫接种和HER2
具体实施方式
本发明提供了方法、组合物、系统和试剂盒，其包含纳米卫星复合物，所述纳米卫星复合物包含：核心纳米颗粒复合物，其包含围绕纳米颗粒核心的生物相容性涂层；3-25(或2-35)个卫星颗粒，其附着到或吸收到所述生物相容性涂层；多个抗原肽(或带有载剂的半抗原)，其缀合到或吸收到所述卫星颗粒；以及至少一种额外的特性：i)所有所述卫星颗粒与所述纳米颗粒核心的重量比为10-40％；每个所述卫星颗粒的直径为2-20nm；iii)所述卫星颗粒以每平方微米500-20,000个或15,00-30,000个的密度存在；iv)所述多个抗原肽是100-4000个抗原肽；v)所述多个抗原肽中的10-300个存在于每个所述卫星颗粒上；和/或vi)每个所述卫星颗粒之间的平均距离为5-20nm。在某些实施方案中，纳米卫星复合物具有带有病毒样抗原斑块距离的病毒样拓扑和3D斑块拓扑。
病毒是自然界中最高效的递送媒介物和有效的免疫剂。因此，几十年来，病毒材料特性一直是纳米颗粒设计和工程化的灵感来源。这些所谓的病毒模拟纳米颗粒具有被广泛应用的潜力，包括药物递送、分子成像、癌症免疫疗法和基因转染。然而，迄今为止，这种潜力一直被病毒模拟的选择性材料特性方法所限制。在此，我们证明，病毒模拟纳米颗粒设计的整体方法对于功能功效至关重要。具体地，在一些实施方案中，本文描述了纳米卫星复合物，与传统的纳米颗粒体系相比，其具有独特的表面粗糙度、表位组织和表位密度。在本文实施方案的开发期间进行的工作中，发现在B细胞免疫和淋巴结递送的情况下，这些纳米颗粒特征导致小鼠模型中的抗原特异性IgG抗体产生改善18.5倍(参见实施例1)。从机制上看，显示了，抗体产生的这种显著改善是淋巴结递送改善3倍以及相关免疫细胞群体的保留提高2至3倍的结果，这分别促进了B细胞活化和生发中心形成的增加。
在某些实施方案中，本文的纳米卫星复合物使用混合的Fe@Au核心/卫星纳米颗粒，其中含有聚(硅氧烷)的二嵌段共聚物涂覆氧化铁纳米颗粒核心(例如，IONP，15-20nm)，所述氧化铁纳米颗粒核心将受控量金纳米颗粒(例如，AuNP，2-3nm)锚定在表面。通过这些金纳米颗粒，使用Au-S键以限定的数量和密度缀合半胱氨酸末端修饰的肽。
虽然本公开不限于任何特定机制，但是据信，与传统的病毒模拟纳米颗粒体系相比，本文的纳米卫星纳米颗粒复合物结合了更多生物相关的表面拓扑结构，以及类似于病毒的几何刚度的在空间上限定的并且局部高密度的抗原展示。本文的纳米卫星纳米颗粒可用于大量的生物应用，包括在B细胞免疫情况下的使用。在这种情况下，由于B细胞受体交联改善，这些独特的材料特性将表现为抗原呈递细胞摄取和B细胞免疫增强。
在本文实施方案的开发期间进行的工作中，产生的结果(在实施例1中)表明，纳米卫星复合物可成功地制备为以流体动力学方式每个IONP核心具有10-15个AuNP的约60nm颗粒，这与AuNP之间的距离小于7.5nm(对B细胞受体交联是理想的)有关。此外，本文的纳米卫星复合物可以制备为每个颗粒具有约2,000个肽，并且特定定位于AuNP。
本公开不受纳米卫星复合物中使用的抗原类型的限制。在某些实施方案中，使用B细胞抗原和/或T细胞抗原。在某些实施方案中，使用至少一部分人肿瘤相关抗原。人肿瘤相关抗原(TAA)的实例包括分化抗原(诸如黑素细胞分化抗原)、突变抗原(诸如p53)、过表达的细胞抗原(诸如HER2)、病毒抗原(诸如人乳头瘤病毒蛋白)以及在睾丸和卵巢的生殖细胞中表达，但在正常体细胞(诸如MAGE和NY-ESO-1)中沉默的癌症/睾丸(CT)抗原。在其他实施方案中，使用来自细菌或病毒的抗原。
在某些实施方案中，抗原是从TANTIGEN网站提供的，所述网站提供了肿瘤T细胞抗原的全面数据库(参见Olson等,Cancer Immunol Immunother.2017年3月9日，所述参考以引用的方式整体并入)。下表1提供了抗原的列表，其至少一部分可以与本文提供的纳米卫星复合物一起使用。TANTIGEN网站可用于选择特定抗原的部分(参见“http://projects.met-hilab.org/tadb/index.php”)。例如，关于ERBB2/HER2抗原，TANTIGEN网站显示了此抗原的氨基酸序列，提供了突出显示的、此抗原具有免疫原性的短抗原区域(如图5所示，TANTIGEN登录号为“Ag000001”)。可以在本文所述的复合物中使用此抗原的一个或多个突出显示的区域。使用TANTIGEN网站或类似资源，可以在表1和表4中列出的任何抗原的情况下使用相同的程序。在其他实施方案中，正在进行的癌症深度测序为额外的新抗原发现提供了新工具，其可与本公开一起使用。纳米卫星复合物和/或血清白蛋白载剂-抗原-佐剂复合物不受抗原肽的特定序列的限制。两种体系都提供了特异性调节额外的靶向新抗原的免疫反应的方法、组合物和试剂盒。
表1
在某些实施方案中，本文所述复合物中使用的抗原来自人致癌病毒或肿瘤病毒。与人恶性肿瘤相关的病毒包括：HTLV-1(成人T细胞白血病(ATL)、HPV(宫颈癌、疣状表皮发育不良(EV)患者的皮肤癌、头颈癌和其他肛门生殖器癌)；HHV-8(卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma；KS)、原发性渗出性淋巴瘤和卡斯尔曼氏病(Castleman's disease))、EBV(伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma；BL)、鼻咽癌(NPC)、MCPyV(梅克尔细胞癌(Merkel CellCarcinoma))、移植后淋巴瘤和霍奇金氏病(Hodgkin's disease))、HBV和HCV(肝细胞癌(HCC))。此外，可能在人恶性肿瘤中起作用的病毒包括：猿猴空泡病毒40(SV40)(脑癌、骨癌和间皮瘤)、BK病毒(BKV)(前列腺癌)、JC病毒(JCV)(脑癌)、人内源性逆转录病毒(HERV)(生殖细胞肿瘤、乳腺癌、卵巢癌和黑素瘤)、人乳腺肿瘤病毒(HMTV)(乳腺癌)和(vi)细环病毒(Torque teno virus；TTV)(胃肠道癌、肺癌、乳腺癌和骨髓瘤)。
在某些实施方案中，来自病毒或细菌的抗原与本文所述的纳米卫星复合物一起使用。此类抗原是本领域众所周知的。下文提供了作为此类众所周知的抗原的来源的病毒(表2)和细菌(表3)的实例。
表2-病毒性疾病
表3-细菌性疾病
实施例
实施例1
用于抗原特异性抗体产生的病毒样纳米颗粒
此实施例描述了产生抗体的病毒样纳米颗粒的生产和使用。
材料：所有试剂均如从商业来源获得那样使用，无需进一步纯化。氧化铁(III)(FeO(OH)，水合，催化剂级，30-50目)、油酸(工业级，90％)、1-十八烯(工业级，90％)、无水四氢呋喃(THF，99.8％)、硫化钠、氯金酸、硫酸铁(II)铵六水合物(Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O，ACS试剂，99％)、硝酸(ACS试剂，70％)和盐酸(ACS试剂，37％)均购自Sigma-Aldrich。小鼠未涂覆的IgG和IgM总ELISA Ready-SET-Go！试剂盒、1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液、HRP缀合的山羊抗小鼠IgG1二抗、HRP缀合的山羊抗小鼠IgG2a二抗、Nunc Immobilizer氨基96孔ELISA板、BupH碳酸氢盐缓冲液包(涂覆缓冲液)、无Pierce蛋白的PBS tween封闭缓冲液、20x PBS-tween洗涤缓冲液、遗传霉素(G418)选择性抗生素、Invitrogen eBioscience可固定生存力染料eFluor 780和Molecular Probes链霉亲和素Alexa Fluor 647缀合物均获自Thermo Fisher Scientific。HRP缀合的山羊抗小鼠IgG二抗、Zombie UV可固定生存力试剂盒、FITC抗小鼠CD19、PE/Dazzle 594抗小鼠CD38、Brilliant Violet 421抗小鼠CD138、PE/Dazzle 594抗小鼠IgD、Alexa Fluor 647抗小鼠/家鼠GL7抗原、BrilliantViolet 421和PE/Dazzle 594抗小鼠/人CD45R/B220、FITC抗小鼠CD95、Brilliant Violet421抗小鼠/人CD11b、FITC抗小鼠CD169、PE/Dazzle 594抗小鼠CD11c均购自BioLegend。定制合成HER2肽(CDDDPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ(SEQ ID NO:1)、生物素-PESFDGDPASNTAPLQPEQLQ(SEQ ID NO:2)、CDDDPESFDGDPASNTAPLQPEQLQGGGK(SEQ ID NO:3))。由氯仿中的油酸稳定的30nm氧化铁纳米颗粒核心购自Ocean Nanotech。DSPE-PEG(2000)和DSPE-PEG(2000)马来酰亚胺均获自Avanti Polar Lipids。2'3'-cGAMP获自InvivoGen。荧光胺购自MP Biomedicals。磺基-Cy5.5 NHS酯获自Lumiprobe。具有凝血因子的Microvette 500Z-Gel血清收集瓶获自Sarstedt。Matrigel基底膜基质购自Corning。金和铁ICP标准品购自Fluka Analytical。
小鼠。所有动物实验均根据密歇根大学动物使用和护理委员会(University ofMichigan Committee on Use and Care of Animals；UCUCA)批准的方案进行。5-7周龄的BALB/小鼠购自Charles River Labs。
细胞。所有细胞均维持在37℃、5％CO
无机病毒样纳米颗粒(IVLN)的配制和表征。IVLN配制如下。
涂覆有含聚硅氧烷的二嵌段共聚物的IONP的合成。在有机溶剂中通过热分解合成球形IONP(直径15nm)。还合成了立方体IONP(边缘长度25nm)。通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合来合成二嵌段共聚物(PEO-b-P
AuNP的合成。通过使用硫化钠(Na
无机病毒样纳米颗粒(IVLN)的合成。通过在4℃下孵育AuNP与聚合物涂覆的IONP来制备IVLN。在典型的实验中，如果没有指定，则将2毫克铁的IONP(0.5mL)与AuNP溶液(分别地，对于球形IONP为6mL并且对于立方体IONP为4mL)混合。过夜孵育后，通过磁体来纯化形成的IVLN以去除未结合的AuNP。
基于建立的方案，使用Perkin-Elmer Nexion 2000，通过电感耦合等离子体质谱对配制的IVLN的最终Au:Fe比率进行定量。使用JEOL3011高分辨率电子显微镜，通过透射电子显微镜(TEM)对IVLN制剂进行成像。使用ImageJ软件对AuNP、IONP和IVLN的真实颗粒大小进行定量。使用动态光散射和相分析光散射，用Malvern Zetasizer Nano-ZS分别评估在25℃下milliQ水中的所有制剂的体积加权流体动力学颗粒大小、多分散指数和ζ电位。
脂质涂覆的氧化铁纳米颗粒制剂(脂质-IONP)。基于先前报道的用于薄膜水合的方法并稍作修改，制备了脂质涂覆的氧化铁纳米颗粒。在轻轻地混合时，将10mg DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺加入到由氯仿中的油酸稳定的1mg 30nm氧化铁纳米颗粒核心中。对所得溶液进行溶剂旋转蒸发以去除所有氯仿并形成薄膜。同时，将此膜和pH 7.4的100mM PBS在烘箱中加热至75℃。达到温度后，将热的PBS快速加入到膜中，并立即剧烈混合以促进薄膜水合。将所得的纳米颗粒溶液储存在4℃以促进脂质自组装。通过使用磁分离器装置在4℃下进行磁分离过夜来去除游离的磷脂。
脂质-IONP-HER2和IVLN-HER2制剂。通过硫醇介导的化学过程将HER2肽缀合至脂质-IONP和IVLN两者。具体地，经由马来酰亚胺化学结构配制脂质-IONP-HER2，并且经由金-硫醇键联配制IVLN-HER2。将HER2肽以在milliQ中过量1.5x的重量比加入到脂质-IONP中，并在4℃下孵育过夜。将HER2肽以在milliQ中过量5x的重量比加入到IVLN-HER2中，并在4℃下孵育过夜。两种材料都可以通过使用磁分离器装置在4℃下进行磁分离过夜或通过在4℃下以10,000x g离心分离30分钟来纯化。
免疫接种和血清收集。在第0天，无论制剂类型如何，均用50μgHER2肽加10μgcGAMP的等同物使小鼠免疫。随后，在第14天，用50％原始剂量的抗原和佐剂两者将小鼠以两周的间隔加强两次(第14天和第28天)。为了评估血清抗体效价，在每次免疫接种后10天(第10、24和38天)通过下颌下穿刺来收集血液。通过使用带有凝血活化剂的Microvette500Ser-Gel收集容器在25℃下以10,000x g离心分离5分钟，来从全血中分离出血清。
酶联免疫吸附测定(ELISA)。基于由ThermoFisher提供的方案，使用小鼠未涂覆的总IgG和总IgM ELISA试剂盒进行总IgG和总IgM抗体的绝对定量。基于先前建立的间接ELISA方案并稍作修改，对抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体效价进行定量。具体地，通过在室温下在暴露于光的情况下过夜孵育，使用Nunc Immobilizer氨基免疫测定板，通过末端胺基团来将HER2肽(200μL，在100mM碳酸盐缓冲液中100ug/mL，pH 9.4)化学缀合至ELISA板。过夜孵育后，将ELISA板用pH 7.4的具有2％Tween-20的100mM PBS洗涤3次。随后，用300μL ELISA封闭剂(无Pierce蛋白的PBS封闭缓冲液)在4℃下将ELISA板封闭过夜。封闭后，将ELISA板洗涤3次。使用pH 7.4的含10％ELISA封闭剂的100mM PBS对含有一抗的血清样品进行连续稀释(10
体内纳米颗粒向淋巴结递送的定量。用以每只小鼠200μg总Fe的脂质-IONP或IVLN-肽，在左肘关节中对小鼠进行皮下注射。在指定的时间间隔，处死小鼠并解剖感兴趣的淋巴结用于离体分析。基于先前报道的方案，使用ICP-MS对纳米颗粒递向淋巴结递送的程度进行定量。
体内肽向淋巴结递送的定量。为了促进肽向淋巴结递送的定量，将赖氨酸末端修饰的HER2肽化学缀合至磺基-Cy5.5 NHS酯。此缀合以磺基-Cy5.5 NHS酯对于HER2肽过量5倍摩尔进行。在初始肽缀合完成后，对IONP-HER2-Cy5.5和IVLN-HER2-Cy5.5进行Cy5.5官能化，以便能够通过磁分离来简易纯化过量的荧光染料。Cy5.5官能化后，如先前所述对小鼠进行注射。3小时后，处死小鼠并解剖感兴趣的淋巴结，用于通过IVIS成像进行离体分析。关于辐射效率，将IVIS成像用于肽递送的半定量。
体外细胞摄取。使用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒，在从鼠脾中分离的RAW264.7巨噬细胞、DC2.4树突状细胞和原代B细胞中评估IVLN-HER2和IONP-HER2细胞的摄取。在空白的RPMI培养基中，在37℃、5％CO
体内细胞摄取。用以每只小鼠200μg总Fe的脂质-IONP或IVLN，在左肘关节中对IVLN-HER-Cy5.5和IONP-HER2-Cy5.5进行皮下注射。在3小时和24小时，处死小鼠并解剖感兴趣的淋巴结，用于通过流式细胞术进行离体分析。通过机械方法解离淋巴结以制备单细胞悬浮液。对淋巴结细胞的单细胞悬浮液进行染色，用于通过使用MoFlo Astrios流式细胞仪的流式细胞术进行分析。第一组是活细胞、B细胞(B220
抗原特异性B细胞和生发中心流式细胞术。如先前介绍的使小鼠免疫。在第24天和第38天，处死小鼠并解剖脾和淋巴结，用于通过流式细胞术进行离体分析。使用四聚体染色完成抗原特异性B细胞分析。在无进一步纯化的情况下，通过在室温下将生物素标记的HER2肽与Alexa Fluor 647标记的链霉亲和素以4:1摩尔比混合1小时来制备HER2/neu肽四聚体。使用流式细胞术，将抗原特异性B细胞群体鉴定为记忆B细胞(B220
肿瘤研究。初次免疫接种后六十天，在右侧腹中用500,000个D2F2/E2细胞对小鼠进行皮下接种。在100μL中以5e6个细胞/mL制备D2F2/E2细胞，并与Matrigel基质等体积混合。每7天通过卡尺测量来定量肿瘤大小。使用以下公式计算肿瘤体积：
肿瘤体积＝xy
通过使用终末期疾病评分系统来确定终点；终末期疾病评分大于6的小鼠通过CO
统计学。除非另有说明，否则数据表示为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的比较使用非配对学生t检验进行。将多个组的平均值用单因素方差分析(ANOVA)，然后用事后Tukey氏成对比较进行比较。所有概率值都是双侧的，并且值p<0.05被认为是统计学上显著的。使用GraphPad Prism 7软件包进行统计分析。
结果
通过水解的硅氧烷基团和金的缔合，通过两个单独制备的纳米颗粒体系(氧化铁纳米颗粒核心和金纳米颗粒卫星)的自组装来配制IVLN(图1)。通过热分解合成了氧化铁纳米颗粒(IONP)核心，以产生由氯仿中的油酸稳定的约15nm球形核心。为了实现水性稳定，用聚硅氧烷/PEG二嵌段共聚物(IONP-聚合物)涂覆IONP核心。单独地，使用改良的自组装方法，通过在老化的硫化钠中还原氯金酸，来制备约3nm大小的超小金纳米颗粒(AuNP)。合成后，以限定的重量比将AuNP加入到溶液中的聚合物涂覆的IONP核心。
为了定量自组装后每个IONP核心的AuNP负载程度，使用了电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)。使用ICP-MS，可以确定按重量计的平均负载效率为73±7％，具有线性相关性(R
在对IVLN制剂进行ICP-MS定量和TEM可视化后，进行了基础的数学建模，以确定与病毒样颗粒相比IVLN的结构相关性。考虑到AuNP和IONP的结晶性质，对于给定重量的Au或Fe，分别确定具有确定颗粒大小的颗粒的数目是可行的。基于图2A中进行的ICP-MS测量和图2B中通过TEM确认的颗粒大小，因此可以估计IONP表面上AuNP之间的平均距离，以及IONP表面上每单位面积AuNP的平均数目。根据此分析，可以确定，根据Au与Fe的初始重量负载比率，可以将IVLN配制为AuNP之间的最小平均距离为6.75nm，这是B细胞受体交联的优选距离(图2C)。除了AuNP的空间分布外，在此相同的初始负载比率下，每单位面积AuNP的数量被确定为每平方微米约12,500-17,000个AuNP，所述值与针对病毒样颗粒(例如乙型肝炎病毒)报道的抗原密度相比是有利的(图2D)。
为了进一步评估IVLN的病毒样潜力，我们接下来评估了此体系中肽负载的能力和机制。这些研究中感兴趣的肽是人HER2/neu特异性肽，基于先前发表的工作，所述肽包含具有重叠CD4辅助T细胞表位的B细胞表位。除了这些功能性表位外，还添加了含半胱氨酸的末端侧翼，以促进经由Au-S键联(CDDD-PESFDGDPASNTAPLQPEQLQ，SEQ ID NO:1)向IVLN的简易负载。使用改良的荧光胺肽测定来定量向IVLN的肽缀合的能力。在三个单独的IVLN配制条件下评估肽负载：Au与Fe的最终重量负载比率(重量/重量Au/Fe)分别为0％、10％和30％。就每个IONP-聚合物核心的AuNP而言，这些值可分别大约转化为每个IONP-聚合物核心0个AuNP、4个AuNP和10个AuNP。在4℃下于水中进行肽缀合过夜，随后通过离心分离进行纯化。荧光肽定量分析显示，在最大肽负载条件下，0％、10％和30％重量/重量制剂分别负载有每IVLN232±73个、888±42个和1954±157个肽(图2E)。当通过总AuNP对这些相同的值进行标准化时，确定每个AuNP的最大肽负载为227±5。此外，此分析显示肽负载与AuNP数目之间呈正相关(R＝0.95)。综上所述，这些结果表明，虽然与核心有低水平的非特异性物理缔合(在最大负载条件下为约12％)，但肽负载与AuNP有关。因此，向IVLN表面的肽缀合是AuNP定位的，这表明IVLN-肽的特征在于不均一且斑点状的肽分布。这种图案化的抗原展示本质上是病毒样的，并且不可通过在其表面上使用均匀抗原分布的传统纳米颗粒体系来重现。
在评估肽负载后，我们接下来评估了IVLN-肽的材料特性，以确定所述材料是否适用于体内应用并适当地与病毒样特性一致(图2F)。在与AuNP一起孵育前，通过动态光散射(DLS)，显示IVLN的IONP-聚合物核心的体积加权的流体动力学颗粒大小为51±2nm，多分散指数(PDI)为0.15±0.03。此外，此材料在pH 7的milliQ水中的ζ电势被确定为-7±4mV。在以30％重量/重量Au/Fe的最终重量负载比率配制后，显示IVLN-空白在肽负载前的颗粒大小为55±2nm，PDI为0.20±0.05并且ζ电势为-16±4mV。肽负载后，显示IVLN-肽的颗粒大小为60±4nm，PDI为0.20±0.05并且ζ电势为-17±1mV。综上所述，IVLN-肽被确定具有用于体内应用的最佳材料特性。此外，这些特性被认为在用于病毒模拟纳米颗粒的设计标准内是可接受的，所述设计标准包括颗粒大小在20-300nm之间以及总体表面电荷为负。
病毒模拟纳米颗粒已被用于广泛的体外和体内应用，但是病毒样材料特性非常适合的一种应用是用于抗原特异性抗体生产的的B细胞活化。因此，基于IVLN-肽的病毒样材料特性建立。在这项研究中，在第0天用50μg HER2肽加10μg cGAMP作为佐剂使BALB/c小鼠(6-8周大)免疫，并在14天后加强一次。对小鼠进行放血，并在每次施用后10天收集血清用于分析(图3A)。
基于对B细胞受体交联对B细胞活化和生发中心形成的要求的理解，我们首先询问在饱和肽负载下，IVLN表面上的AuNP数量和空间分布的作用是什么。为了回答这个问题，我们通过间接ELISA评估了以10％、20％和30％重量/重量Au/Fe最终重量负载比率的用IVLN加强免疫接种后在小鼠中产生的抗原特异性IgG抗体的效价。根据此分析，确定到第24天，就中值抗体效价而言，对于10％、20％和30％重量/重量的制剂，抗原特异性IgG的产量分别为7,500、12,500和32,500(图3B)。此初步结果表明，增加IVLN表面上的AuNP数量可改善抗体生产。据推测，这种改善是由于AuNP间距减少(10重量％＝约11.25nm；20重量％＝约8.05nm；30重量％＝6.25nm)，促进更高效的B细胞受体交联。
在评估AuNP表面密度后，我们质疑对于给定的Au/Fe重量负载比率，肽缀合密度对IVLN的作用是什么。通过许多先前的报道，肽密度与B细胞活化增加呈正相关，并有可能节省剂量。值得注意的是，肽密度与抗体特异性的降低呈负相关。对于30重量％比率，IVLN表面上的低密度肽产生的中值抗原特异性IgG抗体效价为6,500，而IVLN表面上的高密度肽产生的中值效价为32,500(图3B)。在20重量％比的条件下也观察到了这种趋势，对于低密度和高密度，其产生的中值效价分别为1,300和12,500。然而，这种趋势并未转化为10重量％比率的条件。据推测，这是由于IVLN表面上AuNP之间的间距大于10nm。基于以上分析，确定由于材料的病毒样性质增加，对于抗原特异性抗体生产，更高的肽密度和更高的每IVLN表面AuNP的数量通常是优选的。显著地，证明了肽密度可改善抗体效价而不损失抗原特异性。基于这些结果，在所有向前进的测定中均使用了30重量％比率加高密度肽的条件，并简称为IVLN或IVLN-HER2。
为了有效评估病毒样特征对抗原特异性抗体生产应用的重要性，我们接下来询问与传统的纳米颗粒体系相比，IVLN表现如何。为了进行这种比较，我们使用了脂质涂覆的氧化铁纳米颗粒(脂质-IONP)作为对照(参见图1)。此纳米颗粒具有30nm氧化铁纳米颗粒核心和促进简易的肽缀合的官能化的DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺壳。显著地，就流体动力学颗粒大小(69±1nm)、PDI(0.20±0.01nm)和每个颗粒的最大肽数目(每个IVLN 2323±394个肽)而言，脂质-IONP具有类似的材料特性。然而，作为传统的纳米颗粒体系，脂质-IONP具有光滑的聚乙二醇化表面和均匀的肽分布。综上所述，我们认为IVLN和脂质-IONP的并排比较将为病毒模拟对于体内功能的作用提供有价值的见解。
如前所述，在第0天用50μg HER2肽加10μg cGAMP作为佐剂使BALB/c小鼠免疫，并在第14天加强。在第24天(第1次加强后10天)，分析血清的总IgM、总IgG、抗原特异性IgG和抗原特异性IgG同种型IgG1和IgG2a(图3C)。在此时间点，未观察到总IgM抗体产生的统计学上显著的差异(p＝0.09)，但是与单独的PBS和可溶性HER2肽治疗的小鼠相比，观察到脂质-IONP-HER2和IVLN-HER2的总IgG均显著增加。更具体地，与单独的PBS(p<0.001；p<0.001)和可溶性HER2(p<0.01；p<0.01)相比，脂质-IONP-HER2和IVLN-HER2样品的总IgG分别增加了约7倍和3倍。对于总IgG，未观察到脂质-IONP-HER2与IVLN-HER2之间的统计学上显著的差异(p＝0.98)。然而，当评估抗原特异性IgG时，在IVLN-HER2与脂质-IONP-HER2之间观察到显著差异。也就是说，确定与脂质-IONP-HER2相比，IVLN-HER2的抗原特异性IgG效价高18.5倍(39,500对2,140；p<0.001)、抗原特异性IgG1效价高15倍(9,600对640；p<0.001)并且抗原特异性IgG2a效价高4.5倍(5,760对1,280；p<0.05)。此外，与可溶性HER2肽直接相比，IVLN-HER2产生的抗原特异性IgG效价高9倍(39,500对4,300；p<0.001)、抗原特异性IgG1效价高48倍(9,600对200；p<0.001)并且抗原特异性IgG2a效价高72倍(5,760对80；p<0.01)。
与传统的纳米颗粒和可溶性对照相比，确定对于IVLN-HER2的抗原特异性抗体显著增强后，我们接下来开始回答为什么。为了开始对病毒模拟特性对抗体产生的作用进行机理评估，我们首先评估了这些材料与淋巴结一起递送和保留的能力。作为具有密集的抗原呈递细胞和淋巴细胞群体的位点，淋巴结是用于免疫活化的理想靶位点。具体地，淋巴结是最终负责引发抗原特异性IgG抗体产生的B细胞活化和生发中心形成的主要位点。在病毒模拟的情况下，已知淋巴结在对抗和控制病毒在全身的传播中起着至关重要的作用。此功能是为病毒识别和病毒特异性免疫活化而开发的独特生理特征的结果。例如，被膜下淋巴窦巨噬细胞是高度特化的巨噬细胞表型，其负责病毒摄取和向B细胞的直接呈递，以经由抗原特异性抗体的产生促进定向的病毒清除。因此，研究淋巴结递送和淋巴结内的免疫细胞相互作用是评估病毒模拟纳米颗粒功能的机制必不可少的。
通过皮下肘关节免疫接种施用后，对纳米颗粒递送和肽递送的淋巴结递送进行定量，这被确定为是最高效的递送途径。基于先前建立的方案，使用ICP-MS对切除的淋巴结中的Fe和Au进行定量，确定了将纳米颗粒向淋巴结(腘和腹股沟)递送的动力学。根据此分析，确定虽然IVLN-HER2和脂质-IONP-HER2的tmax均为施用后3小时，但对于IVLN-HER2和脂质-IONP-HER2，递送的初始纳米颗粒剂量的百分比分别为5.1±1.6％和1.9±0.8％(p<0.05)(图4A)。在72小时内，基于AUC，与脂质-IONP-HER2相比，显示IVLN-HER2总体暴露增加了2.8倍(p<0.05)。除了观察到的递送增加近3倍外，估计IVLN-HER2的纳米颗粒在淋巴结内的保留为65％，相比之下脂质-IONP-HER2为48％。除了通过原始元素分析来直接定量纳米颗粒的递送外，还可以通过使用IVIS成像对切除的腘和腹股沟淋巴结进行荧光强度的半定量分析来验证3小时时肽向淋巴结的递送(图4B)。IVIS成像显示，与脂质-IONP-HER2和可溶性HER2肽相比，IVLN-HER2导致肽递送提高了4.3倍(p<0.001；p<0.001)，所述脂质-IONP-HER2和可溶性HER2肽在递送方面没有统计显著性差异(p>0.99)。
在对淋巴结递送进行定量后，我们接下来询问IVLN和IONP在细胞水平上在淋巴结内的分布情况。为了回答这个问题，将荧光标记的纳米颗粒递送至淋巴结并应用流式细胞术，以鉴定不同表型的总细胞中纳米颗粒阳性细胞的百分比。更具体地，鉴定淋巴结抗原呈递细胞(被膜下淋巴窦巨噬细胞和树突状细胞)和淋巴细胞(B细胞和T细胞)并评估纳米颗粒摄取。此分析显示，3小时后并且相对于脂质-IONP-HER2，IVLN-HER2的被膜下淋巴窦巨噬细胞摄取改善了1.7倍(86.7±2.4％对52.2±2.8％，p<0.001)、树突状细胞摄取改善了1.8倍(75.2±1.9％对41.1±5.8％，p<0.001)，并且B细胞摄取改善了3.4倍(63.9±1.1％对19.7±2.2％，p<0.001)，(图4C)。
最后，我们询问用于改善细胞摄取的机制是什么。基于先前的研究，纳米颗粒表面拓扑结构与改善的细胞摄取呈正相关。鉴于与脂质-IONP的光滑聚乙二醇化表面相比，IVLN的表面拓扑结构粗糙，我们假设细胞摄取取决于IVLN表面上的AuNP负载程度。为了测试此假设，使用从鼠脾中分离的RAW264.7巨噬细胞、DC2.4树突状细胞和原代B细胞评估体外细胞摄取。根据此分析，确定不管细胞类型如何，细胞摄取都是通过IVLN表面上的AuNP负载程度确定的，并且与指数函数相匹配(RAW264.7，R
病毒样特征是合理设计和工程化纳米技术在生物技术和医学应用中的进展所迫切需要的递送媒介物、免疫刺激剂和细胞摄取载体的理想材料特性。因此，在此我们报道了以更整体的病毒模拟材料设计方法(无机病毒样纳米颗粒(IVLN)和IVLN-肽)的病毒样颗粒替代物的开发和评估。在某些实施方案中，IVLN由混合的Au@Fe核心-卫星型纳米颗粒体系组成，所述体系使用16nm含有聚硅氧烷的二嵌段聚合物涂覆的氧化铁纳米颗粒核心(IONP-聚合物)与2.5nm金纳米颗粒卫星(AuNP)。基于配制条件，可以在可变的表面拓扑结构、抗原密度和抗原空间分辨率的情况下产生IVLN。此外，IVLN具有对于高效淋巴结递送和保留最佳的颗粒大小、形状和表面电荷。因此，这些特性告知了IVLN的病毒样特征和功能潜力。
我们的结果表明，病毒样特征对于B细胞活化和抗原特异性抗体的产生确实有意义。具体地，通过操纵IVLN表面上AuNP的空间分布以及局限于那些AuNP的肽密度区域，可以将中值抗原特异性IgG抗体效价从6,300增加到32,500(增加了5倍)。通过直接比较IVLN与脂质-IONP，进一步证实了此结果。显著地，与脂质-IONP-HER2相比，确定IVLN-HER2的抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a效价分别高18.5倍、15倍和4.5倍。在每单位纳米颗粒的流体动力学颗粒大小、表面电荷、核心形状和肽负载高度可比的情况下，通过这两种结构在抗体产生中的任何可定量的差异都可以归因于病毒样特征的增加。从机制上看，由于免疫细胞摄取改善，作为淋巴结中的递送和保留更多的结果，这种病毒样特征导致了抗原特异性抗体产生增强，从而促进了总体B细胞活化和生发中心形成的显著增加。
实施例2
用于抗原特异性抗体生产的病毒样纳米颗粒
此实施例描述了产生抗体的病毒样纳米颗粒的生产和使用。为了实现病毒样结构，我们使用可控且稳健的自组装过程对IVLN进行工程化，以类似于病毒的刺突S蛋白，所述刺突S蛋白具有刺突抗原簇拓扑结构、抗原簇之间的一定距离以及刺突上的局部高抗原密度。
为了测试IVLN的病毒功能模拟，我们评估了IVLN活化抗原特异性B细胞和持久抗原特异性抗体反应。我们选择了众所周知的具有重叠CD4 T细胞表位的HER2 B细胞表位，因为通过监测HER2肿瘤生长很容易获得用于评估持久抗体反应的体内模型，而无需生物安全四级实验室。评估了IVLN的三种重要的病毒样功能：(1)次级淋巴结中的抗原递送效率和B细胞区摄取；(2)通过IVLN表面上抗原的不同密度和空间排列的抗原特异性B细胞活化；以及(3)针对B细胞活化和持久抗体反应的生发中心中的滤泡辅助性T细胞活化。在体内评估了抗原特异性抗体的持久功能，以抑制HER2癌症生长。
材料和方法
材料
所有试剂均如从商业来源获得那样使用，无需进一步纯化，除了通过减压蒸馏纯化的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(98％)以及通过在乙醇中重结晶纯化的2,2-偶氮双(异丁腈)(98％)外。氧化铁(III)(FeO(OH)，水合，催化剂级，30-50目)、油酸(工业级，90％)、硫酸铁(II)铵六水合物(ACS试剂，99％)、1-十八烯(工业级，90％)、无水四氢呋喃(THF，99.8％)、二硫化碳(99.9％)、镁屑(>99.5％)、2-氯-2-苯基乙酰氯(CPAC，90％)、聚(环氧乙烷)单甲醚(PEO)、无水二噁烷(99.8％)、二甲基甲酰胺(DMF，99.9％)、二甲基亚砜(DMSO，99.9％)、邻菲咯啉一水合物(ACS试剂，99％)、对苯二酚(ACS试剂，99％)、硫化钠、氯金酸、硝酸(ACS试剂，70％)和盐酸(ACS试剂，37％)均购自Sigma-Aldrich。小鼠未涂覆的IgG和IgM总ELISA试剂盒、1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液、HRP缀合的山羊抗小鼠IgG1二抗、HRP缀合的山羊抗小鼠IgG2a二抗、Nunc Immobilizer氨基96孔ELISA板、BupH碳酸氢盐缓冲液包(涂覆缓冲液)、无Pierce蛋白的PBS tween封闭缓冲液、20x PBS-tween洗涤缓冲液、遗传霉素(G418)选择性抗生素、Invitrogen eBioscience可固定生存力染料eFluor780和Molecular Probes链霉亲和素Alexa Fluor 647缀合物均获自Thermo FisherScientific。HRP缀合的山羊抗小鼠IgG二抗、Zombie UV可固定生存力试剂盒、FITC抗小鼠CD19、PE/Dazzle 594抗小鼠IgD、Alexa Fluor 647抗小鼠/家鼠GL7抗原、BrilliantViolet 421和PE/Dazzle 594抗小鼠/人CD45R/B220、FITC抗小鼠CD95、Brilliant Violet421抗小鼠/人CD11b、FITC抗小鼠CD169和PE山羊抗小鼠IgG二抗均购自BioLegend。通过LifeTein定制合成HER2肽(CDDDPESFDGDPASNTAPLQPEQLQ(SEQ ID NO:1)、生物素-PESFDGDPASNTAPLQPEQLQ(SEQ ID NO:2)、CDDDPESFDGDPASNTAPLQPEQLQGGGK(SEQ ID NO:3)。由氯仿中的油酸稳定的氧化铁纳米颗粒(30nm)购自Ocean Nanotech。DSPE-PEG(2000)和DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺均获自Avanti Polar Lipids。2'3'-cGAMP获自InvivoGen。荧光胺购自MP Biomedicals。磺基-Cy5.5 NHS酯获自Lumiprobe。具有凝血因子的Microvette 500Z-Gel血清收集瓶获自Sarstedt。Matrigel基底膜基质购自Corning。金和铁ICP标准品购自Fluka Analytical。
小鼠
所有动物实验均根据密歇根大学动物使用和护理委员会(University ofMichigan Committee on Use and Care of Animals；UCUCA)批准的方案进行。5-7周龄的BALB/小鼠购自Charles River Labs。
细胞
所有细胞均维持在37℃、5％CO
无机病毒样纳米颗粒(IVLN)的配制和表征
大体上如实施例1那样配制IVLN。基于先前报道的对ICP-OES分析进行修改的方案，使用Perkin-Elmer Nexion 2000，通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对配制的IVLN的最终Au与Fe比率进行定量(78)。使用具有CEOS探针校正器的JEOL 2100F，通过s扫描透射(电子显微镜(STEM))对IVLN制剂进行成像。使用ImageJ软件对AuNP、IONP和IVLN的真实颗粒大小进行定量。使用动态光散射和相分析光散射，用Malvern Zetasizer Nano-ZS分别评估在25℃下milliQ水中的所有制剂的体积加权流体动力学颗粒大小、多分散指数和ζ电位。
脂质涂覆的氧化铁纳米颗粒制剂(IONP)
脂质涂覆的氧化铁纳米颗粒制备如下。在轻轻地混合时，将DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺(10mg)加入到由氯仿中的油酸稳定的1mg 30nm氧化铁纳米颗粒中。对所得溶液进行溶剂旋转蒸发以去除所有氯仿并形成薄膜。同时，将此膜和pH 7.4的100mM PBS在烘箱中加热至75℃。达到温度后，将热的PBS快速加入到膜中，并立即剧烈混合以促进薄膜水合。将所得的纳米颗粒溶液储存在4℃以促进脂质自组装。通过使用EasySep磁分离器装置(StemCell)在4℃下进行磁分离过夜来去除游离的磷脂。
IONP-HER2和IVLN-HER2制剂
通过硫醇介导的化学过程将HER2肽缀合至IONP和IVLN两者。具体地，经由马来酰亚胺化学结构配制IONP-HER2，并且经由金-硫醇键联配制IVLN-HER2。将HER2肽以在milliQ中过量1.5x的重量比加入到IONP中，并在4℃下孵育过夜。将HER2肽以在milliQ中过量5x的重量比加入到IVLN-HER2中，并在4℃下孵育过夜。两种材料都可以通过使用磁分离在4℃下进行磁分离过夜或通过在4℃下以10,000x g离心分离30分钟来纯化。在存在纳米颗粒的情况下，使用改良的荧光胺肽定量测定，使用荧光定量来确定肽负载(Ex/Em：390/465nm，Biotek Cytation 5)(86)。使用标准曲线进行定量以说明猝灭作用，其中肽浓度随纳米颗粒(IONP或IVLN)的标准化浓度而增加。
免疫接种和血清收集
在第0天，无论制剂类型如何，均用50μg或5μg的HER2肽加10μg cGAMP的等同物使小鼠免疫。随后，在第14天，用50％原始剂量的抗原和佐剂两者将小鼠以两周的间隔加强两次(第14天和第28天)。为了评估血清抗体效价，在每次免疫接种后10天(第10、24和38天)通过下颌下穿刺来收集血液。通过使用带有凝血活化剂的Microvette 500Ser-Gel收集容器在25℃下以10,000x g离心分离5分钟，来从全血中分离出血清。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
基于制造商推荐的方案(Thermo Fisher)，使用小鼠未涂覆的总IgG和总IgMELISA试剂盒进行总IgG和总IgM抗体的绝对定量。基于先前建立的间接ELISA方案并稍作修改，对抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体效价进行定量(87)。具体地，通过在室温下在暴露于光的情况下过夜孵育，使用Nunc Immobilizer氨基免疫测定板，通过末端胺基团来将HER2肽(200μL，在100mM碳酸盐缓冲液中100μg/mL，pH 9.4)化学缀合至ELISA板。过夜孵育后，将ELISA板用pH 7.4的具有2％Tween-20的100mM PBS洗涤3次。随后，用300μL ELISA封闭剂(无Pierce蛋白的PBS封闭缓冲液)在4℃下将ELISA板封闭过夜。封闭后，将ELISA板洗涤3次。使用pH 7.4的含10％ELISA封闭剂的100mM PBS对含有一抗的血清样品进行连续稀释(10
体内纳米颗粒向淋巴结递送的定量
用以每只小鼠200μg Fe的剂量的IONP或IVLN，在左肘关节中对小鼠进行皮下注射。在指定的时间间隔，处死小鼠并解剖感兴趣的淋巴结用于离体分析。基于先前报道的方案，使用ICP-MS对纳米颗粒递向淋巴结递送的程度进行定量(77)。
体内肽向淋巴结递送的定量
为了促进肽向淋巴结递送的定量，将赖氨酸末端修饰的HER2肽化学缀合至磺基-Cy5.5 NHS酯。此缀合以磺基-Cy5.5 NHS酯对于HER2肽过量5倍摩尔进行。在初始肽缀合完成后，对IONP-HER2-Cy5.5和IVLN-HER2-Cy5.5进行Cy5.5官能化，以便能够通过磁分离来简易纯化过量的荧光染料。Cy5.5官能化后，如先前所述对小鼠进行注射。3小时后，处死小鼠并解剖感兴趣的淋巴结，用于通过IVIS成像进行离体分析。关于辐射效率，将IVIS成像用于肽递送的半定量。
体内细胞摄取
用以每只小鼠200μg总Fe的脂质-IONP或IVLN，在左肘关节中对IVLN-HER-Cy5.5和IONP-HER2-Cy5.5进行皮下注射。在3小时和24小时，处死小鼠并解剖感兴趣的淋巴结，用于通过流式细胞术进行离体分析。通过机械方法解离淋巴结以制备单细胞悬浮液。对淋巴结细胞的单细胞悬浮液进行染色，用于通过使用MoFlo Astrios流式细胞仪的流式细胞术进行分析。活细胞(Zombie UV)被鉴定为B细胞(B220
体外细胞摄取
使用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒，在从鼠脾中分离的RAW264.7巨噬细胞、树突状细胞(DC 2.4)和原代B细胞中评估IVLN-HER2和IONP-HER2细胞的摄取。在空白的RPMI培养基中，在37℃、5％CO
分析所有免疫细胞的质谱流式细胞术(CyTOF)
将固定并冷冻的细胞悬浮液在冰上解冻。如前所述(89,90)，使用被设计成鉴定淋巴结中的主要和次要免疫细胞亚群的40种金属缀合抗体的优化混合物对样品进行染色并制备用于CyTOF分析。在CyTOF II(Fluidigm，San Francisco，CA)上采集后，将样品归一化为内部珠标准品。通过使用FlowJo软件进行门控来鉴定细胞亚群。基于标记基因在免疫细胞不同亚群中的表达，使用SPADE进行对于无监督聚类分析的整体分析。
抗原特异性B细胞和生发中心流式细胞术
如先前介绍的使小鼠免疫。在第10天，处死小鼠并解剖淋巴结，用于通过流式细胞术进行离体分析。基于先前建立的方案并稍作修改，使用四聚体染色完成抗原特异性B细胞分析(63)。在无进一步纯化的情况下，通过在室温下将生物素标记的HER2肽与AlexaFluor647标记的链霉亲和素以4:1摩尔比混合1小时来制备HER2/neu肽四聚体。使用CD19鉴定抗原特异性B细胞群体，并且使用流式细胞术鉴定HER2-肽四聚体。使用以下标志物B220、IgD、GL7和CD95(B220
肿瘤研究
初次免疫接种后四十九天，在右侧腹用2.5×10
统计学
除非另有说明，否则数据表示为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的比较使用非配对学生t检验进行。将多个组的平均值用单因素方差分析(ANOVA)，然后用事后Tukey氏成对比较进行比较。所有概率值都是双侧的，并且值p<0.05被认为是统计学上显著的。使用GraphPad Prism 7软件包进行统计分析。
结果
设计模拟病毒样刺突结构的无机病毒样纳米颗粒(IVLN)
我们已开发出使用自组装过程制造IVLN的可控且稳健的方法。为了获得病毒样刺突拓扑结构，将AuNP(2nm)附着到IONP(15nm)的表面上以产生IVLN(图7A)。AuNP和IONP的附着是通过反应性AuNP表面与用于涂覆IONP的聚合物中存在的游离硅氧烷部分之间的相互作用进行自组装来实现的。对于大规模制造而言，此方法是受控且稳健的。
通过热分解合成了IONP，以产生由氯仿中的油酸稳定的15nm球形核心。为了实现水性稳定，基于先前报道的程序，用含聚(硅氧烷)和聚(乙二醇)的二嵌段共聚物涂覆IONP(51)。使用改良的沉淀方法，通过在老化的硫化钠中还原氯金酸，来制备约2-3nm大小的超小金纳米颗粒或卫星(AuNP)(53)。将AuNP溶液以限定的重量比加入到IONP溶液中，并在4℃下孵育过夜，以允许IVLN的自组装。为了将IVLN上病毒样刺突结构的数目控制在4-14(图7B，图7C)，将AuNP与IONP的比率调整为10％、20％和30％AuNP/IONP，如通过ICP-MS所测量(54,55)，得到IVLN，每个IVLN具有4±2个、9±3个和13±5个AuNP(图7B)。通过扫描透射电子显微镜(STEM)证实了IVLN的病毒样结构(图7C)。单个IVLN(具有14个AuNP)的高角环形暗场(high-angle annular dark-field；HAADF)图像显示出病毒样结构的密切相似性(图8C)。
与非衣壳抗原肽缀合的IVLN类似于具有三种病毒样特征的病毒的刺突S蛋白结构
为了模拟类似于病毒S蛋白的抗原结构，使用了三种特征：刺突抗原簇拓扑结构、抗原簇之间的最佳距离(5nm)以及刺突上的局部高抗原密度。
通过仅将抗原肽缀合到IVLN的刺突AuNP，但不缀合到IONP核心的聚合物上，来实现刺突抗原簇拓扑结构。我们使用了非病毒衣壳以及具有重叠CD4 T细胞表位(CDDD-PESFDGDPASNTAPLQPE QLQ-(GGK)的众所周知的HER2 B细胞表位(56-58)。我们选择HER2B细胞表位作为概念验证研究，以研究IVLN的病毒样结构和功能模拟，因为体内模型很容易通过监测肿瘤生长来测试抗体功能，而无需生物安全4级实验室。仅通过IVLN上(而不是在INOP上相邻的聚合物涂层上)的S-Au反应，实现了HER2肽(在N末端带有半胱氨酸)与刺突AuNP的缀合(图7F，图1H)。没有AuNP的单独聚合物涂覆的IONP被用作对照。对于具有AuNP的IVLN，观察到高水平的肽缀合，但在单独IONP核心上未观察到(图7F，黑色符号)。此外，观察到肽负载与AuNP数目之间呈正相关(R＝0.95)。这些结果表明，虽然HER2肽与INOP核心有低水平的非特异性缔合(约12％)，但肽缀合与AuNP有关，这实现了IVLN上的抗原刺突簇拓扑结构；这些病毒模拟特性不可通过在表面仅具有均匀抗原分布的传统纳米颗粒来实现(图7I)。
为了将两个刺突抗原簇之间的距离控制在5-10nm(其是B细胞受体(BCR)交联和活化的理想距离)(41,59)，我们使用不同的AuNP/IONP比率将IVLN表面上AuNP的数目调整为14，从而产生在5.1-6.3nm之间的距离(图7D)。
为了控制刺突上的抗原密度高度局部化，我们以0％、10％和30％的AuNP/IONP比率(这分别对应于IVLN表面上的0、4、13个AuNP)在IVLN上缀合了不同量的HER2肽(图7F)。肽负载为个每IVLN232±73个、888±42个和1954±157个肽(每个AuNP 227±5个肽，图7F)。因此，IVLN达到每μ
为了模拟最佳病毒大小和表面电荷(32,34)，IVLN的颗粒大小为50-60nm，PDI为0.2并且ζ电势为-16mV(图7H)。此外，在体内相关的血清条件下，显示IVLN-HER2在12与24小时之间是稳定的。
为了有效地评估IVLN的病毒模拟结构的这三种特征，产生了在表面上具有类似的大小、电荷、肽密度(每个IONP 2323±394个肽，但抗原分布均匀)的传统的脂质涂覆的IONP(IONP-HER2)作为对照(图7G，图7I)。IONP-HER2具有30nmIONP核心和促进简易的肽缀合的官能化的DSPE-PEG(2000)-马来酰亚胺壳。就体积加权的流体动力学颗粒大小(68±5nm)、PDI(0.22±0.02nm)和每个颗粒的最大数目(每个IONP 2323±394个肽)而言，IONP-HER2具有类似的材料特性(图7G)。因此，IVLN-HER2和IONP-HER2的并排比较将为病毒模拟功能的作用提供有价值的见解。
与INOP-HER2相比，IVLN-HER2使HER2特异性抗体产生增强7至18倍
病毒模拟纳米颗粒已广泛用于体外和体内应用，但是病毒样结构和功能最重要的应用是活化B细胞以产生抗原特异性抗体(2,6,13,57,60-62)。因此，我们首先测试了IVLN-HER2是否针对非衣壳致癌人HER2特异性肽(HER2)诱导了体内抗原特异性IgG的产生。
与具有类似HER2肽密度(约2000个肽/INOP，抗原分布均匀)的传统的脂质涂覆的IONP-HER2相比，将优化的IVLN(约14个刺突抗原簇、5-6nm的两个抗原簇之间的距离、约2000个肽/IVLN、150个肽/AuNP)用于使BALB/c小鼠免疫以产生HER2特异性抗体。在TEM(30nm)和DLS(65nm)下，IVLN-HER2和IONP-HER2具有类似的大小。在第0天，将所有组中相同剂量的HER2肽用于BALB/c小鼠的免疫接种(5ug或50ug肽、10μg cGAMP作为佐剂)，并以14天间隔加强两次(图8A)。将两个剂量(5ug和50ug)的HER2用于进行免疫接种。在两次加强免疫接种后(第38天)进行完整的血清分析，因为此时间点被确定为反应最强，并且因此最相关。在两次加强免疫接种后(第38天)，使用ELISA分析总IgM、总IgG、HER2特异性IgG和HER2特异性IgG同种型(IgG1和IgG2a)的抗体反应。
在低剂量下，与IONP-HER2相比，IVLN-HER2(5ug)产生的HER2特异性IgG效价高8倍，HER2特异性IgG1效价高18倍并且HER2特异性IgG2a效价高13倍。此外，与可溶性HER2肽相比，IVLN-HER2产生的Ag特异性IgG效价高14倍，Ag特异性IgG1效价高7倍并且Ag特异性IgG2a效价高14倍(图8B)。
类似地，在高剂量(50ug)下，与可溶性HER2肽相比，IVLN-HER2(50ug)使抗原特异性IgG效价增强12倍，使抗原特异性IgG1效价增强8倍并且使抗原特异性IgG2a效价增强14倍。与INOP-HER2相比，IVLN-HER2(50ug)使抗原特异性IgG效价增强4至5倍，使抗原特异性IgG1效价增强3倍并且使抗原特异性IgG2a效价增强5倍(图8C)。在任何治疗组之间均未观察到总IgM和总IgG抗体产生的统计学上显著的差异。总的来说，这些数据表明IVLN的病毒样特性对于抗原特异性抗体的产生更高效。
刺突抗原簇数量、两个抗原簇之间的距离以及IVLN上的局部抗原密度影响其产生抗原特异性抗体的能力
病毒样特征对于通过多价B细胞受体交联的B细胞活化非常重要(9,40,41)，所述病毒样特征包括不同数目的刺突抗原簇、簇之间的不同距离以及不同的局部抗原密度(2,6,13,57,60-62)。因此，我们测试了不同的IVLN-HER2病毒模拟特征是否影响BALB/c小鼠的抗HER2抗体产生。我们在第0天使小鼠免疫，并在第14天使用具有不同刺突簇数目和距离的IVLN-HER2，但使用相同量的HER2肽(50μg HER2肽、10μg cGAMP作为佐剂)加强一次(图9A)。
我们首先使用两种不同的AuNP/IONP比率：10％和30％评估了刺突抗原簇数数目与抗原簇之间的距离对HER2特异性IgG抗体产生的影响，这与IONP上AuNP数目比率4、14相对应，并且AuNP之间的距离为约15nm和约5nm。虽然在免疫接种中使用了相同剂量的HER2抗原，但与产生HER2特异性IgG效价为10,540的IVLN(具有4个抗原簇，簇之间的距离为15nm)相比，IVLN(具有14个抗原簇，并且簇之间的最佳距离为5nm)产生的HER2特异性IgG效价(64,500)高6倍(图9B)。
随后，我们评估了IVLN上的局部抗原密度对HER2特异性抗体的影响。虽然在免疫接种中使用了相同的HER2抗原剂量，但IVLN(14个抗原簇，其中簇之间的距离为约5nm，高密度150个肽/簇)产生的抗原特异性抗体的效价比IVLN(具有4个抗原簇，其中簇之间的距离为15nm，低抗原密度30个肽/簇)的抗原特异性抗体的效价高4倍(图9B)。数据表明抗原簇的数目(在此实施例中为14个簇)、抗原簇之间的距离(在此实施例中为5-6nm)和局部抗原密度(在此实施例中为2000个肽/IVLN、约150个肽/AuNP)产生高HER2特异性抗体。
与IONP-HER2相比，IVLN-HER2使抗原特异性B细胞活化和GC形成增加6倍
为了产生高抗体反应，需要生发中心的抗原特异性B细胞活化(9,40,41)。因此，我们测试了IVLN-HER2对免疫的BALB/c小鼠引流淋巴结中GC形成和抗原特异性B细胞的影响。使用荧光标记的链霉亲和素HER2肽四聚体染色，测量淋巴结免疫反应中的HER2特异性B细胞(63)(图10A)。抗原特异性B细胞被鉴定为对CD19和HER2肽四聚体呈双阳性。
数据表明，与IONP-HER2免疫组相比，IVLN-HER2在淋巴结中产生的HER2特异性B细胞高6倍(3％)(图10B)。在IONP-HER2对HER2肽免疫的小鼠中未检测到HER特异性B细胞的差异。此外，我们还通过流式细胞术分析评估了用IVLN-HER2、IONP-HER2和可溶性HER2肽进行初次免疫接种后在10天(GC反应峰)的GC形成。GC B细胞被鉴定为B220
免疫细胞的CyTOF分析显示了IVLN-HER2增强淋巴结中的Tfh依赖性B细胞活化
在生发中心(GC)中，B细胞活化需要与滤泡T细胞相互作用以产生长寿浆细胞(PC)，从而产生长期持久的抗体反应。因此，使用40家制造商带有重金属标记的抗体免疫接种后，通过评估淋巴结中的免疫细胞来将CyTOF分析用于评估T细胞依赖性B细胞活化，所述免疫细胞包括巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、CD4+、CD8+ T细胞、淋巴结和脾中的NK细胞。(66-68)。
使用SPADE进行的整体分析显示，IVLN-HER增加淋巴结中的GC、血浆B细胞和滤泡T细胞(图11A，图11B)，但未显示淋巴结和脾中的免疫细胞的其他显著变化。详细分析显示，与IONP-HER2免疫组相比，IVLN-HER2刺激更多的生发中心B细胞(CD19+/GL7+或B220+/GL7+)(图11C)、滤泡辅助性T细胞(Tfh)(CD4+/CXCR5+/PD-1+)(图11D)和血浆细胞(PC)(图11E)，这对于抗体分泌至关重要。这些数据提供了有力的证据，表明IVLN-HER2诱导了淋巴结GC中的Tfh依赖性B细胞活化，解释了为什么IVLN-HER2产生更高效价的抗原特异性抗体。
与IONP-HER2相比，IVLN-HER2改善淋巴结递送效率和B细胞区摄取
高效抗原向淋巴结的递送是有效的B细胞活化和抗体反应的先决条件。我们首先评估了IVLN-HER2的递送效率和在淋巴结中的保留(69,70)。第二，在淋巴结内，我们确定IVLN-HER2是否可以特异性地靶向B细胞区，因为淋巴结是最终负责起始抗原特异性IgG抗体产生的B细胞活化和生发中心形成的主要位点(71-73)。第三，我们还测试了IVLN是否在淋巴结内具有病毒样细胞分布模式。作为具有密集的抗原呈递细胞和淋巴细胞群体的位点，已知淋巴结在病毒隔离和定向免疫活化中至关重要(74,75)。此功能是为病毒识别和病毒特异性免疫活化而开发的独特生理特征的结果。例如，被膜下淋巴窦巨噬细胞是高度特化的巨噬细胞表型，其负责病毒摄取和向B细胞的直接呈递，以经由抗原特异性抗体的产生促进定向的病毒清除(75,76)。
与IONP-HRR2相比，使用两种不同的方法评估IVLN-HER2的递送效率和在淋巴结中保留(69,70)：切除的淋巴结中的Fe的ICP-MS定量(77,78)以及荧光标记的IVLN-HER2肽的IVIS成像(79)。IVLN-HER2和IONP-HER2的t
随后，我们测试了与IONP-HER2相比，IVLN-HER2在淋巴结内(特别是在被膜下淋巴窦巨噬细胞和B细胞群体中)是否具有病毒样分布(72,73,76)。通过皮下肘关节免疫接种来注射荧光标记的IVLN-HER2，并在施用后3小时应用流式细胞术以鉴定不同表型的IVLN-HER2或IONP-HER2阳性细胞。被膜下淋巴窦巨噬细胞被鉴定为CD11b
在从鼠脾中分离的RAW 264.7巨噬细胞和原代B细胞中，体外证实了IVLN-HER2和IONP-HER2的细胞内摄取。与IONP-HER2对照组相比，IVLN-HER2使巨噬细胞中的细胞摄取改善了3倍，并且使B细胞中的细胞摄取改善了2倍(图12D)。综上所述，这些数据表明，IVLN的病毒结构模拟改善了淋巴结递送效率和淋巴结中优选的B细胞区分布。
IVLN-HER2诱导具有持久功能的抗原特异性抗体
我们使用了众所周知的HER2抗原的B细胞表位，因此我们可以通过监测体内IVLN-HER2免疫接种后的肿瘤生长，来容易地测试建立的模型中诱导的抗体的功能。IVLN上的HER2肽是产生帕妥珠单抗(pertuzumab)
为了防止感染，非常需要针对病毒表面上的病毒衣壳蛋白抗原的B细胞免疫。在此类情况下，灭活/减毒活病毒上的衣壳抗原和使用病毒衣壳蛋白的病毒样颗粒(VLP)的病毒样结构对抵抗病毒感染的活性B细胞免疫高度有效(1-4)。然而，在其他三种情况下，还需要针对非衣壳蛋白抗原的B细胞免疫，以抵抗致命的细菌感染的细菌毒素、癌症的致癌蛋白以及用于抗体生产的肽抗原(20,21)。然而，使用这些非衣壳抗原制备病毒样颗粒并因此活化B细胞免疫是非常困难的。非常需要针对细菌毒素的B细胞疫苗，以预防致命的细菌感染，诸如炭疽杆菌(C.Anthracis)(炭疽)和肉毒杆菌(C.Botulinum)(20,21)。这些细菌毒素B细胞疫苗通常使用类毒素作为抗原来加强中和抗体(20,21)。成功的细菌毒素疫苗目前用于抵抗破伤风和白喉。然而，对于炭疽杆菌(炭疽)和肉毒杆菌的细菌类毒素B细胞疫苗的安全性和功效是两个主要问题(20,21)。由于这两种毒素的剧毒性质，使用这些类毒素的肽抗原作为疫苗是优选的(22)。然而，在没有病毒结构模拟的情况下使用纳米颗粒递送体系，肽抗原对加强B细胞免疫的效率非常低。此外，针对致癌抗原的B细胞免疫可能在癌症的预防/治疗中具有潜在的益处。例如，虽然仍在争论B细胞活化在癌症中的益处/风险，但若干种HER2 B细胞疫苗目前正处于临床试验中(23,24)。此外，在疾病检测/治疗中非常需要针对各种肽抗原的高效抗体生产(25)。然而，这些肽抗原产生抗体的效率低，并且它们只能在短期内产生低效价的抗体。
目前增强针对非衣壳抗原的B细胞免疫的策略是使用纳米递送体系来模拟病毒样结构。然而，大多数纳米递送体系并不具有真正的病毒样结构，它们不足以活化B细胞免疫。虽然没有病毒样结构的纳米递送体系在B细胞免疫方面优于可溶性肽，但它们仅能活化低水平的抗原特异性B细胞(少于1-3％)，并且抗体反应寿命短(35-38)。相比之下，本文的具有HER2肽的无机病毒样纳米颗粒(IVLN)以滤泡辅助性T细胞依赖性方式产生了多于17％的抗原特异性B细胞。这些特征诱导了持久抗体反应，以抑制体内HER2肿瘤生长。我们选择HER2 B细胞表位来研究IVLN的病毒样结构和功能模拟，因为体内模型很容易通过监测肿瘤生长来测试抗体功能，而无需生物安全4级实验室。然而，可以将相同原理应用于活化B细胞免疫以实现其他应用，诸如针对肽的抗体生产，或针对炭疽杆菌(炭疽)和肉毒杆菌的细菌毒素的B细胞免疫。
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本申请中提到的所有公布和专利以引用的方式并入本文。本发明的所描述方法和组合物的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定优选实施方案描述了本发明，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地限制于此类特定实施方案。事实上，对于相关领域技术人员来说显而易见的用于进行本发明的所描述模式的各种修改意图在以下权利要求的范围内。
表4
序列表
<110> 密歇根大学董事会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN)
<120> 纳米卫星复合物
<130> UM-37046.601
<150> US 62/746,755
<151> 2018-10-17
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Cys Asp Asp Asp Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr
1 5 10 15
Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln
20 25
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Gln Leu Gln
20
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Cys Asp Asp Asp Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr
1 5 10 15
Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Gly Gly Gly Lys
20 25
<210> 4
<211> 1255
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
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Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
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Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
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Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
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Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
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Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
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Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
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Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
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1010 1015 1020
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Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
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Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu
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Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
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Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
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Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
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Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
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Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
- 纳米卫星复合物
- 载体-纳米粒子复合物、催化剂、电化学电池和制备载体-纳米粒子复合物的方法