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一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒

文献发布时间：2023-06-19 12:08:44

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体来说，涉及一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒。

背景技术

原发性肉碱缺乏症(Primary Carnitine Deficiency，以下简称PCD)是一种常染色体隐性遗传病，其临床特点为肉碱代谢出现异常。该病的致病基因为编码有机阳离子转运2型(OCTN2)的SLC22A5基因。PCD的发病年龄跨度较大，但大多数患儿于1个月至7岁发病，平均发病年龄在2岁左右。不同患者的临床表现差异较大，主要有：(1)急性能量代谢障碍，表现为低酮型低血糖、高血氨及代谢性酸中毒等；(2)心肌病，表现为心室肥厚、心功能不全、心律失常及肌酸激酶升高等；(3)肌病，表现为肌无力、肌张力减退、肌痛、运动耐力差、肌肉型肌酸激酶升高、肌纤维内脂质沉积等；(4)肝脏损害，表现为肝肿大、脂肪肝、肝功能异常等，一些出现肝损伤的患儿会急性起病，表现为抽搐、进行性意识障碍等，常被误诊为Reye综合征。此外，反复腹痛、呕吐、胃食管反流等消化道症状，反复感染、喘息等呼吸道表现以及贫血等也有报道。

PCD患病率为(0.8～2.5)/10万。不同地区的患病率存在差异，德国约为0.3/10万，美国约为0.5/10万，葡萄牙约为1/10万，澳大利亚约0.8/10万，沙特阿拉伯约为1.2/10万，日本约2.5/10万；我国上海地区为2.4/10万，浙江省为3.1/10万，中国香港患病率约为1.1/10万，中国台湾患病率约为0.8/10万。本实验室在郑州采集了388例健康备孕人群的DNA，发现致病变异位点NM_003060.3:exon8:c.1400C>G:p.S467C的携带率为1.55％(6/388)，以此推算发病率约为5.98/10万，高于目前文献报道的发病率，目前为止，关于该位点的文献大多数为案例报道，缺乏该致病变异在中国人群中的流行病学报道。综合其他致病位点，PCD在中国的真实发病率必然远高于目前的文献报道。

目前国内外对于原发性肉碱缺乏症筛查方法有全基因组Sanger测序、串联质谱、临床检查。其中全基因的测序费用过高，很难满足目前临床实际需求。

建立快速、准确的检测原发性肉碱缺乏症的方法具有重要意义。结合国内情况，在早期筛查出原发性肉碱缺乏症，对于新生儿患者应用肉碱替代治疗，维持血浆游离肉碱水平正常或接近正常，可以避免其发育不良问题。相比较而言，荧光PCR是针对遗传物质DNA/RNA进行检测的手段，准确度较高，假阳性率较低，有助于进行普遍筛查，降低原发性肉碱缺乏症新生儿出生率，同时可以帮助更多的患病儿童维持正常生活。目前，还没有专门针对该变异位点的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。本发明采用实时荧光定量PCR的方法，能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列为：

SLC22A5-F1的序列如SEQ ID NO.1所示；

SLC22A5-R1的序列如SEQ ID NO.2所示；

SLC22A5-F2的序列如SEQ ID NO.3所示；

SLC22A5-R2的序列如SEQ ID NO.4所示；

SLC22A5-F3的序列如SEQ ID NO.5所示；

SLC22A5-F4的序列如SEQ ID NO.6所示；

SLC22A5-R4的序列如SEQ ID NO.7所示；

SLC22A5-F5的序列如SEQ ID NO.8所示；

SLC22A5-R5的序列如SEQ ID NO.9所示；

SLC22A5-Probe1的序列如SEQ ID NO.10所示；

SLC22A5-Probe2的序列如SEQ ID NO.11所示；

SLC22A5-Probe4的序列如SEQ ID NO.12所示；

SLC22A5-Probe6的序列如SEQ ID NO.13所示。

进一步地，SLC22A5-Probe1的5'端标记FAM，3'端标记MGB。

进一步地，SLC22A5-Probe2、SLC22A5-Probe4、SLC22A5-Probe6的5'端均标记VIC，3'端均标记MGB。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，包括针对检测位点设计的探针引物组，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列为：

SLC22A5-F1的序列如SEQ ID NO.1所示；

SLC22A5-R1的序列如SEQ ID NO.2所示；

SLC22A5-F2的序列如SEQ ID NO.3所示；

SLC22A5-R2的序列如SEQ ID NO.4所示；

SLC22A5-F3的序列如SEQ ID NO.5所示；

SLC22A5-F4的序列如SEQ ID NO.6所示；

SLC22A5-R4的序列如SEQ ID NO.7所示；

SLC22A5-F5的序列如SEQ ID NO.8所示；

SLC22A5-R5的序列如SEQ ID NO.9所示；

SLC22A5-Probe1的序列如SEQ ID NO.10所示；

SLC22A5-Probe2的序列如SEQ ID NO.11所示；

SLC22A5-Probe4的序列如SEQ ID NO.12所示；

SLC22A5-Probe6的序列如SEQ ID NO.13所示。

进一步地，所述荧光定量PCR试剂盒还包括适用于高CG序列的高效DNA聚合酶、dNTPs、适用于高GC序列的缓冲液体系及用于校准反应液体积的ROX参比荧光染料。

进一步地，当FAM和VIC双通道都出现明显的扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0时，待测样本为SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点携带者DNA；当VIC通道出现明显的扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0时，待测样本为SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的野生型DNA；当FAM通道出现明显的扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0，待测样本为纯合突变的患者DNA。

本发明的有益效果：本发明的探针引物组和试剂盒可用于快速、准确地体外检测人全血样本中SLC22A5基因NM_003060转录本上的c.1400C>G变异，检测结果用于原发性肉碱缺乏症(primary carnitine deficiency，PCD)的辅助诊断，该变异的致病性明确，且在正常人群中携带率较高(1.55％，6/388)；该反应体系可以使用人基因组DNA溶液作为模板，也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测，省去了DNA提取的过程；该反应体系的探针/引物群经过优化，等位基因之间的扩增效率差异达到最大化，使实验人员可以方便准确的解读结果，不需要进行内参基因的比对或使用delta-delta-Ct法进行计算分析；该反应体系既适用于Ct值的判读，也可以使用终点法进行判读；相较于NGS和其他检测手段，荧光定量PCR的成本低廉，准确性得到公认，适合在临床推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本发明实施例2所述的log对数曲线实验结果；

图2是根据本发明实施例2所述的Linear线性扩增曲线实验结果；

图3是根据本发明实施例3所述的log对数曲线实验结果；

图4是根据本发明实施例3所述的Linear线性扩增曲线实验结果；

图5是根据本发明实施例4所述的log对数曲线实验结果；

图6是根据本发明实施例4所述的Linear线性扩增曲线实验结果；

图7是根据本发明实施例5所述的log对数曲线实验结果；

图8是根据本发明实施例5所述的Linear线性扩增曲线实验结果；

图9是根据本发明实施例6所述的log对数曲线实验结果；

图10是根据本发明实施例6所述的Linear线性扩增曲线实验结果；

图11是根据本发明实施例7所述的终点法进行SNP分型的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，包括针对检测位点设计的探针引物组，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列如表1-2所示：

表1引物序列

表2MGB探针序列

采用上述试剂盒对待测样本进行检测的方法为：

(1)按照表3进行试剂配制；

表3试剂配制

(2)扩增程序如表4所示。

表4扩增程序

实施例2

采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用野生型DNA作为模板时，检测结果如表5所示：

表5野生型DNA检测结果

其中，样本235、237和611为野生型人基因组DNA，3/2-BLANK为使用纯化水的空白对照。阈值线设置为0.1。由表5可知，VIC信号的平均Ct值为24.07，标准差为0.3106；而FAM信号的平均Ct值为30.34，标准差为1.0510；log对数曲线实验结果如图1所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图2所示，linear曲线中几乎观测不到FAM通道的扩增曲线。

实施例3

采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用杂合型DNA作为模板时，检测结果如表6所示：

表6杂合型DNA检测结果

其中，样本SLC22A5-1-1、SLC22A5-2-2和SLC22A5-3-2均为变异位点NM_003060.3:exon8:c.1400C>G的杂合型人基因组DNA，SLC22A5-BLANK为使用纯化水的空白对照。阈值线设置为0.1。由表6可知，VIC信号的平均Ct值为25.19，标准差为0.0656；而FAM信号的平均Ct值为24.65，标准差为0.0451；log对数曲线实验结果如图3所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图4所示。

实施例4

采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当PCD患者的纯合突变DNA作为模板时，检测结果如表7所示：

表7纯合突变DNA检测结果

其中，样本Homozygous-DNA-1至Homozygous-DNA-6为人工合成的SLC22A5基因片段，并且带有纯合突变的NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点；BLANK-1、BLANK-2和BLANK-3为使用纯化水为模板的空白对照。阈值线设置为0.1。由表7可知，VIC信号的平均Ct值为30.51，标准差为0.2828；而FAM信号的平均Ct值为26.26，标准差为01700。log对数曲线实验结果如图5所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图6所示。

实施例5

采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用正常人的野生型全血(EDTA抗凝)时，检测结果如表8所示：

表8野生型全血检测结果

其中，样本whole blood-1至whole blood-6为正常人的全血样本，tap water-1至tap water-6为使用纯化水的空白对照。阈值线设置为0.1。由表8可知，VIC信号的平均Ct值为33.54，标准差为0.1854；而FAM信号的平均Ct值为36.81，标准差为0.3863；空白对照均无Ct值。log对数曲线实验结果如图7所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图8所示。

实施例6

采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用携带者的杂合型全血(EDTA抗凝)时，检测结果如表9所示：

表9杂合型全血检测结果

其中，样本SLC22A5-1-1、SLC22A5-2-2和SLC22A5-3-2为携带者的全血样本。阈值线设置为0.1。由表9可知，VIC信号的平均Ct值为28.78，标准差为0.0393；而FAM信号的平均Ct值为28.48，标准差为0.0351。log对数曲线实验结果如图9所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图10所示。

实施例7

采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用终点法进行SNP分型时，结果如表10和图11所示。

表10SNP分型结果

其中，样本Homozygous-DNA-1至Homozygous-DNA-5为人工合成的SLC22A5基因片段，并且带有纯合突变的NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点；235-3/2、237-3/2和611-3/2为野生型的人基因组DNA；SLC22A5-1-1、SLC22A5-2-2和SLC22A5-3-2为携带者的杂合型人基因组DNA；BLANK-1、BLANK-2、BLANK-3和BLANK-4为使用纯化水为模板的空白对照。阈值线设置为自动。由表10可知，根据终点法判定的SNP和样本基因型完全一致，符合率为100％。

综上所述，使用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点携带者DNA作为模板时，可以观察到FAM和VIC双通道都出现了明显的扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0；当使用SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的野生型DNA作为模板时，可以观察到VIC通道出现明显的扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0；纯合突变的患者DNA作为模板时，可以观察到FAM通道出现明显的扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0；该反应体系既适用于Ct值的判读，也可以使用终点法进行判读；相较于NGS和其他检测手段，荧光定量PCR的成本低廉，准确性得到公认，适合在临床推广。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

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<120> 一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA