一种穿破石标准汤剂质量控制方法

技术领域

本发明涉及中药材质量控制技术领域，尤其涉及一种穿破石标准汤剂质量控制方法。

背景技术

穿破石为构棘的新鲜或干燥根。全年均可采挖，削去支根，洗净，鲜用或切断、切片晒干。据《现代中药学大辞典》记载穿破石，又名奴柘《本草拾遗》，柘根《备急千金要方》，川破石(《生草药性备要》)，地棉根、拉牛入石(《岭南菜药录》)，葨芝(湖南)。为桑科植物柘树或构棘的根。穿破石之名始见于《岭南菜药录》。《本草拾遗》载有“奴柘”，谓：“生江南山野。似柘，节有刺，冬不调。”《本草纲目》载：“此树似柘而小，有刺。叶亦如柞叶而小，可饲蚕”以上记载与构棘相符。《本草纲目》又载“柘”，云：“处处山中有之，喜丛生，干疏而直。叶丰而厚，团而有尖。”构棘、九层皮、假荔枝、猴欢喜、山荔枝，黄金刺、鸟不踏、老鼠刺、饭团竻、野梅子。全年均可采挖，削去支根，洗净，鲜用或切断、切片晒干。

穿破石药材的化学成分为黄酮类、酚类、有机酸等，并在穿破石中检测出花旗松素、槲皮素、山奈酚等成分，具有健脾益胃、舒筋活络、祛风湿、去瘀血；治腰痛、关节痛，虚劳黄肿，脾虚泄泻等功效。目前，穿破石药材尚未建立相关标准。现有技术仅涉及穿破石药材性状的检查，针对性不强，使用这些方法难以达到真正控制药材质量的目的。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种穿破石标准汤剂质量控制方法，目的是便于有效的评价和控制穿破石药材的内在质量。

基于上述目的，本发明提供了一种穿破石标准汤剂质量控制方法，所述质量控制方法是通过对穿破石标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及花旗松素含量测定，拟定标准汤剂的花旗松素含量范围在5.0-83.0mg/g；其中，干浸膏出膏率采用煎煮法测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及花旗松素含量测定均采用液相色谱法测定。

所述干浸膏出膏率的限定范围为4.0-7.5％。

所述照薄层色谱法包括如下步骤：

A1、取穿破石汤剂经加甲醇超声处理、过滤、滤液蒸干、残渣加甲醇溶解，得供试品溶液a；

A2、取穿破石对照药材经煎煮、过滤、滤液蒸干、残渣加甲醇溶解得对照药材溶液a；

A3、设置薄层色谱条件：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a为5ul，对照药材溶液a为10ul；展开剂：二氯甲烷、乙酸乙酯及甲醇以体积比12:5:2混合得到；置于紫外光灯下检视。

所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法中的热浸法测定浸出物不得少于46.5％。

所述特征图谱及花旗松素含量测定采用液相色谱法测定的方法包括分别吸取穿破石对照品溶液b及供试品溶液b注入液相色谱仪，测定即得；其中，采用的色谱条件：色谱柱：C18；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：290nm。

所述供试品溶液b的制备方法是取穿破石标准汤剂样品，加入25倍量的70％甲醇，密塞，之后经超声、放冷、称定重量、用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

所述特征图谱采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次的供试品注入液相色谱仪，测定，并对制定的共有特征峰进行相似度的评价。

所述特征图谱及花旗松素含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次供试品分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样，测定峰形、峰数，并对共有特征峰进行相似度评价，用于测试供试品溶液的稳定性。

所述特征图谱及花旗松素含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括对同批次供试品连续进样6针测定峰形、峰数，并对共有特征峰进行相似度评价，用于测试色谱仪的精密度是否良好。

所述花旗松素含量测定采用液相色谱法测定的方法还包括称取供试品加入花旗松素对照品溶液进行测试花旗松素平均加样回收率的步骤。

本发明的有益效果：

1、本发明通过对穿破石标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及花旗松素含量测定进行了研究，能够有效控制穿破石标准汤剂的质量。

2、穿破石经超声提取制得的穿破石标准汤剂，花旗松素平均含量为29.08mg/g，测得含量范围为4.97～54.18mg/g，SD为18.01；按均值±3SD计算，花旗松素含量允许范围为-24.95～83.11mg/g。因-3SD为负值，故以实测值的最低值4.97为下限。故拟定本标准汤剂的的花旗松素总含量范围为：5.0～83.0mg/g。结果表明，穿破石标准汤剂中花旗松素总含量及其转移率均在允许范围之内，可为穿破石(构棘)配方颗粒质量研究提供参考依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明本发明15批次标准汤剂TLC图谱；其中，A、阴性对照；S、对照药材；1-15、供试品；

图2为不同提取方法对比图；

图3为不同提取时间对比图；

图4为不同提取溶剂对比图；

图5为不同溶剂用量对比图；

图6为空白溶剂对比图；

图7为重复性试验共有峰叠加特征图谱；

图8为精密度试验共有峰叠加特征图谱；

图9为稳定性试验共有峰叠加特征图谱；

图10为花旗松素对照品图谱；

图11为穿破石对照药材图谱；

图12为花旗松素线性考察图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。

本发明提供了一种穿破石标准汤剂质量控制方法，该质量控制方法是通过对穿破石标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及花旗松素含量测定，拟定标准汤剂的花旗松素含量范围在5.0-83.0mg/g；其中，干浸膏出膏率采用煎煮法测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及花旗松素含量测定均采用液相色谱法测定。下面通过具体的实例进行说明。

制法：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)，固定前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等相关参数进行煎煮，再进行固液分离、浓缩干燥。

出膏率的测定

取15批次穿破石(构棘)饮片，按以上制法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见下表1)，并计算平均得率为5.68％，按照标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为3.976％～7.384％，拟定穿破石(构棘)饮片标准汤剂出膏率允许范围为4.0％～7.5％。

表1穿破石(构棘)饮片标准汤剂出膏率

上述结果表明，15批次标准汤剂出膏率为4.6％～7.3％，均符合拟定限度范围4.0％～7.5％。

性状：根据15批次标准汤剂的实物性状特征，描述为淡黄色至土黄色粉末；气微，味淡。

薄层鉴别：本发明的产品为单味饮片穿破石(构棘)的干燥提取物，参考查阅文献穿破石薄层鉴别方法，用穿破石(构棘)对照药材作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：

试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验

供试品溶液制备：取本品约1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。

对照药材溶液：取穿破石(构棘)对照药材5g，加水50ml，煮沸30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液。

薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取供试品溶液5ul，对照药材溶液10μl；展开剂：二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(12:5:2)；检视：置紫外光灯(365nm)下检视。

结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。15批次标准汤剂TLC图谱如图1所示。

浸出物测定：取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果见下表2。

表2浸出物测定结果

上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为66.41％，参考标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于46.5％。15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。

特征图谱的测试

测定波长的确定：参考查阅文献确定检测波长为290nm。

试验方法

色谱条件：色谱柱：C18(250mmx4.6mm，5um)(Shim-pack GIST)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表3中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃，检测波长：290nm。

表3

参照物溶液的制备：取穿破石(构棘)对照药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取花旗松素对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含70ug的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取穿破石(构棘)标准汤剂样品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

方法学考察

提取方法的考察：分别以不同的提取方法(超声、回流)制备供试品溶液，按上述特征图谱测试中的试验方法进行测定。结果表明，两种提取方式提取主峰个数一致，峰形和分离度均符合规定，(如图2)，故选择样品提取方式为简单、方便的超声处理30分钟。

提取时间考察：分别以不同超声时间(30分钟、45分钟、60分钟)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，不同提取时间提取主峰个数一致，峰形和分离度均符合规定(如图3)，故确定以提取时间较短的超声30分钟为提取时间。

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂(甲醇、70％甲醇、70％乙醇)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，不同提取溶剂提取主峰个数一致，但70％甲醇峰形和分离度更好(如图4)，故确定以70％甲醇为提取溶剂。

样品取样量考察：分别以不同溶剂用量(15ml、25ml、50ml)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，不同溶剂用量提取主峰个数一致，峰形和分离度均符合规定，但溶剂用量为25ml时，样品含量值最大(如图5)，确定溶剂用量为25ml。

综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取穿破石(构棘)标准汤剂样品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

特征图谱分析方法验证

专属性考察：取供试品用溶剂70％甲醇醇10ul，按以上特征图谱测试中的色谱条件进行测定。试验表明：空白溶剂无干扰(如图6所示)。

重复性试验：取同批样品约0.1g，共6份，按特征图谱测试中的方法进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有4个共有峰，采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度平价，相对保留时间RSD小于3％及相对峰面积RSD小于5％(见下表4和表5)，表明该方法重现性良好。

表4重复性试验特征图谱相对保留时间

表5重复性试验特征图谱相对峰面积

精密度试验：取同批样品约0.1g，按上述特征图谱测试中的试验方法，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度平价,相对保留时间RSD小于3％及相对峰面积RSD小于5％(见下表6和表7)，表明该仪器精密度良好。

表6精密度试验特征图谱相对保留时间

表7精密度试验特征图谱相对峰面积

稳定性试验：取一批样品约0.1g，按上述特征图谱测试中的试验方法，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样测定，峰形、峰数基本稳定，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价,相对保留时间RSD小于3％及相对峰面积RSD小于5％(见下表8和表9)，表明供试品溶液在24小时内较稳定。稳定性试验共有峰叠加特征图谱如图7所示。

表8稳定性试验特征图谱相对保留时间

表9稳定性试验特征图谱相对峰面积

标准汤剂特征图谱表征分析

标准汤剂特征图谱测定

照上述拟定的特征图谱分析方法，测定15批穿破石(构棘)标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有4个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，其中与花旗松素对照品参照物相对应的峰为峰3，共有峰特征图谱(如图8)。

特征色谱图相似度评价：采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的4个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批穿破石(构棘)饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤剂质量相对稳定。以花旗松素参照物峰相对应的峰(3)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围见下表10。

表10 15批标准汤剂共有峰相对保留时间

综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，且符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批标准汤剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了4个共有特征峰，其中峰3为花旗松素。以花旗松素参照物相对应的峰为S峰，计算另3个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.46(峰1)、0.78(峰2)、1.47(峰4)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。

含量测定：穿破石药材的化学成分为黄酮类、酚类、有机酸等，并在穿破石中检测出花旗松素、槲皮素、山奈酚等成分。具有健脾益胃、舒筋活络、祛风湿、去瘀血；治腰痛、关节痛，虚劳黄肿，脾虚泄泻等功效。此外，穿破石中所含的有效成分花旗松素还有一定的抗宫颈癌、抗肺癌及心肌缺血再灌注损伤保护作用。故在此以花旗松素作为穿破石(构棘)标准汤剂的含量指标成份。

试验方法

色谱条件：色谱柱：C18(250mmx4.6mm，5um)(Shim-pack GIST)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃，检测波长：290nm。

对照品溶液的制备：精密称取花旗松素适量，加70％甲醇制成每1ml含70μg的对照品溶液，过滤，即得。

供试品溶液的制备：取穿破石(构棘)标准汤剂样品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

方法学考察

提取方法的考察：分别以不同的提取方法(超声、回流)制备供试品溶液，按上述标准汤剂特征图谱测定中试验方法进行测定。结果表明，样品回流30分钟与超声(功率250W,频率25KHZ)30分钟花旗松素含量差异性大，RSD为3.16％，故选择提取方式为超声30分钟。

表11不同提取方法对比

提取时间的考察：分别以不同的提取时间(30分钟、45分钟、60分钟)制备供试品溶液，按上述9.1试验方法进行测定。结果表明，样品超声30分钟与超声45分钟及超声60分钟花旗松素含量差异性不大，且RSD为1.35％。(见下表12)，故选择样品处理时间为超声处理30分钟。

表12不同提取时间对比

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂(甲醇、70％甲醇、70％乙醇)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，不同的提取溶剂花旗松素含量无明显差别，且提取溶剂为70％甲醇时花旗松素含量最高(见下表)，故确定70％甲醇为提取溶剂。

表13不同提取溶剂对比

溶剂用量的考察：分别以不同溶剂用量(15ml,25ml,50ml)制备供试品溶液，按上述试验方法进行测定。结果表明，溶剂用量为25ml时花旗松素含量最高，故确定溶剂用量为25ml。

表14不同溶剂用量对比

含量测定方法学验证

重复性试验：取同批次标准汤剂样品约0.1g，共6份，按上述试验方法进行测定，测得样品中含量平均值分别为23.6616mg/g，RSD值为0.40％，试验表明该方法重现性良好(见下表15)。

表15重复性试验

精密度试验：取标准汤剂特征图谱测定中采用的供试品溶液，连续进样6针，照上述上述试验方法测定其峰面积，计算样品中峰面积的RSD值为0.21％，表明仪器精密度良好(见下表16)。

表16精密度试验

稳定性试验：取一批汤剂样品约0.1g，按上述标准汤剂特征图谱测定中试验方法，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的RSD值为0.70％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(见下表17)。

表17稳定性试验

线性范围试验：取花旗松素对照品溶液(浓度为0.27593mg/ml)，量取5ml至10ml容量瓶，浓度0.13796mg/ml；同法，倍半稀释，浓度：0.06898mg/ml；0.03449mg/ml；0.01724mg/ml；0.00862mg/ml。按标准汤剂特征图谱测定中色谱条件进行测定。以花旗松素峰面积纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，花旗松素线性方程为：y＝35,859,910.7468x+27,041.3807,R2＝0.9999，可见花旗松素在0.00862mg～0.27593mg，范围内与其峰面积具有良好的线性关系(见下表18与图12)。

表18花旗松素线性考察结果

加样回收率试验：精密称取样品(花旗松素含量为23.6616mg/g)约0.05g共6份，各加入已知浓度的花旗松素对照品溶液(0.91977mg/ml)1ml，按标准汤剂特征图谱测定中方法制备供试品溶液，并按标准汤剂特征图谱测定中色谱条件进行测定，计算花旗松素平均加样回收率为96.29％，RSD为1.42％。

表19加样回收率试验结果

标准汤剂及中药材含量测定：穿破石(构棘)药材经产地初加工成段片，经净制后加工成穿破石(构棘)饮片，净制过程中未经水洗、烘烤，至通过筛选，其花旗松素含量不会发生变化；因此穿破石(构棘)饮片特征色谱图及花旗松素含量参考其药材数据。

照上述拟定的含量分析方法，测定15批穿破石(构棘)标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片花旗松素含量，结果见(下表20)。

表20 15批穿破石(构棘)中药材及饮片花旗松素测定结果

15批穿破石(构棘)标准汤剂花旗松素测定结果

含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备用中药饮片测定结果，计算花旗松素含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。穿破石(构棘)饮片标准汤剂由穿破石(构棘)饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其花旗松素含量转移率(见下表21)。

表21 15批穿破石(构棘)标准汤剂花旗松素含量转移率

由以上数据可知，穿破石(构棘)饮片依方案煎煮制得穿破石(构棘)标准汤剂，本品花旗松素平均转移率为23.73％，测得转移率范围为13.32％～38.68％，SD为8.01。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，花旗松素含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为16.61～30.85％；按照-2SD，+3SD来算，为7.71～47.76％。结果表明，15批次标准汤剂中花旗松素转移率均在-2SD，+3SD允许范围之内。

本品花旗松素平均含量为29.08mg/g，测得含量范围为4.97～54.18mg/g，SD为18.01；按均值±3SD计算，花旗松素含量允许范围为-24.95～83.11mg/g。因-3SD为负值，故以实测值的最低值4.97为下限。故拟定本标准汤剂的的花旗松素总含量范围为：5.0～83.0mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中花旗松素总含量及其转移率均在允许范围之内，可为穿破石(构棘)配方颗粒质量研究提供参考依据。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。